專利名稱：一種真菌介導(dǎo)的微藻固定化廢水處理方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于環(huán)境治理技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種真菌介導(dǎo)的微藻固定化用來處理廢水的工藝。具體說來就是在不同生長時(shí)期的微藻細(xì)胞中導(dǎo)入能成球的真菌孢子并控制培養(yǎng)條件，最終形成大顆粒的菌藻球體，進(jìn)而利用真菌固定化的微藻處理廢水的過程。
背景技術(shù)：
隨著工業(yè)進(jìn)步和社會(huì)發(fā)展，排放的市政廢水和，水污染日趨嚴(yán)重?，F(xiàn)代污水處理方法主要分為物理處理法、化學(xué)處理法、物化處理法和生物處理法。相比較而言，生物處理污水由于適用范圍廣、投資和運(yùn)行費(fèi)用低，多年來已被確立為生活污水、城市混合污水、有機(jī)工業(yè)污水處理的主要手段之一，在生物法中利用藻類處理廢水的研究早在20世紀(jì)50年代就有人報(bào)道。微藻是一種能進(jìn)行光合作用的微生物。它可以利用廢水中的氮、磷和吸收空氣中大量的CO2，并合成脂肪，通過收集加工可提煉成生物柴油供汽車、火車作為動(dòng)力燃料， 進(jìn)一步加工還可作為航空燃料，供飛機(jī)使用。因此利用微藻處理廢水生物燃料優(yōu)勢(shì)明顯繁殖速度比高等植物快40倍)，它在應(yīng)對(duì)全球氣候變暖和滿足對(duì)非污染燃料的渴求方面都有著很大的潛力。近幾年來，國內(nèi)外對(duì)進(jìn)一步發(fā)揮藻類凈化污水的潛力進(jìn)行了大量研究，在藻類凈化污水的機(jī)理研究方面取得了很大進(jìn)展。與傳統(tǒng)方法相比，利用藻類處理污水可以克服傳統(tǒng)污水處理方法易引起的二次污染、潛在營養(yǎng)物質(zhì)丟失、資源不能完全利用等弊端，同時(shí)能夠有效且低成本地去除造成水體富營養(yǎng)化的氮、磷等營養(yǎng)物質(zhì)，因此具有廣闊的應(yīng)用前景。然后由于微藻的細(xì)胞很小(直徑約2-70 Mffl)，處理完廢水后，微藻的收集成為一個(gè)迄待解決的問題。而微藻固定化技術(shù)在污水處理方面的應(yīng)用，使固定化的藻類具有藻細(xì)胞密度高、反應(yīng)速度快、耐毒害能力強(qiáng)、運(yùn)行穩(wěn)定可靠、微生物流失少、產(chǎn)物易分離、能純化和保持菌株高效活力等優(yōu)點(diǎn)，并且其在污水深度處理和氮磷去除方面也有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。傳統(tǒng)的固定化技術(shù)是指利用物理和化學(xué)手段將游離細(xì)胞定位于限定的空間區(qū)域并使其保持生物活性和可反復(fù)利用的一張基礎(chǔ)技術(shù)。所用到的載體主要由有機(jī)和無機(jī)高分子材料已經(jīng)復(fù)合載體等。這些載體的合成成本較高，難以滿足微藻工業(yè)化處理廢水的要求。 本發(fā)明采用自然界廣泛存在的真菌作為固定化材料，率先開展了利用真菌介導(dǎo)微藻成球從而幫助廢水處理的研究。該方法簡單高效，成本低廉，大大降低了微藻處理廢水的成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一種真菌介導(dǎo)的微藻固定化廢水處理方法。通過引入能成球的真菌孢子，形成真菌-微藻共生的大顆粒球體，從而開發(fā)一種新型簡單高效、成本低廉的微藻固定化廢水處理工藝。