專利名稱：一株乙炔雌二醇高效降解菌及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于雌激素降解菌及其制備領(lǐng)域，特別涉及一株乙炔雌二醇高效降解菌及其制備方法。
背景技術(shù)：
隨著環(huán)境分析技術(shù)的提高和人們環(huán)境意識(shí)的增強(qiáng)，合成雌激素作為一種新興污染物日益受到人們的關(guān)注。雖然這類物質(zhì)在環(huán)境中的濃度不高，但即使微量的雌激素類物質(zhì)， 也會(huì)對(duì)環(huán)境及人類健康造成極大的危害作用。已報(bào)道的合成雌激素種類很多，乙炔雌二醇(17 α -ethynylestradiol, EE2)(分子結(jié)構(gòu)如圖1所示)作為許多避孕藥的活性成分，近年來在世界各地的湖泊、河流甚至土壤中被頻繁檢測(cè)出來。然而乙炔雌二醇是芳香雜環(huán)化合物，目前傳統(tǒng)的污水處理方法(如吸附、活性污泥、生物膜、紫外、光催化降解等方法)不能夠有效去除，使其被頻繁檢出，且具有一定的生態(tài)毒性，是目前最受關(guān)注的雌激素類污染物之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一株乙炔雌二醇高效降解菌及其制備方法，該降解菌可以有效地降解乙炔雌二醇，且易于滅活，該方法的種源易得且分離純化方法簡(jiǎn)便快捷。本發(fā)明的一株乙炔雌二醇高效降解菌，該降解菌經(jīng)16S rDNA序列測(cè)定，基因全序列如下TGCAGTCGACGGCAGCACGGGAGCAATCCTGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGGAACG TGCCCTGTCGTGGGGGATAACTAGTCGAAAGATTAGCTAATACCGCATACGACCTGAGGGTGAAAGCGGGGGACCGT AAGGCCTCGCGCGATAGGAGCGGCCGATGTCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCCACCAAGGCGACGATCAG TAGCTGGTCTGAGAGGACGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGA ATTTTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTT GTCCGGAAAGAAATCCCTTGCCCTAATACGGCGGGGGGATGACGGTACCGGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTG CCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTTTGT AAGACAGGCGTGAAATCCCCGAGCTCAACTTGGGAATGGCGCTTGTGACTGCAAGGCTAGAGTATGTCAGAGGGGGG TAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGACGTC ACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAA CTAGTTGTTGGGGATTCATTTCTTCAGTAACGTAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGA TTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACC TTACCTACCCTTGACATGCCACTAACGAAGCAGAGATGCATCAGGTGCCCGAAAGGGAAAGTGGACACAGGTGCTGC ATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCTTTAGTTGCTAC GCAAGAGCACTCTAGAGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTAT GGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTGCGTACAGAGGGTTGCCAACCCGCGAGGGGGAGCTAATCCCAGAAAACGCATCGTAGTCCGGATCGTAGTCTGCAACTCGACTACGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCG CGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTTTGCCAGAAGTAGTTAGCCT AACCGCAAGGAGGGCGAT。菌株16S rDNA的基因全序列在NCBI在線BLAST比對(duì)程序與GENBANK中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析，登錄號(hào)為JN226398，鑒定為貪銅菌，其系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖2，同源性達(dá)到99%， 命名為貪銅菌(Cupriavidus) DE7。所述的貪銅菌(Cupriavidus) DE7為陰性革蘭氏桿菌，好氧，菌體長(zhǎng)度為 0.4-0. 8um，其電鏡掃描圖見圖3。