專利名稱：一種真菌介導(dǎo)的微藻收獲的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于可再生生物能源領(lǐng)域，特別涉及一種真菌介導(dǎo)微藻收獲的新工藝。具體說(shuō)來(lái)就是首先讓微藻細(xì)胞在光合自養(yǎng)或異養(yǎng)條件下生長(zhǎng)；然后在細(xì)胞生長(zhǎng)的不同時(shí)期導(dǎo)入能成球的真菌孢子，并控制培養(yǎng)條件，最終形成大顆粒的菌藻球體，進(jìn)而利用簡(jiǎn)單的過(guò)濾方法收獲微藻并用于生物能源生產(chǎn)的過(guò)程。
背景技術(shù)：
微藻是一種能進(jìn)行光合作用的微生物。它可以利用污水中的小分子有機(jī)物和無(wú)機(jī)養(yǎng)分，吸收空氣中大量的CO2,并合成脂肪，通過(guò)收集加工可提煉成生物柴油供汽車、火車作為動(dòng)力燃料，進(jìn)一步加工還可作為航空燃料，供飛機(jī)使用。微藻在生物燃料開(kāi)發(fā)方面具有如下明顯優(yōu)勢(shì)一是微藻可以利用邊際土地不與農(nóng)田爭(zhēng)地；二是微藻能在咸水、污水中生長(zhǎng)， 不僅可以節(jié)約大量淡水，而且還能凈化污水；三是微藻生產(chǎn)潛力驚人，繁殖速度比高等植物快40倍。所以，微藻規(guī)模化養(yǎng)殖在溫室氣體減排、應(yīng)對(duì)全球氣候變暖，和低成本生產(chǎn)可再生生物質(zhì)能源方面都有著很大的潛力。但是，迄今為止，利用微藻生產(chǎn)生物能源例如生物柴油仍然存在許多迄待解決的問(wèn)題，其中一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題是還缺乏微藻的低成本高效率收獲技術(shù)。由于微藻的細(xì)胞很小(直徑約2-70 Mffl)，到目前為止，尚未開(kāi)發(fā)出一種高效且經(jīng)濟(jì)可行的微藻大規(guī)模收獲技術(shù)。傳統(tǒng)的微藻收獲方法主要包括氣浮、離心、添加絮凝劑沉降、 濾膜過(guò)濾等，然而以上這些方法要么能耗過(guò)大，成本太高，要么不適用大規(guī)生產(chǎn)應(yīng)用。因此急需開(kāi)發(fā)一種高效且經(jīng)濟(jì)可行的微藻收獲方法。阮榕生課題組首次以從環(huán)境中篩選的幾十株真菌菌株為材料，率先開(kāi)展了利用真菌介導(dǎo)微藻成球從而幫助微藻收獲的研究。目前，通過(guò)建立高通量篩選模型，已經(jīng)篩選出十幾株能輔助微藻成球的真菌菌株并優(yōu)化了菌藻共生成球的培養(yǎng)條件，大大提高微藻收獲效率(到達(dá)100%)。該方法簡(jiǎn)單高效，成本低廉，大大降低了微藻收獲成本，為微藻生物能源產(chǎn)業(yè)化邁出了堅(jiān)實(shí)的一步。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于開(kāi)發(fā)一種真菌介導(dǎo)的微藻收獲的新工藝。通過(guò)引入能成球的真菌孢子，形成真菌-微藻共生的大顆粒球體，從而從而開(kāi)發(fā)一種新型簡(jiǎn)單高效、成本低廉的微藻收獲方法。所述真菌介導(dǎo)的真菌介導(dǎo)的微藻收獲方法是以在生物反應(yīng)器中高密度培養(yǎng)微藻細(xì)胞，然后在細(xì)胞生長(zhǎng)的不同時(shí)期導(dǎo)入能成球的真菌的孢子并控制培養(yǎng)獲得真菌介導(dǎo)的菌藻球體，進(jìn)而利用簡(jiǎn)單的過(guò)濾方法收獲微藻并用于生物能源生產(chǎn)的過(guò)程。