專利名稱：一種可誘導(dǎo)慢病毒miRNA表達(dá)載體及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,具體涉及可誘導(dǎo)慢病毒miRNA表達(dá)載體及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
miRNAs是一種能夠調(diào)節(jié)基因表達(dá)長(zhǎng)度為21_25個(gè)核苷酸的非編碼RNA鏈，具有控制細(xì)胞增殖、分化、凋亡、腫瘤形成和藥物敏感性等多種細(xì)胞功能。眾所周知，miRNAs經(jīng)歷過基因擴(kuò)增、基因刪除和表觀遺傳沉默等基因突變,這些基因突變最終能激活或者滅活疾病基因。在人類多種疾病中，某些miRNAs始終是失調(diào)的。這些失調(diào)的miRNAs并不局限于特定的疾病類型，而且異常表的miRNAs與臨床病情,如腫瘤分期、藥物敏感性和病人生存率等相關(guān)。此外，最近有研究表明miRNAs有助于細(xì)胞轉(zhuǎn)化、腫瘤形成和〒細(xì)胞維護(hù)。最后，miRNAs功能學(xué)研究直接觀察到特異性miRNAs在體內(nèi)或者體外具有強(qiáng)大的抗癌活性或致癌活性。由于異常表達(dá)的miRNAs在人類疾病的發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，通過拮抗或者恢復(fù)miRNAs的功能來糾正miRNAs的失調(diào)和缺陷將會(huì)給臨床疾病治療帶來巨大的進(jìn)步?；趍iRNA的治療策略已經(jīng)成為了一個(gè)極具潛力的治療方法。為了使miRNAs成為有效的治療方法，它們應(yīng)該被系統(tǒng)性調(diào)控，通過特異且高效的轉(zhuǎn)移系統(tǒng)運(yùn)送到特定組織,然后被靶細(xì)胞攝入胞漿。在胞漿中，它們以完整的形式被細(xì)胞使用。miRNAs在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系用于短期基因抑制是非常有效的，但是用于轉(zhuǎn)錄水平長(zhǎng)期穩(wěn)定的敲除靶基因是有困難的。與其它核苷酸結(jié)構(gòu)類似，miRNAs在臨床應(yīng)用....t存在穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)移問題。miRNAs與siRNAs —樣，細(xì)胞膜穿透能力差、體內(nèi)穩(wěn)定性有限和細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移依賴于系統(tǒng)調(diào)控。為了使miRNAs從一種實(shí)驗(yàn)手段轉(zhuǎn)變成可使病人受益的臨床治療方法,我們需要一種特異性強(qiáng)且有效的基因轉(zhuǎn)移表達(dá)系統(tǒng)。由于慢病毒，如人類免疫缺陷病毒I，能轉(zhuǎn)染分裂細(xì)胞或者非分裂細(xì)胞并將其DNA整合到宿主細(xì)胞基因組中，因 而是一種miRNAs治療的有效運(yùn)載工具。慢病毒載體通常是通過幾種不同的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T人胚胎腎細(xì)胞獲得的。第一個(gè)臨床慢病毒載體產(chǎn)物來自雙質(zhì)粒系統(tǒng)。為了進(jìn)^-步改進(jìn)該系統(tǒng)的生物安全性,慢病毒基因組被分成了 4個(gè)質(zhì)粒。這些質(zhì)粒分別是:自我失活的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒、編碼gag-pol蛋白包裝質(zhì)粒、rev質(zhì)粒和一個(gè)可以編碼水泡型口炎病毒G蛋白(VSV-G)的包膜糖蛋白質(zhì)粒。慢病毒載體是將目的基因或者基因沉默序列穩(wěn)定轉(zhuǎn)移到細(xì)胞的最為有效的運(yùn)載工具。基因轉(zhuǎn)移伴有假構(gòu)型慢病毒包膜蛋白與靶細(xì)胞膜結(jié)合和融合。然后,含有miRNAs基因或者基因沉默序列的慢病毒基因組RNA被逆轉(zhuǎn)錄成DNA，并以極高的效率與細(xì)胞的基因組永久整合。最后，miRNAs基因或者基因沉默序列在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生細(xì)胞在基因水平上永久性改變的預(yù)期效果。嚴(yán)格控制單基因如特異性miRNAs的表達(dá)系統(tǒng)將極大的有助于復(fù)雜基因環(huán)境條件下如哺乳動(dòng)物細(xì)胞miRNAs功能的研究。理想情況下,這樣一個(gè)系統(tǒng)不僅可以介導(dǎo)miRNAs表達(dá)活性的“開關(guān)”狀態(tài)，還可以介導(dǎo)在設(shè)定閾值水平F允許其有限的表達(dá)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的任務(wù)是提供一種可誘導(dǎo)慢病毒miRNA表達(dá)載體及其構(gòu)建方法。