在固體培養(yǎng)基中是呈金黃，不透明，無光澤，表面低凸面， 圓形，邊緣整齊，直徑大小為1-2. 5mm的菌落。在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的培養(yǎng)特征為乳白色懸濁液。該菌株在紫外線照射池后，均已失去活性。本發(fā)明的一株乙炔雌二醇高效降解菌的制備方法，包括將活性污泥經(jīng)定向馴化培養(yǎng)后，通過富集分離和純化，即得該乙炔雌二醇高效降解菌。所述的定向馴化培養(yǎng)為活性污泥按10%的接入量接種于無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，以梯度壓力式馴化法馴化；其中乙炔雌二醇濃度依次為3、5、10、15、20、25、3011^/1，在301、1601·/ min, 250mL錐形瓶中裝填量IOOmL的條件下進(jìn)行馴化培養(yǎng)，總馴化時(shí)間為2個(gè)月。上述的無機(jī)鹽培養(yǎng)基為K2HPO4 4. 35g, KH2PO4 1. 7g，NH4Cl 2. lg，MgSO4 0. 2g， MnSO4O. 05g, FeSO4 · 7H20 0. Olg, CaCl2 · 2H20 0. 03g,蒸餾水 IOOOmL, pH = 6. 8 7. 0。所述的富集分離和純化為將取馴化后的樣品于8000r/min的轉(zhuǎn)速下離心5分鐘， 取上層水樣作KT1 10_6梯度稀釋，每種稀釋濃度分別取ImL菌液于培養(yǎng)皿內(nèi)，倒入富集培養(yǎng)基后將培養(yǎng)皿放在桌上，來回轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿后，將培養(yǎng)皿倒置于30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h ； 挑取形態(tài)清晰的單一菌落，編號(hào)，在富集培養(yǎng)基上劃線，將培養(yǎng)皿倒置于30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48h，再觀察結(jié)果；反復(fù)幾次，并在電子顯微鏡下觀察，確保是純的單一菌株后，將分離出的菌種接種到斜面培養(yǎng)基上，4°C下保存。上述的富集培養(yǎng)基和斜面培養(yǎng)基相同，其分為液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)基，其中液體培養(yǎng)基的組成為牛肉膏3. 0g，蛋白胨10. 0g, NaCl 5. 0g，蒸餾水lOOOmL，pH = 7. 0 7. 2 ； 固體培養(yǎng)基為在上述液體培養(yǎng)基中加入18g/L的瓊脂粉。本發(fā)明的貪銅菌(CupriaViduS)DE7不僅可以利用乙炔雌二醇作為唯一的碳、氮源進(jìn)行新陳代謝，而且能在相對(duì)較高濃度的乙炔雌二醇基質(zhì)條件下(乙炔雌二醇濃度約為 25mg/L)良好生長(zhǎng)。它對(duì)乙炔雌二醇的去除主要通過生物吸附和生物降解兩個(gè)階段，從而對(duì)乙炔雌二醇達(dá)到很高的去除率(80%以上)。同時(shí)適量的外加碳源不但不會(huì)影響本發(fā)明的菌株對(duì)乙炔雌二醇降解作用，而且對(duì)其降解具有促進(jìn)作用。由于乙炔雌二醇為四環(huán)分子結(jié)構(gòu)，并以苯環(huán)、芳香環(huán)為骨架，屬于難生物降解的有機(jī)物，生物法無法有效地去除水中乙炔雌二醇，本發(fā)明提供了從城市污水處理廠二沉池的活性污泥中，通過馴化、富集分離、純化等生物技術(shù)，而得到的一株對(duì)乙炔雌二醇具有高效降解作用的細(xì)菌；該菌株是廢水處理系統(tǒng)中的優(yōu)勢(shì)菌株，因此該菌株能適應(yīng)復(fù)雜的實(shí)際條件，這使得該菌的應(yīng)用前景廣闊。本發(fā)明所提供的貪銅菌(Cupriavidus)DE7質(zhì)粒檢測(cè)結(jié)果表明該菌不攜帶質(zhì)粒， 因此降解基因編碼于染色體上。這一特性使得在利用質(zhì)粒進(jìn)行水平基因轉(zhuǎn)移的過程中，避免了質(zhì)粒的不相容性，是構(gòu)建具備多種降解能力的基因工程菌的良好材料。有益效果(1)本發(fā)明所提供的貪銅菌(Cupriavidus)DE7的種源為城市污水處理廠的活性污泥，種源易得，分離純化方法簡(jiǎn)便快捷；(2)本發(fā)明所提供的貪銅菌(Cupriavidus)DE7可以有效地降解乙炔雌二醇，對(duì)乙炔雌二醇的降解率可達(dá)80%以上；且對(duì)一般抗生素均無抗性，易于滅活，保證了使用的生態(tài)安全性。


