基于慢病毒轉導質粒的hbv小鼠模型的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于慢病毒轉導質粒建立的HBV小鼠模型，旨在提供一種建立小鼠HBV持續(xù)性感染模型的方法。所屬領域為生物技術。其技術特征在于將攜帶多拷貝HBV?DNA的重組質粒pCS-HBV1.3經尾靜脈高壓水動力注射到小鼠體內感染小鼠肝組織細胞，所使用的小鼠為免疫功能正常的6周齡雌性C57BL／6小鼠。以該方法建立HBV持續(xù)性感染模型操作簡單，可模擬人類HBV感染過程，為HBV感染研究提供很好的工具。
【專利說明】基于慢病毒轉導質粒的HBV小鼠模型
[0001]【技術領域】本發(fā)明屬于生物技術發(fā)明領域，特別是涉及一種基于慢病毒載體系統(tǒng)轉導質粒pCS-HBVl.3建立HBV持續(xù)性感染的小鼠模型。
[0002]【背景技術】乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)屬嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae),其感染已成為全球面臨的嚴重公共健康問題之一,全球約20億人曾感染過HBV，其中3.5億人為慢性HBV感染者，每年約有100萬人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細胞癌(HCC);我國屬HBV高流行國家，HBV攜帶者約有9300萬，慢性肝炎患者達3000萬，每年有近30萬人死于肝硬化或肝癌，因而也是我國亟需解決的重大問題。
[0003]HBV具有嚴格的宿主特異性和嗜肝性，只感染人和少數靈長類動物，極大地限制了人們對HBV生物學特性、發(fā)病機制及藥物和疫苗的開發(fā)和評價等方面的研究。目前建立的HBV感染動物模型主要有鴨乙肝模型、土撥鼠乙肝模型、HBV感染黑猩猩、HBV轉基因小鼠以及人鼠嵌合肝臟小鼠模型等。鴨乙肝病毒(DHBV)和土撥鼠乙肝病毒(WHV)基因組有別于人類HBV，黑猩猩由于費用和倫理方面的原因受到限制；而轉基因小鼠的獲得需要昂貴的顯微注射設備和復雜的操作，非常耗時費力，且免疫系統(tǒng)對HBV先天耐受；人鼠嵌合肝臟小鼠模型雖可完整的呈現HBV復制周期，但其也存在制備困難、技術條件要求較高、難以大規(guī)模制備以及免疫系統(tǒng)抑制等問題，因而有必要建立一種方便、實用、快速的小動物動物模型。
[0004]基于HBV可復制性克隆轉染免疫功能正常的成體小鼠建立的HBV急、慢性感染模型為HBV相關研究提供了良好的工具。Yang等(Yang PL, Althage A, Chung J，etal.Hydrodynamic injection o`f viral DNA:a mouse model of acute hepatitis B virusinfection.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99 (21): 13825-13830)采用高壓水動力注射的方法，將大約1.6ml的含1.3拷貝HBV基因組的DNA溶液在短時間內(5_8s)快速注入到小鼠體內建立了 HBV急性感染模型，該方法可使小鼠產生高滴度的病毒(107cOpy / ml血液)，但一周后由于特異性抗病毒抗體和CD8+T細胞的出現HBV從血液中得以清除，而在(NOD) / SCID小鼠中病毒可持續(xù)存在81天。而Huang LR等(Huang LR，ffu HL，ChenPJ，et al.An immunocompetent mouse model for the tolerance of human chronichepatitis B virus infection.