所述真菌介導(dǎo)的微藻固定化廢水處理方法是以在生物反應(yīng)器中高密度培養(yǎng)微藻細(xì)胞，然后通過添加能成球的真菌的孢子并控制培養(yǎng)獲得真菌介導(dǎo)的微藻固定化細(xì)胞，并收集固定化的微藻細(xì)胞進(jìn)行廢水處理，按照如下步驟進(jìn)行(1)微藻的轉(zhuǎn)接；(2)微藻的高密度培養(yǎng)；(3)能成球的真菌的孢子的培養(yǎng)；(4)添加新鮮孢子懸浮液到微藻培養(yǎng)基中； (5)真菌介導(dǎo)微藻細(xì)胞固定化；(6)固定化的微藻細(xì)胞用來處理各種廢水。所述的微藻細(xì)胞包括但不限于小球藻屬(chlorella sp),筒柱藻屬 (cylindrotheca sp.), 娃藻(diatom), 菱形藻(Nitzschia sp.),裂壺藻( schizochytrium sp.)，杜氏藻屬(dunaliella)，柵藻(Scenedesmus sp.)，微綠球藻 (Nannochloris sp·)，衣藻屬(chlamydomonas sp.)，扁藻(Tetraselmis sp.)，空球藻屬 (Eudorina sp.)等。本發(fā)明中，所述的其特征是所述的微藻培養(yǎng)基包括但不限于BG-Il培養(yǎng)基、F/2 培養(yǎng)基、walne培養(yǎng)基、TAP培養(yǎng)基以及其他任何經(jīng)過修改的微藻培養(yǎng)基。本發(fā)明中所述的廢水包括，但不限于市政廢水、造紙廠廢水、糖蜜廢水、啤酒廠廢水等工業(yè)廢水、沼氣發(fā)酵廢水以及動(dòng)物糞便廢水。所述的能成球的真菌菌株包括，但不限于米根霉(lihizopus Oryzae)，變色木耳 (Anthracophy 1 Ium discolor),糙皮側(cè)耳(Pleurolus ostreatus),羊肚菌(Morchella sp.),產(chǎn)黃青霄(Penicillum chrysogenum),雙 包 (agaricus bisporus),毛 M 屬(Mucorcircillenous), ^ M M 9 (Mortierella isabellina), Φ ft β (Aspergillus phonecis)，里氏木霉(Trichoderma reesei)，黃抱平革菌(Phanerochaete chrysosporium)。本發(fā)明中，所述菌藻共生體的培養(yǎng)包含了為自養(yǎng)培養(yǎng)或異養(yǎng)培養(yǎng)的方法。接種真菌孢子數(shù)為IXio2 L—1至IXIOki ΙΛ PH范圍為0. 1-10，溫度范圍為4-45°C。異養(yǎng)培養(yǎng)基有機(jī)碳源濃度初始還原糖濃度范圍為0. 01-200 g. Γ1。本發(fā)明方法涉及的流程詳細(xì)描述如下。(1)微藻的轉(zhuǎn)接。從-70度冰箱取出凍存微藻藻株并用接種環(huán)刮取少許到固體斜面平板光照培養(yǎng)。所述的自養(yǎng)培養(yǎng)條件如下溫度控制在20-45°C的范圍內(nèi)，以為最佳；光照培養(yǎng)氮源如甘氨酸、酵母提取物等初始濃度介于1-15 g.L—1，優(yōu)選4 g.L—1，通入空氣或空氣與 CO2的混合氣體，通氣量50-300 L/h，優(yōu)選80-120L/h ；CO2濃度0. 9_3%。培養(yǎng)過程中采用 10-200 μ mol. HT2s-1的日光照射，pH值控制在5-9之間，以7. O為佳；總培養(yǎng)時(shí)間視細(xì)胞生長情況而定，一般介于50-400小時(shí)，優(yōu)選120-200小時(shí)。所述的異養(yǎng)培養(yǎng)條件如下有機(jī)碳源如葡萄糖濃度0. 01-200 g. L—1，優(yōu)選20 g. L—1 ；通入空氣，通氣量100-400 L/h，優(yōu)選150-250L/h ；培養(yǎng)過程中采用5-40 μ mol. πΓ、—1 的日光照射，PH值控制在5-9之間，以7. O為佳；總培養(yǎng)時(shí)間視細(xì)胞生長情況而定，一般介于72-200小時(shí)，優(yōu)選100-150小時(shí)。