圖1為乙炔雌二醇的分子結(jié)構(gòu)式；圖2為貪銅菌(CupriaViduS)DE7的系統(tǒng)進(jìn)化樹；圖3為貪銅菌(Cupriavidus) DE7的掃描電鏡。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實(shí)施例1(1)取自城市污水處理廠二沉池的活性污泥按10%的接入量接種于無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，其中無機(jī)鹽培養(yǎng)基為 K2HPO4 4. 35g, KH2PO4 1. 7g，NH4Cl 2. lg，MgSO4 0. 2g，MnSO4 0. 05g, FeSO4 · 7H20 0. Olg, CaCl2 · 2H20 0. 03g,蒸餾水 IOOOmL, pH = 6. 8-7. 0。以梯度壓力式馴化法馴化，乙炔雌二醇濃度為3、5、10、15、20、25、3011^/1，在301、16017^11，2501^錐形瓶中裝填量IOOmL的條件下進(jìn)行馴化培養(yǎng)，總馴化時(shí)間為2個(gè)月；(2)取馴化2個(gè)月后的樣品，靜置30分鐘，取上層水樣lmL，作KT1 10_1(1梯度稀釋。每種稀釋濃度分別取ImL菌液于培養(yǎng)皿內(nèi)，倒入富集培養(yǎng)基后將培養(yǎng)皿放在桌上，來回轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿后，將培養(yǎng)皿倒置于30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。挑取形態(tài)清晰的單一菌落，編號(hào)， 在富集培養(yǎng)基上劃線，將培養(yǎng)皿倒置于30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，再觀察結(jié)果。反復(fù)幾次，并在電子顯微鏡下觀察，確保是純的單一菌株后，將分離出的菌種接種到斜面培養(yǎng)基上，4°C 下保存于冰箱中待后續(xù)進(jìn)行降解試驗(yàn)。其中富集培養(yǎng)基及斜面培養(yǎng)基為牛肉膏3. 0g，蛋白胨10. 0g,NaCl 5. 0g，蒸餾水1000mL，pH = 7. 0 7. 2 ；固體培養(yǎng)基中加入18g/L的瓊脂粉。(3)分別挑取一定量的經(jīng)分離純化后的單一菌落于各自的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，各無機(jī)鹽培養(yǎng)基中均含有25mg/L的乙炔雌二醇，在30°C、160r/min，250mL錐形瓶中裝填量 IOOmL的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為72h。培養(yǎng)后通過電子顯微鏡觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況以及測(cè)定溶液中乙炔雌二醇的剩余濃度，從而確定出對(duì)乙炔雌二醇具有高效降解作用的菌株。本發(fā)明所提供的一株乙炔雌二醇高效降解菌在初始pH值為7左右，溫度為30°C， 振蕩速率為160r/min，250mL錐形瓶的裝液量為IOOmL的條件下，菌株接種量為1 %，乙炔雌二醇初始濃度為25mg/L，培養(yǎng)時(shí)間72h，乙炔雌二醇的降解率高達(dá)84. 6%。
權(quán)利要求
1.一株乙炔雌二醇高效降解菌，該降解菌經(jīng)16S rDNA序列測(cè)定，基因全序列如下TGC AGTCGACGGCAGCACGGGAGCAATCCTGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGGAACGTGCCCTGTCGT GGGGGATAACTAGTCGAAAGATTAGCTAATACCGCATACGACCTGAGGGTGAAAGCGGGGGACCGTAAGGCCTCGCG CGATAGGAGCGGCCGATGTCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCCACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTG AGAGGACGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAA TGGGGGCAACCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGTCCGGAAAGA AATCCCTTGCCCTAATACGGCGGGGGGATGACGGTACCGGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGC GGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTTTGTAAGACAGGCGT GAAATCCCCGAGCTCAACTTGGGAATGGCGCTTGTGACTGCAAGGCTAGAGTATGTCAGAGGGGGGTAGAATTCCAC GTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGACGTCACTGACGCTCA TGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGTTGTTGG GGATTCATTTCTTCAGTAACGTAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAA AGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCT TGACATGCCACTAACGAAGCAGAGATGCATCAGGTGCCCGAAAGGGAAAGTGGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGT CAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCTTTAGTTGCTACGCAAGAGCACT CTAGAGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTT CACACGTCATACAATGGTGCGTACAGAGGGTTGCCAACCCGCGAGGGGGAGCTAATCCCAGAAAACGCATCGTAGTC CGGATCGTAGTCTGCAACTCGACTACGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACG TTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTTTGCCAGAAGTAGTTAGCCTAACCGCAAGGA GGGCGATo