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案是:本發(fā)明提供的這種可誘導(dǎo)慢病毒miRNA表達(dá)載體,包含慢病毒轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)的基因HIV-1RNA包裝信號(hào)、5’ LTR和3’ LTR以及四環(huán)素反應(yīng)元件(TRE)和EF-1 a啟動(dòng)子,見圖1。本發(fā)明方案提供的生產(chǎn)細(xì)胞可以是293T腎上皮細(xì)胞系、CHO中國倉鼠卵巢細(xì)胞、COS非洲猴腎細(xì)胞系、HepG2人肝癌細(xì)胞系、BHK敘利亞倉鼠腎細(xì)胞系、Sf9昆蟲卵巢細(xì)胞系、Sf21昆蟲卵巢細(xì)胞系、293人胚腎臟細(xì)胞、ffiK 293人胚腎細(xì)胞系、SODkO、NIH-3T3鼠成纖維細(xì)胞系、Vero非洲綠猴腎細(xì)胞或PerC6人胚腎臟細(xì)胞。本發(fā)明可誘導(dǎo)表達(dá)的基因是miRNA的RNAs。本發(fā)明使用的慢病毒基因表達(dá)載體是第三代慢病毒基因轉(zhuǎn)移表達(dá)載體，即將整個(gè)慢病毒基因組分成四個(gè)質(zhì)粒:自我失活的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒、編碼gag-pol蛋白包裝旗粒、rev旗粒和Iv可以編碼水泡型口炎病毒G蛋白(VSV-G)的包U旲糖蛋白旗粒，miRNA的表達(dá)具有穩(wěn)定和可遺傳性,誘導(dǎo)慢病毒tniRNA表達(dá)載體常用于構(gòu)建動(dòng)物模型,如轉(zhuǎn)基因鼠。本發(fā)明提供的可誘導(dǎo)慢病毒miRNA表達(dá)載體構(gòu)建方法包括以下步驟:(I)構(gòu)建pCR2.1-EF- a克隆載體和pCR2.1-TRE克隆載體，具體步驟是:①根據(jù)載體pT·RE2hyg (BD Life Science)序列(見圖 2),設(shè)計(jì)TRE序列的PCR引物，上游引物為5’ -ACCGGTAGACGCTGTCGAA-3 ’，含有Agel酶切位點(diǎn)；下游引物5’ -ACGCGTAGCAACCAGGTGT-3’，含有 Mlul 酶切位點(diǎn)；②Clal酶切割pTRE2hyg載體(見圖3)，用步驟I所述引物PCR擴(kuò)增TRE序列；(見圖4，5)③采用克隆TA cloning試劑盒,用T4連接酶將PCR產(chǎn)物TRE序列與線性化的PCR2.1載體連接；(見圖6.7)④將步驟3所得到產(chǎn)物pCR2.1-TRE載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DII51,篩選陽性克隆;⑤擴(kuò)增質(zhì)粒,酶切鑒定；⑥酶切鑒定正確后,送公司測(cè)序；⑦根據(jù)pEP-miR 載體(Cell Biolabs, Inc)序列(見圖.8)，設(shè)計(jì) EF-a啟動(dòng)子PCR引物，上游5，-ACGCGTGATGCCTCCCCG-3’，含有Mlul酶切位點(diǎn)；下游5’-GTCGACACCCGTTGCGAAA-3’，含有seal I酶切位點(diǎn),然后用PCR擴(kuò)增EF-a啟動(dòng)子序列,按上述步驟3-6,獲得pCR2.1-EF-1 a載體。(見圖9_13)(2)構(gòu)建 pLK0.1-TRE-EF- a -MCS-puTo 表達(dá)載體，具體步驟是:①將雙酶切法將TRE與EF- a序列從所構(gòu)建的pCR2.1-TRE載體和pCR2.1-EF- a載體切下來；(圖14,15)②用Agel和Mlul兩個(gè)酶切位點(diǎn)切切割pLK0.1-puro (見圖16)，并將TRE序列與pLK0.l puro 連接，得到 pLK0.1-TRE-puro ;(見圖 17)；③將步驟2得到的pLK0.1 -TRE-MCS-puro,經(jīng)Mlul和Sal酶切，并與擴(kuò)增EF- a啟動(dòng)子序列連接，得到 pLK0.1-TRE-EF- a -MCS-puro ;(圖.18)④將步驟3所得產(chǎn)物pLK0.1-TRE-EF- a -puro轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH51,雙酶切
鑒定;
⑤擴(kuò)增質(zhì)粒,酶切鑒定；⑥送公司測(cè)序。(3)構(gòu)建EGFP表達(dá)載體，具體步驟是:①根據(jù)pEGFP-NI 載體(BD Life Science)(見圖 19)，設(shè)計(jì) EGFP序列引物,5，-GTCGACGCAGGGCAATAATGAT-3，,含有Scall酶切位點(diǎn)；下游5’ CTCGAGCGGCGGGTCTTGTAGT-3’，含有酶切位點(diǎn) Xho I ；②PCR擴(kuò)增EGFP序列；(見圖20)③將步驟2所得到得EG FP序列(圖21),經(jīng)雙酶切后，與pLK0.1連接；(見圖.22)④將步驟3所得到產(chǎn)物pCR2.1-TRE載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH51,篩選陽性克隆;⑤擴(kuò)增質(zhì)粒,酶切鑒定；⑥送公司測(cè)序。