(2)微藻的高密度培養(yǎng)。將平板培養(yǎng)物接種至生物反應(yīng)器培養(yǎng)，在異養(yǎng)培養(yǎng)基中高密度培養(yǎng)；生物反應(yīng)裝置包括搖瓶、通氣瓶、光生物反應(yīng)器、發(fā)酵罐和開放培養(yǎng)池。在上述適宜條件培養(yǎng)，直到細(xì)胞對(duì)數(shù)生長期，細(xì)胞密度達(dá)到(IO6-IOki以上)。所述的自養(yǎng)培養(yǎng)條件如下溫度控制在20-45°C的范圍內(nèi)，以為最佳；光照培養(yǎng)氮源如甘氨酸、酵母提取物等初始濃度介于1-15 g.L—1，優(yōu)選4 g.L—1，通入空氣或空氣與 CO2的混合氣體，通氣量50-300 L/h,優(yōu)選80-120L/h ；CO2濃度0. 9_3%。培養(yǎng)過程中采用
410-200 μ mol. HT2s-1的日光照射，pH值控制在5-9之間，以7. 0為佳；總培養(yǎng)時(shí)間視細(xì)胞生長情況而定，一般介于50-400小時(shí)，優(yōu)選120-200小時(shí)。所述的異養(yǎng)培養(yǎng)條件如下有機(jī)碳源如葡萄糖濃度0. 01-200 g. L—1，優(yōu)選20 g. L—1 ；通入空氣，通氣量100-400 L/h，優(yōu)選150-250L/h ；培養(yǎng)過程中采用5-40 μ mol. πΓ、—1 的日光照射，PH值控制在5-9之間，以7. 0為佳；總培養(yǎng)時(shí)間視細(xì)胞生長情況而定，一般介于72-200小時(shí)，優(yōu)選100-150小時(shí)。(3)能成球的真菌的孢子的培養(yǎng)。從-70度冰箱取出凍存真菌菌株并用接種環(huán)刮取少許到固體平板培養(yǎng)4-7天，然后用無菌水反復(fù)沖洗獲得新鮮的真菌孢子。(4)添加新鮮孢子懸浮液到微藻培養(yǎng)基中在微藻細(xì)胞培養(yǎng)到細(xì)胞對(duì)數(shù)生長期， 細(xì)胞密度達(dá)到(IO6-IOki以上)，向微藻的培養(yǎng)基中添加一定數(shù)量的真菌孢子。以海棗曲霉 {Aspergillus.分)為例，添加IXlO2 L—1至IXIOki L—1的新鮮孢子到微藻的培養(yǎng)基中，優(yōu)選IXlO4 L—1的真菌孢子濃度并以微藻異養(yǎng)的條件培養(yǎng)。為防止微藻與真菌共生成球的過程中引起的雜菌污染，所有操作均在無菌工作臺(tái)中進(jìn)行。(5)真菌介導(dǎo)微藻細(xì)胞固定化。優(yōu)化培養(yǎng)條件，致使直至所有微藻與真菌形成微藻共生的球體。形成微藻共生球體的微藻，用簡單的過濾方法進(jìn)行微藻收獲。(6)固定化的微藻細(xì)胞用來處理各種廢水。收獲的固定化微藻用來處理各種來源的廢水，包括工業(yè)廢水、沼氣發(fā)酵廢水以及動(dòng)物糞便廢水。上述異養(yǎng)培養(yǎng)基配方為=K2HPO4· 3H20 0. 04g/L, MgSO4 · 7H20 0. 075g/L, CaCl2· 2H20 0.036g/L, Citric acid 0.006g/L, Ferric ammonium citrate 0.006g/L, EDTA 0. OOlg/L, NaNO3 1. 5g/L，Na2CO3 0. 02g/L, A5 微量元素液 1. 5ml/L，其中 A5 微量元素液組成H3B03 2. 86g/L, MnCl2 · 4H20 1. 81g/L, ZnSO4 · 7H20 0. 222g/L, NaMoO4 · 2H20 0. 39g/ L，CuSO4 · 5H20 0. 079g/L和CoCl2 · 6H20 0. 05g/L,并加入有機(jī)碳源至初始還原糖濃度為 0. 01-200g. Γ1 ；優(yōu)選范圍在 1-20 g. I71。