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103(47):17862-17867.)將pAAV-HBVl.2質粒與將HBV基因組克隆到克隆載體pGEM4Z的質粒同時注射C57BL / 6小鼠，前者在注射后25天仍可檢測到HBsAg的表達，28天之內檢測不到抗HBs抗體的產生；而后者僅產生瞬時的抗原血癥，且28天之內產生抗HBs抗體可見轉基因載體結構是影響HBV基因在小鼠體內表達的一個重要因素，。另外國內學者(郭燕菊，王文，孫世惠，等.免疫抑制劑地塞米松可明顯延長乙型肝炎病毒抗原在水動力法轉染HBV小鼠模型中的表達[J].病毒學報，2010，26 (1):20-26.)等將含有1.3拷貝HBV基因組的HBV表達質粒經高壓水動力法尾靜脈注射C57BL / 6小鼠，在注射后30天血清HBsAg和HBeAg即轉為陰性，且血清和肝組織中病毒載量下降。
[0005]慢病毒載體(Lentiviral vector, LVs)是在人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)基礎上改造而成的，能利用逆轉錄酶和整合酶，將自身的RNA轉變?yōu)镈NA整合到宿主細胞的染色體中，從而使目的基因在宿主細胞中長期而穩(wěn)定的表達。慢病毒載體系統(tǒng)主要由三種包含不同結構的質粒構成，分別是轉移質粒、輔助質粒和包膜表達質粒。轉移質粒除可插入感興趣的外源基因，還保留了病毒的LTR區(qū)和其他對病毒的整合和復制起重要作用的原件；其中LTR區(qū)包含了慢病毒的啟動子、增強子、包裝信號、整合位點；整合位點可使病毒基因整合到宿主基因，使得外源基因得以長期穩(wěn)定的表達。
[0006]高壓水動力尾靜脈注射(ZhangG,Budker V,Wolff JA.High levels of foreigngene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA.Hum Gene Then 1999，10 (10): 1735-1737)是可使外源基因在肝內表達的一種技術方法，利用該方法建立的小鼠HBV急慢性感染模型，為研究HBV復制和基因表達、肝癌致病機理及抗病毒藥物篩選及疫苗研究等提供了一個良好的工具。但目前難以獲得HBV持續(xù)性感染模型，因而本研究和發(fā)明利用慢病毒載體系統(tǒng)的轉基因載體結構，構建攜1.3倍HBV基因組的轉基因載體pCS-HBVl.3，經高壓水動力尾靜脈注射的方法注入到小鼠體內，使其能夠穩(wěn)定高效長期表達HBV基因。

【發(fā)明內容】
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[0007]針對現有技術的不足，本發(fā)明提供了一種基于慢病毒轉基因載體攜帶1.3倍HBV基因組的重組質粒pCS-HBVl.3，以及利用該質粒采用高壓尾靜脈注射技術建立HBV感染模型的方法；利用本發(fā)明的方法建立的HBV急、慢性感染模型有助于HBV生物學特性、發(fā)病機制及藥物的開發(fā)和評價等方面的研究。
[0008]本發(fā)明利用轉基因載體pCS-HBVl.3制備HBV小鼠急、慢性感染模型的制備方法，具體步驟如下:
[0009](1)載體構建:本發(fā)明以pAAV / HBV1.3質粒為模板，通過PCR的方法獲得1.3拷貝的HBV基因組(ayw亞型，GenBank:AB267090.1，D基因型)DNA片段；然后將此DNA片段插入到pCS-CG質粒的多克隆位點，并去除了原質粒上的EGFP表達盒，獲得了攜帶1.3拷貝HBV基因組DNA的重組質粒pCS-HBVl.3，經酶切、測序鑒定正確；