以慢病毒為基礎(chǔ)的基因治療代表著最新一代強(qiáng)大的、多用途載體,可以將不同的基因轉(zhuǎn)移入幾乎所有的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括原代培養(yǎng)細(xì)胞、非分裂細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和干細(xì)胞。依據(jù)本發(fā)明，構(gòu)建可誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)可以調(diào)節(jié)miRNAs在哺乳動(dòng)物細(xì)胞里的表達(dá)。在本系統(tǒng)中,miRNAs的表達(dá)受四環(huán)素反應(yīng)元件和EF-1 a啟動(dòng)子的控制。上述miRNAs表達(dá)系統(tǒng)與Tet-On細(xì)胞系聯(lián)合后可以調(diào)節(jié)miRNAs在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高水平表達(dá)。加入強(qiáng)力霉素后,上述表達(dá)系統(tǒng)被激活。miRNAs的表達(dá)水平受不同強(qiáng)力霉素濃度的嚴(yán)格調(diào)控。由于可誘導(dǎo)慢病毒miRNAs表達(dá)系統(tǒng)能夠有效地將miRNA表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因有選擇性地整合入細(xì)胞基因組DKA,因而該系統(tǒng)可以為建立穩(wěn)定細(xì)胞系或者轉(zhuǎn)基因動(dòng)物提供方便而有效的方法。實(shí)驗(yàn)主要分析細(xì)胞或者轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是否能永久地維持和繼承這種受嚴(yán)格調(diào)控的表型。本發(fā)明具體技術(shù)方案包括:1.構(gòu)建可誘導(dǎo)慢病毒miRNAs表達(dá)載體:所有用于構(gòu)建哺乳動(dòng)物細(xì)胞可誘導(dǎo)慢病毒miRNAs表達(dá)載體的必需元件都被亞克隆入pLK0.1puro載體(Sigma-Aldrich)。供載體還包含受人hPGK啟動(dòng)子調(diào)控的嘌呤霉素抗性基因。從pEP-miR載體(Cell Biolabs, Inc)上擴(kuò)增人EF-1 a基因啟動(dòng)子。四環(huán)素反應(yīng)元件來自pTRE2hyg載體(BD Life Science)。所有的PCR擴(kuò)增片段通過TA Cloning試劑盒(Invitrogen)克隆入pCR2.1載體。隨后，EF-1a基因啟動(dòng)子和四環(huán)素反應(yīng)元件通過測(cè)序加以確認(rèn)。然后,EF-1 a基因啟動(dòng)子和四環(huán)素反應(yīng)元件用限制性內(nèi)切酶從PCR2.1載體上切割下來并連接到用相應(yīng)限制性內(nèi)切酶消化WpLK0.1puro載體....t。EF-1a基因啟動(dòng)子、四環(huán)素反應(yīng)元件和引導(dǎo)序列再次測(cè)序確認(rèn)，最后獲得可誘導(dǎo)慢病毒表達(dá)系統(tǒng)(強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)miRNA表達(dá))。上述表達(dá)系統(tǒng)包含四環(huán)素反應(yīng)元件(TRE),該元件由7個(gè)42bp的Tet.操縱序列(TetO)構(gòu)成的直接重復(fù)序列組成。TRE元件位于EF-1 a基因啟動(dòng)子上游。因此,在無rtTA結(jié)合到TRE上時(shí)EF_1 a基因啟動(dòng)子處于沉默狀態(tài)，從而阻止了 miRNA的“泄露”表達(dá)。2.慢病毒的制備:在轉(zhuǎn)染前24h，將293T細(xì)胞置于孔板內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI 1.640培養(yǎng)。細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基或含血清的DMEM或者RPMI培養(yǎng)基中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，感染復(fù)數(shù)為50-1000pfu/cell。在37度,無血清培養(yǎng)基中孵育4小時(shí)或在含血清的DMEM或RPMI培養(yǎng)基中孵育18小時(shí)。然后，清洗細(xì)胞并更換培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，收集含病毒的細(xì)胞上清液,然后在室溫下，ISOOrmp離心IOmin0此外,用來自VSV-G的包膜糖蛋白G修飾慢病毒可以擴(kuò)大慢病毒轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的范圍。3.慢病毒滴度測(cè)定:通過p24抗原ELISA實(shí)驗(yàn)測(cè)定慢病毒轉(zhuǎn)染顆粒的滴度，并通過換算因數(shù)將p24的pg/ml換算成TU/ml (transducing unit per ml)。