本發(fā)明是通過在即將收獲的微藻培養(yǎng)基中引用能成球的真菌菌株并混合培養(yǎng)，從而達(dá)到真菌-微藻共生并成球的目的，最后通過簡單的過濾方法即可收獲真菌介導(dǎo)的固定化微藻細(xì)胞(如圖1所示)，然后采用該種微藻固定化技術(shù)高效處理廢水并可通過簡單過濾方法回收固定化細(xì)胞及凈化廢水。該工藝可以用來進(jìn)一步滿足大規(guī)模工業(yè)化廢水處理并大大降低成本。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明引入了真菌介導(dǎo)的微藻固定化技術(shù)，用來處理廢水。處理完的廢水又可以回收利用，滿足了微藻工業(yè)化處理廢水應(yīng)用的要求，是一條經(jīng)濟(jì)、 高效地制微藻污水處理的新途徑。


圖1為真菌介導(dǎo)的微藻固定化細(xì)胞圖。圖2為真菌介導(dǎo)的固定化微藻去除高濃度市政廢水中的氨態(tài)氮效果圖。圖3為真菌介導(dǎo)的固定化微藻去除高濃度市政廢水中的全磷效果圖。
圖4為真菌介導(dǎo)的固定化微藻去除高濃度市政廢水中的COD效果圖。圖5為真菌介導(dǎo)的固定化微藻去除高濃度市政廢水中的全氮效果圖。圖6為真菌介導(dǎo)的固定化微藻去除養(yǎng)殖豬糞廢水中的氨態(tài)氮效果圖。圖7為真菌介導(dǎo)的固定化微藻去除養(yǎng)殖豬糞廢水中的COD效果圖。圖8為真菌介導(dǎo)的固定化微藻去除養(yǎng)殖豬糞廢水中的全磷效果圖。圖9為真菌介導(dǎo)的固定化微藻去除養(yǎng)殖豬糞廢水中的全氮效果圖。圖10為真菌介導(dǎo)的微藻固定化細(xì)胞處理養(yǎng)殖豬糞廢水前和處理后效果圖。圖11為另一真菌介導(dǎo)的微藻固定化細(xì)胞處理養(yǎng)殖豬糞廢水前和處理后效果圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明將通過以下實(shí)例作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1。含油藻株一小球藻(a^orWh ra^aris)本地篩選，其自養(yǎng)培養(yǎng)基配方如下。上述自養(yǎng)培養(yǎng)基配方為=K2HPO4· 3H20 0. 04g/L, MgSO4 · 7H20 0. 075g/L, CaCl2 · 2H20 0. 036g/L，檸檬酸 0. 006g/L，檸檬酸鐵銨 0. 006g/L，EDTA 0. OOlg/L, NaNO3 1. 5g/L，Na2CO3 0. 02g/L, A5 微量元素液 1. 5ml/L，其中 A5 微量元素液組成=H3BO3 2. 86g/L， MnCl2 · 4H20 1. 81g/L, ZnSO4 · 7H20 0. 222g/L, NaMoO4 · 2H20 0. 39g/L, CuSO4 · 5H20 0. 079g/ L，和 CoCl2 · 6H20 0. 05g/L。異養(yǎng)培養(yǎng)基配方同上，并加入有機(jī)碳源至初始還原糖濃度為15 g. Γ1。通過步驟1中所描述的方法，將生長在固體培養(yǎng)基上的小球藻單菌落接種至250 mL搖瓶中搖床培養(yǎng)，溫度控制在士5°C;當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長末期后，準(zhǔn)備接種真菌孢子。于_70°C冰箱中接種真菌孢子到固體平板培養(yǎng)中活化真菌菌株，然后用無菌水反復(fù)沖洗平板表面，獲得每升含有IXio6 L—1的新鮮海棗曲霉Uspar識(shí)7ΛΛ5.分)孢子，在液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)生成小球藻ipiolorella vulgaris)-海棗曲霉Us/wr^/Wm. Sp) 菌絲的菌藻共生球體(如圖1所示)。通過簡單的過濾方法收獲固定化的小球藻(a^orWh vulgaris)-海棗曲霉 {Aspergillus.