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一株乙炔雌二醇高效降解菌，其特征在于其菌體長(zhǎng)度為 0. 4 0. Sum ；菌落直徑大小為1-2. 5mm,圓形，邊緣整齊，表面低凸面，無光澤，呈金黃色，不透明，革蘭氏染色均為陰性。
3.—株乙炔雌二醇高效降解菌的制備方法，包括將活性污泥經(jīng)定向馴化培養(yǎng)后，通過富集分離和純化，即得該乙炔雌二醇高效降解菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一株乙炔雌二醇高效降解菌的制備方法，其特征在于所述的定向馴化培養(yǎng)為活性污泥按10%的接入量接種于無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，以梯度壓力式馴化法馴化；其中乙炔雌二醇濃度依次為3、5、10、15、20、25、3011^/1，在301、16017^11，2501^錐形瓶中裝填量IOOmL的條件下進(jìn)行馴化培養(yǎng)，總馴化時(shí)間為2個(gè)月。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一株乙炔雌二醇高效降解菌的制備方法，其特征在于所述的無機(jī)鹽培養(yǎng)基為 Κ2ΗΡ044· 35g, KH2PO4 1. 7g，NH4Cl 2. lg，MgSO4 0. 2g，MnSO4 0. 05g， FeSO4 · 7H20 0. Olg, CaCl2 · 2H20 0. 03g,蒸餾水 IOOOmL, pH = 6. 8 7. 0。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一株乙炔雌二醇高效降解菌的制備方法，其特征在于所述的富集分離和純化為將取馴化后的樣品于8000r/min的轉(zhuǎn)速下離心5分鐘，取上層水樣作 ΙΟ"1 10_6梯度稀釋，每種稀釋濃度分別取ImL菌液于培養(yǎng)皿內(nèi)，倒入富集培養(yǎng)基后將培養(yǎng)皿放在桌上，來回轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿后，將培養(yǎng)皿倒置于30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h;挑取形態(tài)清晰的單一菌落，編號(hào)，在富集培養(yǎng)基上劃線，將培養(yǎng)皿倒置于30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，再觀察結(jié)果；反復(fù)幾次，并在電子顯微鏡下觀察，確保是純的單一菌株后，將分離出的菌種接種到斜面培養(yǎng)基上，4°C下保存。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一株乙炔雌二醇高效降解菌的制備方法，所述的富集培養(yǎng)基和斜面培養(yǎng)基相同，其分為液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)基，其中液體培養(yǎng)基的組成為牛肉膏3. Og, 蛋白胨10. 0g, NaCl 5. 0g，蒸餾水lOOOmL，pH = 7. 0 7. 2 ；固體培養(yǎng)基為在上述液體培養(yǎng)基中加入18g/L的瓊脂粉。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株乙炔雌二醇高效降解菌及其制備方法，該菌株的菌體長(zhǎng)度為0.4～0.8um；菌落直徑大小為1-2.5mm，圓形，邊緣整齊，表面低凸面，無光澤，呈金黃色，不透明，革蘭氏染色均為陰性；其制備方法包括將活性污泥經(jīng)定向馴化培養(yǎng)后，通過富集分離和純化，即得該乙炔雌二醇高效降解菌。本發(fā)明的乙炔雌二醇高效降解菌可以有效地降解乙炔雌二醇，對(duì)乙炔雌二醇的降解率可達(dá)80％以上，且對(duì)一般抗生素均無抗性，易于滅活，保證了使用的生態(tài)安全性；本發(fā)明的乙炔雌二醇高效降解菌的種源易得，分離純化方法簡(jiǎn)便快捷。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102352336SQ20111032951
公開日2012年2月15日 申請(qǐng)日期2011年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月26日
發(fā)明者丁麗娜, 劉沖, 劉鵬程, 夏昆, 孫彥, 張澤光, 肖斌, 陳東輝, 韓瀟, 黃敏, 黃滿紅 申請(qǐng)人:東華大學(xué)