而且,慢病毒的轉(zhuǎn)染單位(TU/m:[)是通過分析可轉(zhuǎn)染KHOS細(xì)胞的慢病毒顆粒數(shù)量來確定的。滴度計(jì)算方法參考 Follenzi 和 Naldini, 2002。U-20S Tet-On cell line:U_20S骨肉瘤細(xì)胞系是一種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pTet-On質(zhì)粒的細(xì)胞系。pTet-On在強(qiáng)大的巨細(xì)胞病毒立早啟動(dòng)子(Pcmv)的控制下表達(dá)Tet反應(yīng)性反式轉(zhuǎn)錄激活因子(rt’TA)。tTA是由Tet抑制蛋白的第1-207個(gè)氨基酸和單純皰疹病毒VP16的C末端帶負(fù)電荷的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(130氨基酸)融合而成。pTet-On系統(tǒng)類似于pTet-Off系統(tǒng)，但由于TetR中4個(gè)氨基酸的突變而轉(zhuǎn)變成rTetR,相應(yīng)的tTA轉(zhuǎn)變成了 rtTA。在一個(gè)由TRE調(diào)控的基因載體轉(zhuǎn)染pTet-On細(xì)胞系后，在強(qiáng)力霉素(Dox)存在的情況下rtTA就結(jié)合到TRE上,從而激活基因轉(zhuǎn)錄。當(dāng)DOX從培養(yǎng)基中去除時(shí),TRE調(diào)控的基因轉(zhuǎn)錄以高度劑量依賴性的方式被關(guān)閉。4.構(gòu)建EGFP表達(dá)載體:為了使誘導(dǎo)慢病毒載體表達(dá)EGFP,該基因編碼序列從pEGFP-NI載體(BD Life Science)上克隆下來并插入pKL0.1載體中。在pTet-On系統(tǒng)中，EGFP的表達(dá)受rtTA調(diào)節(jié)。5.miRNA的長(zhǎng)期表達(dá):U_20S Tet-On細(xì)胞(5X IO3Zml)接種于96孔板，次日用含miRNA-199a-3p編碼序列的慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞,并將細(xì)胞在含強(qiáng)力霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至6周。miRNA-199a-3p 的表達(dá)用 miRNA Real-time PCR(Applied Biosystem)每周監(jiān)測(cè)一次。作為對(duì)照組，U-20S Tet-Οη細(xì)胞用表達(dá)GFP的pKL0.1-puro-CMV-TurboGFP載體轉(zhuǎn)染，其表達(dá)的監(jiān)測(cè)方法同實(shí)驗(yàn)組。 6.統(tǒng)計(jì)分析:用GraphPadPrism 4軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。(GraphPad SoftwareInc., San Diego, Calif.，USA)可誘導(dǎo)慢病毒miRNA表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì):1.極其嚴(yán)格的開關(guān)調(diào)控。該表達(dá)系統(tǒng)在無誘導(dǎo)劑的情況下，目的miRNA的背景或者泄露表達(dá)是極其低的。2.,一注。原核調(diào)節(jié)蛋白(rtTA)引進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞后，只對(duì)其特異的靶序列產(chǎn)生作用，其原因很有可能是在真核生物基因組中不存在其調(diào)節(jié)的DNA序列。3.1 度可誘導(dǎo)性和快速ix應(yīng)時(shí)間。在Tet系統(tǒng)下,誘導(dǎo)反應(yīng)在30min就可以檢測(cè)到。據(jù)觀察,誘導(dǎo)表達(dá)水平可以高達(dá)原有水平的1000倍。
4.特性明確的誘導(dǎo)劑。強(qiáng)力霉素價(jià)格低廉、性質(zhì)明確,可以產(chǎn)生高度可重復(fù)性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
5.EF-1a啟動(dòng)子伴有限制性酶切位點(diǎn),便于寡核苷酸的插入。6.該表達(dá)系統(tǒng)易于有效轉(zhuǎn)染分裂和靜止期的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括一些難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,如原代細(xì)胞、干細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。此外,可誘導(dǎo)慢病毒miRNA表達(dá)載體可以用構(gòu)建miRNA過表達(dá)的動(dòng)物模型,如轉(zhuǎn)基因鼠。本發(fā)明的有效效果及特點(diǎn):1.