[0010](2)采用高壓水動力的方法將含有1.3拷貝HBV DNA的重組載體通過尾靜脈注入至丨J小鼠體內，建立HBV感染的小鼠模型；
[0011](3)模型鑒定。
[0012]上述1.3拷貝的HBV DNA重組表達載體經PCR擴增得到HBV基因組的第1個片段(1066-3182bp)，經Pst 1、EcoR I雙酶切后連接到同樣雙酶切的pCS_CG載體，構建重組質粒pCS-HBVl質粒；之后PCR擴增HBV基因組的第二個片段(0_1582bp)，經EcoR 1、ΚρηΙ雙酶切后連接到同樣酶切的pCS-HBVl的質粒上，獲得了含1.3倍HBV基因組的重組質粒pCS-HBVl.3。
[0013]一種含1.3倍基因組的基于慢病毒載體系統(tǒng)的乙肝成體轉基因小鼠模型，它是將
1.3倍的HBV重組質粒pCS-HBVl.3利用高壓水動力的方法經尾靜脈注入到小鼠體內，所述動物是小鼠，高壓水動力尾靜脈注射法是本發(fā)明所用的關鍵技術。
[0014]本發(fā)明采用常規(guī)的高壓水動力注射的方法，注射前先將小鼠于白熾燈泡下照射10-15min,使其尾靜脈擴張；注射質粒量為5 μ g，液體為0.9% NaCl溶液。利用該方法在注射后24h即可建立HBV感染模型，其抗原表達可持續(xù)存在16周，可獲得HBV持續(xù)性感染的模型。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1HBV轉基因載體構結構示意圖
[0016]為HBV轉基因載體構pCS-HBV1.3結構示意圖。載體骨架為慢病毒載體系統(tǒng)的轉移質粒pCS-CG，將1.3倍HBV基因組插入取代其中的EGFP表達盒。
[0017]圖2pCS-HBVl.3 與 pAAV / HBV1.3 轉染細胞上清 HBsAg、HBeAg 的檢測
[0018]體外培養(yǎng)的Huh7細胞，分別用質粒pCS-HBVl.3和pAAV / HBV1.3轉染細胞后，檢測培養(yǎng)細胞上清中HBsAg和HBeAg的表達水平。圖中可見，兩種質粒轉染細胞后48h，上清中HBsAg和HBeAg的表達均為陽性，但兩種質粒轉染后上清中HBsAg和HBeAg的表達無顯著差異。
[0019]圖3雌性C57BL / 6小鼠注射pCS_HBVl.3質粒建立HBV小鼠模型指標檢測
[0020]為雌性C57BL / 6小鼠經尾靜脈注射5 μ g pCS-HBVl.3后各時間點檢測HBV各種指標的動態(tài)變化。結果顯示，注射后Id后即可在血清中檢測到HBsAg、HBeAg和HBV DNA,并且在注射后1周可在血清中檢測到ant1-HBc產生以及肝組織HBV DNA的存在，上述指標均持續(xù)到8周均為陽性；而在此期間均未檢測到ant1-HBs的產生。參見實施例2。[0021 ] 圖4雌性C57BL / 6小鼠注射pAAV_HBVl.3質粒建立HBV小鼠模型指標檢測
[0022]為雌性C57BL / 6小鼠經尾靜脈注射5 μ g pAAV / HBV1.3后各時間點檢測HBV各種指標的動態(tài)變化。結果顯示，注射后Id后即可在血清中檢測到HBsAg、HBeAg和HBVDNA,但在4周內全部轉為陰性，同時檢測到ant1-HBs產生；在注射后1周可在血清中檢測到ant1-HBc產生以及肝組織HBV DNA的存在，注射后8周仍為陽性。參見實施例3。
[0023]圖5雌性C57BL / 6小鼠分別注射pCS_HBVl.3和pAAV_HBVl.3質粒后血清及肝組織DNA檢測
[0024]為雌性C57BL / 6小鼠經尾靜脈分別注射5 μ g pCS-HBVl.3和pAAV_HBVl.3質粒后各時間點檢測血清及肝組織DNA變化。結果顯示，pCS-HBVl.3質粒注射小鼠血清HBV DNA陽性持續(xù)時間顯著長于pAAV-HBVl.3質粒注射小鼠；而上述兩質粒注射小鼠肝組織DNA在注射后56天持續(xù)陽性，二者之間無差別。