分)菌絲的菌藻共生球體，并應(yīng)用高濃度市政廢水和豬糞廢水的處理。結(jié)果顯示這種真菌介導(dǎo)的固定化細(xì)胞具有高效的除氮、除磷及除COD的效果(如圖2-圖9所示)，并且還具有高效的吸附性(如圖10、圖11所示)。實(shí)施例2。 含油藻株一柵藻(Scenedesmus sp.)本地篩選，其自養(yǎng)培養(yǎng)基配方如下。上述自養(yǎng)培養(yǎng)基配方為=K2HPO4· 3H20 0. 04g/L, MgSO4 · 7H20 0. 075g/L, CaCl2 · 2H20 0. 036g/L，檸檬酸 0. 006g/L，檸檬酸鐵銨 0. 006g/L，EDTA 0. OOlg/L, NaNO3 1. 5g/L，Na2CO3 0. 02g/L, A5 微量元素液 1. 5ml/L，其中 A5 微量元素液組成=H3BO3 2. 86g/L， MnCl2 · 4H20 1. 81g/L, ZnSO4 · 7H20 0. 222g/L, NaMoO4 · 2H20 0. 39g/L, CuSO4 · 5H20 0. 079g/ L，和 CoCl2 · 6H20 0. 05g/L。異養(yǎng)培養(yǎng)基配方同上，并加入有機(jī)碳源至初始還原糖濃度為20 g. Γ1。通過步驟1中所描述的方法，將生長在固體培養(yǎng)基上的小球藻單菌落接種至250mL搖瓶中搖床培養(yǎng)，溫度控制在^rc 士5°c;當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長末期后，準(zhǔn)備接種真菌孢子。于_70°C冰箱中接種真菌孢子到固體平板培養(yǎng)中活化真菌菌株，然后用無菌水反復(fù)沖洗平板表面，獲得每升含有IXlO6 L—1的新鮮里氏木霉(Trichoderma reesei)孢子， 在液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)生成柵藻(Scenedesmus印.)-里氏木霉(Trichoderma reesei) 菌絲的菌藻共生球體。通過簡單的過濾方法收獲固定化的微藻真菌共生體，并可以應(yīng)用高濃度市政廢水、食品工業(yè)有機(jī)廢水和豬糞廢水的處理。
權(quán)利要求
1.一種真菌介導(dǎo)的微藻固定化廢水處理方法，其特征是包括以下步驟(1)微藻的轉(zhuǎn)接；(2)微藻的高密度培養(yǎng)；(3)能成球真菌的孢子的培養(yǎng)；(4)添加新鮮孢子懸浮液到微藻培養(yǎng)基中；(5)真菌介導(dǎo)微藻細(xì)胞固定化；(6)固定化的微藻細(xì)胞用來處理各種廢水。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種真菌介導(dǎo)的微藻固定化廢水處理方法，其特征是所述的微藻包括小球藻屬、筒柱藻屬、硅藻、菱形藻、裂壺藻、杜氏藻屬、柵藻、微綠球藻、衣藻屬、扁藻、空球藻屬。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種真菌介導(dǎo)的微藻固定化廢水處理方法，其特征是所述的微藻培養(yǎng)基包括BG-Il培養(yǎng)基、F/2培養(yǎng)基、walne培養(yǎng)基、TAP培養(yǎng)基，以及其他任何經(jīng)過修改的微藻培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種真菌介導(dǎo)的微藻固定化廢水處理方法，其特征是所述的廢水包括市政廢水、工業(yè)廢水、沼氣發(fā)酵廢水以及動(dòng)物糞便廢水。