表達(dá)包含原始所有序列的miRNA前體轉(zhuǎn)錄本，并在嚴(yán)格的調(diào)控機(jī)制的控制下確保該前體轉(zhuǎn)錄本通過內(nèi)源性機(jī)制加工處理后得到真正成熟的miRNAs。2.基于可誘導(dǎo)慢病毒的表達(dá)系統(tǒng)確保了 miRNA在廣泛的細(xì)胞系包括非分裂細(xì)胞和難轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá)。3.以復(fù)制缺陷型HIV和FIV為基礎(chǔ)的慢病毒表達(dá)系統(tǒng)的生物安全性較高。4.通過共表達(dá)EFGP熒光標(biāo)記蛋白可以監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。通過嘌呤霉素篩選標(biāo)記可以篩選穩(wěn)定表達(dá)miRNA的陽性細(xì)胞。
本發(fā)明潛在應(yīng)用方向包括:1.通過miRNA在細(xì)胞中的高表達(dá)來研究miRNA的功能。2.采用慢病毒表達(dá)系統(tǒng)，在原代細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、干 細(xì)胞和非分裂細(xì)胞中表達(dá)miRNA。
3.制備穩(wěn)定表達(dá)miRNA的細(xì)胞系來研究細(xì)胞傳道通路和尋找miRNA調(diào)節(jié)的靶基因。4.miRNA革巴向基因治療的臨床試驗(yàn)


圖1.pKL0.1-TRE-EF-1 a載體示意圖；圖2.pPTREhyg載體結(jié)構(gòu)示意圖；圖3.ClaI內(nèi)切酶線性化pPTREhyg載體；圖4.酶切后線性化的pPTREhyg載體；圖5.PCR引物擴(kuò)增TRE序列；圖6.PCR克隆得到的TRE序列；圖7.TRE序列插入pCR2.1載體；圖8.pEP-miR結(jié)構(gòu)示意圖；圖9.BamHI酶切pEP-miR ；圖10.BamHI線性化后的pEP-miR載體;圖11.PCR引物擴(kuò)曾EF-a序列；圖12.PCR擴(kuò)增得到的EF-a序列；圖13.EF-a序列插入pCR2.1載體；圖14.Agel和MluI雙酶切切下TRE序列；圖15.MluI和Sal雙酶切下EF- a序列；圖
16.PLK0.1載體示意圖；圖17.TRE序列和EF- a序列插入pKL0.1載體;圖18為圖17連續(xù)圖；圖19.pEGFP-Nl載體結(jié)構(gòu)示意圖；圖20.PCR擴(kuò)增EGFP基因；圖21.EPGF擴(kuò)增序列；圖22.EGFP載體構(gòu)建流程圖；圖23.pKL0.1-TRE-EF-1 a niRNA-PuTo構(gòu)建流程圖;圖24.病毒包裝過程流程圖；圖25.miRNA-199a-3p的表達(dá)量。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:構(gòu)建可誘導(dǎo)慢病毒miRNA表達(dá)載體—、實(shí)驗(yàn)材料:pTRE2hyg(BD Life Science), TA cloning 試劑盒(Invitrogen),pEP-miR載體(Cell Biolabs 公司)pLK0.1 載體(Sigma-Aldrich 公司),pEGFP-Nl 載體(BDLife Science公司),瓊脂糖(生命公司)，內(nèi)切酶(NEB公司)。二、構(gòu)建 可誘導(dǎo)慢病毒miRNA表達(dá)載體:(一 )構(gòu)建pCR2.1-EF- a克隆載體和pCR2.1-TRE克隆載體①根據(jù)載體pTRE2hyg(BD Life Science)序列，見圖2,設(shè)計(jì)TRE序列的PCR引物，上游引物為5’ -ACCGGTAGACGCTGTCGAA-3’，含有Agel酶切位點(diǎn)；下游引物5’ -ACGCGTAGCAACCAGGTGT-3’，含有 Mlul 酶切位點(diǎn)。②Clal酶切割pTRE2hyg載體，見圖3,用步驟I所述引物PCR擴(kuò)增TRE序列，見圖4和5。③采用克隆TA cloning試劑盒,用T4連接酶將PCR產(chǎn)物TRE序列與線性化的PCR2.1載體連接，見圖6和7。④將步驟3所得到產(chǎn)物pCR2.1-TRE載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌M51,篩選陽性克隆。⑤擴(kuò)增質(zhì)粒，酶切鑒定。⑥酶切鑒定正確后，送公司測(cè)序。⑦根據(jù)pEP-miR載體(Cell Biolabs, Inc)序列，見圖8,設(shè)計(jì)EF-a啟動(dòng)子PCR引物,上游5’ -ACGCGTGATGCCTCCCCG-3’，含有Mlul酶切位點(diǎn);下游5’-GTCGACACCCGTTGCGAAA-3 ’,含有 seal I 酶切位點(diǎn)。然后用 PCR 擴(kuò)增 EF- a 啟動(dòng)子序列，按上述步驟3-6，獲得pCR2.1-EF-1 a載體，見圖9-13。