[0025]圖6雌性C57BL / 6小鼠分別注射pCS_HBVL 3和pAAV_HBVL 3質粒后肝組織免疫組化分析結果
[0026]為為雌性C57BL / 6小鼠經尾靜脈分別注射5 μ g pCS-HBVl.3和pAAV-HBVl.3質粒后5d經免疫組化檢測肝組織HBeAg的表達?？梢娚鲜鰞煞N質粒注射小鼠肝組織均可檢測到HBeAg的表達。A為pCS-HBVl.3質粒注射小鼠結果，B為pAAV-HBVl.3質粒注射小鼠結果，C為注射NS小鼠的免疫組化結果。
[0027]圖7雌性BALB / c小鼠注射pCS_HBVl.3質粒建立HBV小鼠模型指標檢測
[0028]為雌性BALB / c小鼠經尾靜脈注射5 μ g pCS-HBVl.3后各時間點檢測HBV各種指標的動態(tài)變化。結果顯示，注射后Id后即可在血清中檢測到HBsAg、HBeAg和HBV DNA,但在注射后2周內全部轉為陰性，并且血清中可檢測到ant1-HBs ;在注射后1周可在血清中檢測到ant1-HBc產生以及肝組織HBV DNA的存在。參見實施例4。
[0029]圖8雄性C57BL / 6小鼠注射pCS_HBVl.3質粒建立HBV小鼠模型指標檢測[0030]為雄性的C57BL / 6小鼠經尾靜脈注射5Bg pCS_HBVl.3后各時間點檢測HBV各種指標的動態(tài)變化。結果顯示，注射后Id后即可在血清中檢測到HBsAg、HBeAg和HBV DNA，并在注射后4周轉為陰性，并伴隨ant1-HBs產生；在注射后1周可在血清中檢測到ant1-HBc產生以及肝組織HBV DNA的存在，并在注射后8周均為陽性。參見實施例5。
[0031 ] 圖9HI小鼠免疫計劃參見實施例7
[0032]圖10HI小鼠免疫后抗體及細胞免疫應答檢測
[0033]為HI小鼠接受HBSS1聯合Alum和Poly I:C佐劑初免和加強免疫后的體液和細胞免疫應答檢測結果。結果顯示，加強免疫后針對于HBV S和PreSl抗體均顯著增加，細胞免疫應答亦有所增強。A ant1-S檢測結果B ant1-Presl檢測結果C S肽庫刺激的ELISpot結果
[0034]圖11HI小鼠免疫后HBV DNA、HBsAg及HBeAg動態(tài)變化檢測
[0035]為HI小鼠免疫后HBV HBV DNA、HBsAg及HBeAg動態(tài)變化的結果，可見HBSS1兩針免疫后，血清HBV DNA完全清除，但肝組織DNA無明顯變化；HBSS1聯合Alum和Poly I:C佐劑免疫兩次后血清HBsAg和HBeAg和對照組相比顯著降低。
【具體實施方式】:
[0036]以下通過實施例進一步說明本發(fā)明。
[0037]實施例1重組質粒pCS-HBVl.3的建立
[0038]材料及來源:
[0039]含1.3倍乙型肝炎病毒全基因(ayw亞型，GenBank:AB267090.1)的質粒pAAV-HBVl.3由本室前期構建(郭燕菊，王文，孫世惠，等.免疫抑制劑地塞米松可明顯延長乙型肝炎病毒抗原在水動力法轉染HBV小鼠模型中的表達[J].病毒學報，2010，26(1):20-26.)；
[0040]質粒pCS-CG 來源于 D r.Chow SA(UCLA AIDS Institute),由本室保存。
[0041]質粒小提試劑盒，PCR產物回收試劑盒，DNA膠回收試劑盒、片段回收試劑盒及病毒基因組提取試劑盒購 自天根生化科技有限公司。質粒大提提取試劑盒購自Qiagen公司。
[0042]pCS-HBVl.3質粒構建方法:
[0043]首先以pAAV-HBVl.3質粒為模板，設計特異性引物擴增HBV基因組第一個(1066-3182bp)，引物如下:上游:ACGCTGCAGATGCATGTATTCAATCTAAG(Pst I)，下游:ATAGAATTCCACCACTGCATGGCCTGAGGAT (EcoR I) ；PCR擴增后瓊脂糖凝膠電泳回收2116bp片段，經Pst I,EcoR I雙酶切后經與同樣上述兩種酶雙酶切的pCS-CG質粒連接轉化DH10B感受態(tài)細胞；篩選含2116bp HBV基因組的陽性克隆pCS-HBVl，經Pst 1、EcoR I酶切及序列測序鑒定。
[0044]其次以pAAV-HBVl.3質粒為模板，設計特異性引物擴增HBV基因組第二個片段(0-1582bp)，引物如下:上游:CGCGAATTCCACAACCTTTCACCAAACTC(EcoR I);下游:ATAGGTACCAGATCTCGTACTGAAGGAAAG (Kpn I) ;PCR擴增后瓊脂糖凝膠電泳回收2116bp片段，PCR擴增后瓊脂糖凝膠電泳回收1582bp片段，經EcoR 1、Kpn I雙酶切后經與同樣上述兩種酶雙酶切的pCS-HBVl質粒連接轉化DH10B感受態(tài)細胞；篩選含1.3倍HBV基因組的陽性克隆pCS-HBVl.3，經Pst 1、Kpn I酶切及序列測序鑒定。構建的重組質粒pCS-HBVl.3結構示意圖見圖1。
[0045]實施例2重組質粒pCS-HBVl.3和pAAV-HBVl.3體外細胞轉染實驗材料及來源:
[0046]培養(yǎng)細胞株Huh7為肝來源的細胞，細胞培養(yǎng)液為含10% FBS的DMEM。
[0047]轉染試劑FuGENE HD購自Roche公司。
[0048]HBV HBsAg、HBeAg ELISA檢測試劑盒購自上?？迫A生物公司。
[0049]轉染方法:
[0050]接種5X 105Huh7細胞于六孔板，次日轉染前換成opt1-MEM培養(yǎng)基，每孔2ml，100ulopt1-MEM加2 μ g質粒后混勻，再加入6 μ 1 FuGENE HD轉染試劑，輕輕混勻后室溫放置15min后逐滴加入到六孔板中，6h后換為含2 % FBS的DMEM后繼續(xù)培養(yǎng)，轉染后48h收獲上清100 μ 1ELISA方法測定HBsAg和HBeAg的表達和分泌水平。血清HBsAg結果判定為S / C0V>1為陽性，進一步用羅氏新型乙肝表面抗原(HBsAg)定量檢測試劑檢測，將檢測到的 S / C0V 值轉換為 cut-off index (C0I)，以 C0I ≥ 1 為陽性。HBeAg、HBsAb 及 HBcAb 的判定標準為0D450大于2.1倍陰性對照0D450的平均值判斷為陽性。
[0051]結果顯示重組質粒pCS-HBVl.3和pAAV-HBVl.3體外轉染Huh7細胞后48h，均可檢測到HBsAg和HBeAg的表達，且二者表達水平無顯著差別。具體結果參見圖2。
[0052]實施例3
[0053]比較兩種HBV轉基因載體pCS-HBVl.3與pAAV-HBVl.3建立HBV成體小鼠模型
[0054]實驗如下:
[0055]材料及來源:
[0056]動物SPF級C57BL / 6小鼠，4-6周齡，雌性，體重18_22g，由中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所，飼養(yǎng)于中國疾病預防控制中心二級動物房。飼養(yǎng)條件按照SPF級動物標準執(zhí)行。
[0057]試劑:經QIAGEN公司質粒大量提取純化試劑盒純化的質粒pCS_HBVl.3及pAAV-HBVl.3 ;生理鹽水(0.9%的 NaCl 溶液)。
[0058]儀器:lml、2ml及5ml注射器。
[0059]方法