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種真菌介導(dǎo)的微藻固定化廢水處理方法，其特征在于，所述的能成球的真菌菌株包括米根霉、變色木耳、糙皮側(cè)耳、羊肚菌、產(chǎn)黃青霉、雙孢蘑菇、毛霉屬、深黃被孢霉、海棗曲霉、里氏木霉、黃孢平革菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種真菌介導(dǎo)的微藻固定化廢水處理方法，其特征是所述菌藻共生體的培養(yǎng)包含了為自養(yǎng)培養(yǎng)或異養(yǎng)培養(yǎng)的方法。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種真菌介導(dǎo)的微藻固定化廢水處理方法，其特征是所述接種所述能成球的真菌的孢子數(shù)為IXlO2 L—1至IXIOki L—1。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述一種真菌介導(dǎo)的微藻固定化廢水處理方法，其特征在于，所述的自養(yǎng)培養(yǎng)條件如下溫度控制在20-45°C的范圍內(nèi)，光照培養(yǎng)氮源甘氨酸或酵母提取物的初始濃度介于1-15 g.L—1，通入空氣或空氣與CO2的混合氣體，通氣量50-300 L/h，0)2濃度0. 9-3% ；培養(yǎng)過程中采用10-200 μ mol. JiT2iT1的日光照射，pH值控制在5_9之間；總培養(yǎng)時(shí)間介于50-400小時(shí)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述一種真菌介導(dǎo)的微藻固定化廢水處理方法，其特征在于，所述的自養(yǎng)培養(yǎng)條件如下溫度控制在^°C，光照培養(yǎng)氮源甘氨酸或酵母提取物的初始濃度為 4 g. L—1，空氣或空氣與(X)2的混合氣體的通氣量為80-120L/h，培養(yǎng)過程中pH值為7. 0，總培養(yǎng)時(shí)間為120-200小時(shí)。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述一種真菌介導(dǎo)的微藻固定化廢水處理方法，其特征在于，所述的異養(yǎng)培養(yǎng)條件如下有機(jī)碳源葡萄糖濃度0. 01-200 g. L—1，通入空氣，通氣量100-400 L/ h，培養(yǎng)過程中采用5-40 μ mol. πΓ、—1的日光照射，pH值控制在5_9之間，總培養(yǎng)時(shí)間介于 72-200 小時(shí)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述一種真菌介導(dǎo)的微藻固定化處理廢水的方法，其特征在于， 所述的異養(yǎng)培養(yǎng)條件如下有機(jī)碳源葡萄糖濃度為20 g. Γ1 ；通氣量為150-250L/h，培養(yǎng)過程中PH值為7. 0總培養(yǎng)時(shí)間為100-150小時(shí)。
全文摘要
一種真菌介導(dǎo)的微藻固定化廢水處理方法，其特征是包括以下步驟(1)微藻的轉(zhuǎn)接；(2)微藻的高密度培養(yǎng)；(3)能成球真菌的孢子的培養(yǎng)；(4)添加新鮮孢子懸浮液到微藻培養(yǎng)基中；(5)真菌介導(dǎo)微藻細(xì)胞固定化；(6)固定化的微藻細(xì)胞用來處理各種廢水。本發(fā)明引入了真菌介導(dǎo)的微藻固定化技術(shù)，用來處理廢水，處理完的廢水可回收利用，滿足了微藻工業(yè)化處理廢水應(yīng)用的要求，是一條經(jīng)濟(jì)、高效地制微藻污水處理的新途徑。
文檔編號(hào)C12N1/14GK102442726SQ20111032965
公開日2012年5月9日 申請(qǐng)日期2011年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月26日
發(fā)明者劉玉環(huán), 周文廣, 李筠, 林向陽, 程艷玲, 阮榕生 申請(qǐng)人:南昌大學(xué)