(二)構(gòu)建 pLK0.1-TRE-EF- a -MCS-puro 表達(dá)載體①將雙酶切法將TRE與EF- α序列從所構(gòu)建的pCR2.1-TRE載體和pCR2.1-EF- α載體切下來，圖14,15。②用Agel和Mlul兩個(gè)酶切位點(diǎn)切切割pLK0.1-puro,見圖16,并將TRE序列與pLK0.1-puro 連接，得到 pLK0.1-TRE-puro。見圖 17。③將步驟2得到的pLK0.Ι-TRE-MCS-puro,經(jīng)Mlul和Sal酶切，并與擴(kuò)增EF- α啟動(dòng)子序列連接，得到pLK0.1-TRE-EF-α -MCS-puro，見圖18。④將步驟3所得產(chǎn)物pLK0.1-TRE-EF- a ^puro轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH51,雙酶切
鑒定⑤擴(kuò)增質(zhì)粒，酶切鑒定。⑥測(cè)序。(三)構(gòu)建EGFP表達(dá)載體①根據(jù)pEGFP-Nl 載體(BD Life Science),見圖.19,設(shè)計(jì) EGFP 序列引物,5’ -GTCGACGCAGGGCAATAATGAT-3’，含有 Scall 酶切位點(diǎn)；下游5’ CTCGAGCGGCGGGTCTTGTAGT-3’，含有酶切位點(diǎn) Xhol。②PCR擴(kuò)增EGFP序列，見圖20。③將步驟2所得到得EGFP序列，見圖21,經(jīng)雙酶切后,與pLK0.1連接,見圖22。④將步驟3所得到 產(chǎn)物pCR2.1-TRE載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH51,篩選陽性克隆。⑤擴(kuò)增質(zhì)粒,酶切鑒定.
⑥送公司測(cè)序。(四)構(gòu)建 pLK0.1-TRE-EF- a -mi RNA199a_3p-puro 表達(dá)載體(見圖 23)①.通過查閱文獻(xiàn)獲得miRNA-199a-3p莖環(huán)結(jié)構(gòu)， 5，-GCCAACCCAGUGUUCAGACUACCUGUUCAGGAGGCUCUCAAUGUGUACAGUAtiUCUGCACAUUGGUUAGGC-3’并送公司合成。②退火使得包含目的miRNA表達(dá)序列寡核苷酸的前向和反向鏈分開。③用BamHl和Clal兩個(gè)酶切位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的內(nèi)切酶線性化慢病毒miRNA表達(dá)載體。④將退火的寡核苷酸片段連接到慢病毒載體上⑤將載體轉(zhuǎn)入細(xì)囷后師選陽性克隆。⑥測(cè)序確認(rèn),載體構(gòu)建成功實(shí)施例2:實(shí)施例1構(gòu)建的可誘導(dǎo)慢病毒miRNA表達(dá)載體在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)材料:raiRNA-l"a-3P(invitrogen 公司),Lent1-X HT Packaging Mix 試劑盒(clontech 公司),QuickTiterTM HIV Lentivirus Quantitationi；式齊U盒(Cell Biolabs公司),U-20S Tet-On cell line細(xì)胞,PCR引物(invitrogen公司)瓊脂糖(生命公司),內(nèi)切酶(NEB公司)。慢病毒包裝:1.慢病毒載體質(zhì)粒 pLK0.1-TRE-EF- α -miRNA_199a_3p_puro 和 Lent1-X HTPackaging Mix按一定比例轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞系(實(shí)驗(yàn)步驟參照Lent1-X HT Packaging Mix試劑盒說明書(見圖24)。
2.收集慢病毒，用 QuickTiter HIV Lentivirus Quantitation 試劑盒(CellBiolabs 公司)。p24ELISA并確定其效價(jià)和TU/ml。病毒滴度可獲得高達(dá)5 X 108TU/ml。U-20S Tet^On cel! line 轉(zhuǎn)染:1.將構(gòu)建的重組慢病毒轉(zhuǎn)入U(xiǎn)-20S Tet-On cell line細(xì)胞系，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3組,空白對(duì)照組，不做任何處理；陰性對(duì)照組，給予空載體；陽性對(duì)照組，給予pLK0.1-TRE-EF- a -mi RNA -199a-’3p - puro 02.用四環(huán)素處理細(xì)胞,誘導(dǎo)miRNA的表達(dá)。用Real-time PCR 確定 miRNA 的表達(dá):miRNA-199a-3p反轉(zhuǎn)錄引物和定量PCR由introvigen公司合成,提取細(xì)胞內(nèi)RNA后先合成cDNA第一鏈，在以該鏈和PCR引物，進(jìn)行PCR反應(yīng),反應(yīng)條件為:95°C Imin變性，9515s, 6020s, 701.5s, 42次循環(huán)。最后’以U6為內(nèi)參，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析陽性對(duì)照組的miRNA表顯著高于陰性對(duì)照組和空白組，因此該載體pLK0.1-TRE-EF- a -miRNA-puro 構(gòu)建有效。