[0060]高壓水動力尾靜脈注射:雌性SPF級C57BL / 6小鼠分成兩組，每組6只，分別經高壓水動力尾靜脈注射5 μ g質粒pCS-HBVl.3及pAAV-HBVl.3。具體操作如下:先將小鼠置于30瓦白熾燈泡下照射，使小鼠尾靜脈擴張；注射前再將尾靜脈浸于37°C左右的溫水中進一步擴張尾靜脈；5-8秒內將1.5-2.5ml (相當于小鼠體重的8% -10%體積)的質粒溶液勻速注射到小鼠體內，注射后室溫條件下觀察小鼠反應；
[0061]HBV指標檢測:
[0062]1.各組小鼠注射后l、3、5、7、10、14d之后相繼隔周，乙醚麻醉后內眥靜脈取血，分離血清，以PBS1:10稀釋后用ELISA檢測試劑盒(上?？迫A)檢測血清中HBsAg、HBeAg、HBsAb及HBcAb水平。血清HBsAg結果判定為S / C0V>1為陽性，進一步用羅氏新型乙肝表面抗原(HBsAg)定量檢測試劑檢測，將檢測到的S / C0V值轉換為cut-off index (C0I)，以C0I≥1為陽性。HBeAg、HBsAb及HBcAb的判定標準為0D450大于2.1倍陰性對照0D450的平均值判斷為陽性。
[0063]2.Real-time PCR檢測小鼠血清及肝組織HBV DNA水平:熒光定量PCR試劑盒購自湖南圣湘生物科技有限公司；熒光定量PCR儀為Agilent公司生產的Staragene MX3005P。肝組織DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司。觀察終末處死小鼠，分離肝組織，稱取30mg左右的小鼠肝組織提取，最后以50μ 1 ΤΕ溶解，分別取分離的小鼠血清和提取的肝組織 DNA5 μ 1 進行 Real-time PCR 檢測。
[0064]結果顯示:pCS-HBVl.3注射組小鼠，在注射后1天即可在血清中檢測到HBsAg、HBeAg的表達，并且70%小鼠均可在6周內持續(xù)陽性；并且在注射后7天至注射后56天均可檢測到HBcAb的表達；而pAAV-HBVl.3注射組小鼠在注射后1周可在血清中檢測到高水平的HBsAg、HBeAg及HBV DNA,但在注射后28天全部轉陰，并伴隨HBsAb產生；而上述兩組小鼠均可在血清及肝組織中檢測到HBV DNA，在注射后56天，pCS-HBVl.3注射組肝組織HBV DNA水平高于pAAV-HBVl.3注射組；而兩組小鼠血清DNA均在注射后第Id即可檢測到，pCS-HBVl.3注射組小鼠在注射后1周血清DNA達高峰之后緩慢下降；而pAAV-HBVl.3注射組只在注射后10d檢測到，注射后14d全部轉陰。二者在肝內均可檢測到HBeAg的表達；提示注射pCS-HBVl.3質粒更優(yōu)于pAAV-HBVl.3建立小鼠HBV持續(xù)性感染模型。結果參見圖3、4、5。
[0065]實施例4
[0066]比較BALB / c和C57BL / 6小鼠分別注射pCS_HBVl.3建立的小鼠模型
[0067]實驗如下:
[0068]實驗動物為SPF級BALB / c和C57BL / 6小鼠，各6只，雌性，6周齡。
[0069]注射質粒為pCS-HBVl.3，注射量為5 μ g/只，溶于相當于小鼠體重8% -10%體積的NS中。
[0070]注射方法高壓水動力尾靜脈注射，小鼠經光照尾靜脈擴張后，將質粒溶液在5_8s內勻速注射到小鼠體內。
[0071]檢測方法:按預先設定好的時間點經內眥靜脈采血。采血量為50 μ 1，經5000rpm，離心5min收集血清，以PBS1:10稀釋后，用于HBsAg、HBeAg、HBsAb及HBcAb的ELISA檢測(使用上海科華公司的HBV ELISA檢測試劑盒);用HBV核酸定量試劑盒(PCR-熒光探針法)(國食藥監(jiān)械(準)字2011第340，湖南圣湘生物)按照使用說明書檢測血清及肝組織HBV DNA。