(見圖 25)以下為本專利申請(qǐng)的序列表,序列表中各序列依次為:序列1:TRE序列的PCR上游引物；序列2:TRE序列的PCR下游引物；序列3:EF- a啟動(dòng)子PCR上游引物；序列4:EF- a啟動(dòng)子PCR下游引物;序列5 =EGFP序列PCR上游引物；序列6 =EGFP序列PCR下游引物’；序列7:miRNA-199a-3p. 環(huán)結(jié)構(gòu)；序列8:TRE序列:序歹丨J 9:EF-1 a序列；序列10:PCR克隆得到的TRE序列；序列11 =PCR擴(kuò)增得到的EF-a序列；序列12 =EPGF擴(kuò)增序列。序列表<110>華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院〈120〉一種可誘導(dǎo)慢病毒miRNA表達(dá)載體及其構(gòu)建方法〈160〉12<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>19<212>DNA〈213〉人工序列〈400〉Iaccggtagac gctgtcgaa 19<210>2<211>19<212>DNA〈213〉人工序列<400>2acgcgtagca accaggtgt 19<210>3 <211>18
<212>DNA〈213〉人工序列<400>3acgcgtgatg cctccccg 18<210>4<211>19<212>DNA〈213〉人工序列<400>4gtcgacaccc gttgcgaaa 19<210>5<211 >22<212>DNA〈213〉人工序列<400>5gtcgacgcag ggcaataatg at 22<210>6<211>22<212>DNA〈21.3〉人工序列<400>6ctcgagcggc gggtcttgta gt 22<210>7〈211)71<212>RNA〈213〉人工序列<400>7gccaacccag uguucagacu accuguucag gaggcucuca auguguacag uagucugcac 60auugguuagg c71<210>8〈211 >31’3<212>DNA〈213〉人工序列<400>8tttaccactc cctatcagtg atagagaaaa gtgaaagtcg agtttaccac tccctatcag 60tgatagagaa aagtgaaagt cgagtttacc actccctatc agt.gat.agag aaaagtgaaa 120gtcgagttta ccactcccta tcagtgatag agaaaagtga aagtcgagtt taccactccc 180tatcagtgat ag agaaaagt gaaagtcgag tttaccactc cctatcagtg atagagaaaa 240gtgaaagtcg agtttaccac tccctatcag tgatagagaa aagtgaaagt cgagctcggt 300
權(quán)利要求
1.一種可誘導(dǎo)慢病毒miRMA表達(dá)載體,其特征在于:該載體包含慢病毒轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)的基因HIV-1RNA包裝信號(hào)、5’ LTR和3’ LTR以及四環(huán)素反應(yīng)元件(TRE)和EF-1 α啟動(dòng)子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可誘導(dǎo)慢病毒miRNA表達(dá)載體構(gòu)建方法,其特征在于:生產(chǎn)細(xì)胞是293T腎上皮細(xì)胞系、CIIO中國倉鼠卵巢細(xì)胞、COS非洲猴腎細(xì)胞系、HepG2人肝癌細(xì)胞系、BHK敘利亞倉鼠腎細(xì)胞系、Sf9昆蟲卵巢細(xì)胞系、Sf21昆蟲卵巢細(xì)胞系、293人胚腎臟細(xì)胞、HEK 293人胚腎細(xì)胞系、SODkO、NIH-3T3鼠成纖維細(xì)胞系、Vero非洲綠猴腎細(xì)胞或PerC6人胚腎臟細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可誘導(dǎo)慢病毒miRNA表達(dá)載體構(gòu)建方法,其特征在于:可誘導(dǎo)表達(dá)的基因是miRNA的RNAs。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可誘導(dǎo)慢病毒miRNA表達(dá)載體構(gòu)建方法,其特征在于:慢病毒基因表達(dá)載體是第三代慢病毒基因轉(zhuǎn)移表達(dá)載體即將整個(gè)慢病毒基因組分成四個(gè)質(zhì)粒:自我失活的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒、 編碼gag-pol蛋白包裝質(zhì)粒、rev質(zhì)粒和一個(gè)可以編碼水泡型口炎病毒G蛋曰(VSV-G)的包 膜糖蛋曰)貞粒。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可誘導(dǎo)慢病毒miRNA表達(dá)載體構(gòu)建方法,其特征在于:miRNA的表達(dá)具有穩(wěn)定和可遺傳性，誘導(dǎo)慢病毒miRNA表達(dá)載體常用于構(gòu)建動(dòng)物模型，如轉(zhuǎn)基因鼠。