[0072]結果顯示:BALB / c小鼠高壓水動力注射5μ g pCS-HBVl.3質粒后，HBsAg和HBeAg在注射后5d達高峰，之后迅速下降，至注射后12d轉為陰性；與此同時，注射質粒后7天可檢測到HBcAb ;注射質粒后14d檢測到HBsAb ;血清HBV DNA同樣在注射質粒后l_14d陽性，但肝組織DNA注射后15d后仍可檢測到。而C57BL / 6小鼠高壓水動力注射5 μ gpCS-HBVl.3質粒后，約70%小鼠血清HBsAg、HBeAg及HBV DNA表達時間明顯長于BALB /c小鼠，并且在注射后56d未檢測到HBsAb的產生，提示宿主的遺傳背景影響HBV在小鼠體內的持續(xù)表達。結果參見圖3和圖7。
[0073]實施例5
[0074]雌性、雄性C57BL / 6小鼠高壓水動力注射pCS-HBVl.3質粒比較
[0075]實驗動物為SPF級雌性及雄性C57BL / 6小鼠，各6只，6周齡。
[0076]注射質粒為pCS-HBVl.3，注射量為5μ g /只，溶于相當于小鼠體重8%-10%體積的NS中。[0077]注射方法高壓水動力尾靜脈注射，小鼠經光照尾靜脈擴張后，將質粒溶液在5_8s內勻速注射到小鼠體內。
[0078]檢測方法:按預先設定好的時間點經內眥靜脈采血。采血量為50 μ 1，經5000rpm，離55min收集血清，以PBS1:10稀釋后，用于HBsAg、HBeAg、HBsAb及HBcAb的ELISA檢測(使用上海科華公司的HBV ELISA檢測試劑盒);用HBV核酸定量試劑盒(PCR-熒光探針法)(國食藥監(jiān)械(準)字2011第340，湖南圣湘生物)按照使用說明書檢測血清及肝組織HBV DNA。
[0079]結果顯示:雄性C57BL / 6小鼠經高壓水動力尾靜脈注射5 μ g pCS-HBVl.3質粒后，血清HBsAg在注射后第Id即可檢測到，但到注射后28d全部轉陰，并且伴隨HBsAb的產生；血清HBeAg同樣在注射后第Id檢測到，且約70%的小鼠在注射后28d轉陰；血清HBVDNA在注射后49d均可檢測到。而雌性C57BL / 6小鼠其陽性小鼠比例及陽性持續(xù)時間均高于雄性小鼠，提示雌性C57BL / 6小鼠更適合建立HBV持續(xù)感染模型。結果參見圖3和圖8。
[0080]實施例6
[0081 ] 肝組織HBeAg免疫組化分析:
[0082]實驗動物為SPF級C57BL / 6小鼠，雌性，6周齡。
[0083]注射質粒為pCS-HBVl.3和pAAV-HBVl.3，注射量為5 μ g/只，溶于相當于小鼠體重8% -10%體積的NS中。
[0084]注射方法高壓水動力尾靜脈注射，小鼠經光照尾靜脈擴張后，將質粒溶液在5_8s內勻速注射到小鼠體內。同時設注射NS對照鼠；免疫組化分析HBeAg的表達。
[0085]試劑:兔抗HBeAg單克隆抗體購自Santa Cruz公司，HRP標記羊抗兔抗體為北京中杉金橋生物技術有限公司產品。
[0086]方法如下:各小鼠分別在注射后5d、42d處死小鼠，分離肝組織，經4%多聚甲醛固定織常規(guī)梯度酒精脫水、二甲苯透明，石蠟包埋，切片后進行HE染色進行病理分析。同時石蠟切片脫蠟至水，3% H202室溫lOmin，消除內源性過氧化物酶活性，正常山羊血清工作液室溫封閉，加入1:200稀釋的兔抗HBeAg的抗體4°C過夜；PBS漂洗，滴加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG，37°C孵育30min，PBS漂洗，DAB顯色，蘇木素復染，常規(guī)脫水，透明封片，光鏡下觀察HBeAg的表達。
[0087]結果:雌性6周齡的C57BL / 6小鼠，經高壓水動力尾靜脈注射5 μ g pCS-HBVl.3質粒后，肝臟均為明顯的肝細胞損傷、淋巴細胞浸潤、炎性反應；且均可檢測到HBeAg的表達，HBeAg的表達，主要位于細胞核內，少量分布于細胞質中。結果參見圖6。
[0088]實施例7
[0089]HBV小鼠模型在疫苗評價中的應用
[0090]實驗動物SPF級雌性C57BL / 6小鼠，各6只，6周齡。
[0091]疫苗及佐劑CHO細胞表達CHO細胞表達的含S+PreSl融合抗原的顆粒疫苗HBSS1，為華北制藥股份有限公司產品，用注射用生理鹽水配制成lOOyg / ml ;氫氧化鋁佐劑由華北制藥集團提供，濃度為2mg / ml。聚肌苷酸-聚胞苷酸(Poly I:C):購自美國SIGMA公司，用注射用生理鹽水配制成2mg / ml ο
[0092]方法:小鼠經高 壓尾靜脈注射5 μ g pCS-HBVl.3質粒后，將陽性鼠隨機分為3組，每組 6 只。分別為 Alum+Poly I:C、HBSS1+A1 (OH) 3、HBSS1+A1 (OH) 3+Poly I:C 免疫組；其中每劑中抗原含量皆為1.25ug，A1(0H)3含量為lmg/mL，Poly I:C含量為50 μ g，注射體積為0.lml ;肌肉注射，共免疫兩次，間隔2周；每次免疫后2周經內眥靜脈采血分離血清；末次免疫后2周將小鼠脫頸處死后無菌取脾，研磨分離獲得脾細胞懸液，計數調整細胞濃度后立即用于ELISPOT檢測。參見圖9
[0093]用于HBsAg、HBeAg及HBsAb及的ELISA檢測(使用上海科華公司的HBV ELISA檢測試劑盒)；乙型肝炎病毒前S1抗體(抗S1)診斷試劑盒購自上海阿爾法生物技術有限公司。用HBV核酸定量試劑盒(PCR-熒光探針法)(國食藥監(jiān)械(準)字2011第340，湖南圣湘生物)按照使用說明書檢測血清及肝組織HBV DNA。小鼠IFN-y細胞因子ELISPOT試劑購自BD公司。
[0094]按說明書操作，在包被抗用抗IFN-Y抗體后，每孔加入100ul含S或PreSl抗原多肽的脾細胞培養(yǎng)懸液，每孔脾細胞數為5 X 105個，37°C 5%C02靜置培養(yǎng)18h ;棄去培養(yǎng)液后，分步加入檢測抗體和顯色液顯色，Bioreader4000斑點分析儀計數斑點形成數(SFC)。根據斑點數的多少判斷特異性殺傷T細胞的數量，該數量的多少與細胞免疫強度呈正相關。結果見圖6。
[0095]結果:小鼠經高壓尾靜脈注射5μ g pCS-HBVl.3質粒后免疫，同對照組相比，HBSS1聯合佐劑組在第二次免疫后均可誘導高水平的S和PreSl特異性的體液和細胞免疫應答，見圖10 ;HBSS1聯合Alum和PolyI:C佐劑免疫兩次后血清HBsAg和HBeAg和對照組相比顯著降低。并且血清HBV DNA完全清除，但肝組織DNA無明顯變化，見圖11。
【權利要求】
1.本發(fā)明所述的基于慢病毒轉導質粒建立小鼠模型技術，其技術特征是將攜帶多拷貝HBV基因組的慢病毒轉導質粒pCS-HBVl.3用于制作HBV小鼠模型。
2.依據權利要求1，該重組質粒骨架來自于慢病毒轉導質粒pCS-CG，以HBV基因取代其多克隆位點的EGFP表達盒。
3.依據權利要求1，HBV基因組DNA的拷貝數為1.3個拷貝。
4.依據權利要求1，所述的慢病毒轉導質粒PCS-HBV1.3是經尾靜脈高壓水動力注射的方法感染小鼠肝細胞而建立的HBV小鼠模型。
5.依據權利要求1，所述的HBV小鼠模型為HBV持續(xù)性感染模型。
6.依據權利要求1，所述的HBV小鼠模型為雌性4-6周齡C57BL/ 6小鼠。
【文檔編號】A01K67/027GK103642839SQ201310581982
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年11月20日 優(yōu)先權日:2013年11月20日
【發(fā)明者】譚文杰, 揣俠, 王文, 陳紅, 楊揚 申請人:中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所