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可誘導(dǎo)慢病毒miRNA表達(dá)載體構(gòu)建方法如下: (1)構(gòu)建PCR2.1-EF- α克隆載體和pCR2.1-TRE克隆載體,具體步包括: ①根據(jù)載體pTRE2hyg(BDLife Science)序列，設(shè)計(jì)TRE序列的PCR引物，上游引物為5’ -ACCGGTAGACGCTGTCGAA-3’，含有Agel酶切位點(diǎn)；下游引物·5’ -ACGCGTAGCAACCAGGTGT-3’，含有 Mlu:丨.酶切位點(diǎn)； ②Clal酶切割pTRE2hyg載體,用步驟I所述引物PCR擴(kuò)增TRE序列； ③采用克隆TAcloning試劑盒，用T4連接酶將PCR產(chǎn)物TRE序列與線性化的pCR2.1載體連接； ④將步驟3所得到產(chǎn)物PCR2.1 -TRE載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH51，篩選陽性克??； ⑤擴(kuò)增質(zhì)粒，酶切鑒定； ⑥酶切鑒定正確后，送公司測(cè)序； ⑦根據(jù)pEP-miR載體(CellBiolabs, Inc)序列，設(shè)計(jì)EF-α啟動(dòng)子PCR引物，上游·5 ’ -ACGCGTGATGCCTCCCCG-3 ’,含有 Mlu:[酶切位點(diǎn)；下游 5 ’ -GTCGACACCCGTTGCGAAA-3 ’,含有scall酶切位點(diǎn),然后用PCR擴(kuò)增EF- α啟動(dòng)子序列,按上述步驟3_6，獲得pCR2.1_EF_1 α載體； (2)構(gòu)建pLK0.1-TRE-EF- a -MCS-puro表達(dá)載體,具體步包括: ①將雙酶切法將TRE與EF-α序列從所構(gòu)建的pCR2.1-TRE載體和pCR2.1-EF- α載體切下來； ②用Agel和Mlul兩個(gè)酶切位點(diǎn)切切割pLK0.1-pur ο,并將TRE序列與pLK0.1-pur ο連接，得到 pLK0.1-TRE-puro ； ③將步驟2得到的pLK0.1-TRE-MCS-puro,經(jīng)Mlul和Sal酶切，并與擴(kuò)增EF- α啟動(dòng)子序列連接,得到 pLK0.1-TRE-EF- a -MCS-puro ； ④將步驟3所得產(chǎn)物pLK0.1-TRE-EF- a -puro轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH51，雙酶切鑒定; ⑤擴(kuò)增質(zhì)粒，酶切鑒定； ⑥測(cè)序。
(3)構(gòu)建EGFP表達(dá)載體,具體步包括: ①根據(jù)pEGFP-Nl載體(BDLife Science), 設(shè)計(jì)EGFP序列引物，5’ -GTCGACGCAGGGCAATAATGAT-3’，含有 Scall 酶切位點(diǎn)；F 游5’ CTCGAGCGGCGGGTCTTGTAGT-3’，含有酶切位點(diǎn) Xhol ； ②PCR擴(kuò)增EGFP序列； ③將步驟2所得到得EGFP序列,經(jīng)雙酶切后,與pLK0.1連接； ④將步驟3所得到產(chǎn)物pCR2.1-TRE載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH51,篩選陽性克隆； ⑤擴(kuò)增質(zhì)粒,酶切鑒定； ⑥測(cè)序。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種可誘導(dǎo)慢病毒miRNA表達(dá)載體，包含慢病毒轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)的基因HIV-1RNA包裝信號(hào)、5’LTR和3’LTR以及四環(huán)素反應(yīng)元件(TRE)和EF-1α啟動(dòng)子。該系統(tǒng)提供了一個(gè)能夠指導(dǎo)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)合成miRNA的表達(dá)載體。載體使用的四環(huán)素反應(yīng)元件(TRE)和EF-1α基因啟動(dòng)子確保該載體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的高水平表達(dá)。載體在無強(qiáng)力霉素(DOX)存在條件下，目的miRNA的表達(dá)受抑制，而有Dox存在時(shí)，則其被誘導(dǎo)表達(dá)。
文檔編號(hào)C12N15/867GK103074375SQ20111032975
公開日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2011年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月26日
發(fā)明者楊操, 楊述華, 劉映樂, 葛挺, 劉先哲, 李帥, 趙伯明 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院