所述的一種真菌介導(dǎo)微藻收獲的新工藝按照如下步驟進(jìn)行(1)微藻的轉(zhuǎn)接；(2) 微藻的高密度培養(yǎng)；(3)能成球的真菌的孢子的培養(yǎng)；(4)添加新鮮孢子懸浮液到微藻培養(yǎng)基中；(5)真菌介導(dǎo)的大顆粒菌藻共生體形成；(6)用過(guò)濾方法收獲大顆粒菌藻共生體。所述的微藻細(xì)胞包括但不限于小球藻屬(chlorella sp.)，筒柱藻屬(cylindrothecasp.)，娃藻(diatom)，菱形藻(Nitzschia sp.)，裂壺藻(schizochytrium sp.)，杜氏藻屬 (dunaliella)，柵藻(Scenedesmus sp·)，微綠球藻(Nannochloris sp·)，衣藻屬(chlamydomonas sp·)，扁藻(Tetraselmis sp·)，空球藻屬(Eudorina sp.)等。所述的微藻培養(yǎng)基包括但不限于BG-Il培養(yǎng)基、F/2培養(yǎng)基、ralne培養(yǎng)基、TAP 培養(yǎng)基以及其他任何經(jīng)過(guò)修改的微藻培養(yǎng)基。所述的能成球的真菌菌株包括，但不限于米根霉(Rhizopus Oryzae)，變色木耳 (Anthracophy 1 Ium discolor)，糙皮側(cè)耳(Pleurolus ostreatus)，羊肚菌(Morchella sp.),產(chǎn)黃青霉(Penicillum chrysogenum)，雙抱蘑 (agaricus bisporus)，毛 M 屬(Mucorcircillenous), U Hβ (Mortierella isabellina), ^ Φ ft β (Aspergillus phonecis)，里氏木霉(Trichoderma reesei)，黃抱平革菌(Phanerochaete chrysosporium)0本發(fā)明中，所述菌藻共生體的培養(yǎng)包含了為自養(yǎng)培養(yǎng)或異養(yǎng)培養(yǎng)的方法。接種真菌孢子數(shù)為IXio2 L—1至IXIOki ΙΛ PH范圍為0. 1-10，溫度范圍為4-45°C。異養(yǎng)培養(yǎng)基有機(jī)碳源濃度初始還原糖濃度范圍為0. 01-200 g. Γ1。本發(fā)明內(nèi)容涉及的技術(shù)流程及方法步驟詳細(xì)描述如下。(1)微藻的轉(zhuǎn)接。從-70度冰箱取出凍存微藻藻株并用接種環(huán)刮取少許到固體斜面平板光照培養(yǎng)。所述的自養(yǎng)培養(yǎng)條件如下溫度控制在20-45°C的范圍內(nèi)，以為最佳；光照培養(yǎng)氮源如甘氨酸、酵母提取物等初始濃度介于1-15 g.L—1，優(yōu)選4 g.L—1，通入空氣或空氣與 CO2的混合氣體，通氣量50-300 L/h，優(yōu)選80-120L/h ；CO2濃度0. 9_3%。培養(yǎng)過(guò)程中采用 10-200 μ mol. HT2s-1的日光照射，pH值控制在5-9之間，以7. O為佳；總培養(yǎng)時(shí)間視細(xì)胞生長(zhǎng)情況而定，一般介于50-400小時(shí)，優(yōu)選120-200小時(shí)。所述的異養(yǎng)培養(yǎng)條件如下有機(jī)碳源如葡萄糖濃度0. 01-200 g. L—1，優(yōu)選20 g. L—1 ；通入空氣，通氣量100-400 L/h，優(yōu)選150-250L/h ；培養(yǎng)過(guò)程中采用5-40 μ mol. πΓ、—1 的日光照射，PH值控制在5-9之間，以7. 0為佳；總培養(yǎng)時(shí)間視細(xì)胞生長(zhǎng)情況而定，一般介于72-200小時(shí)，優(yōu)選100-150小時(shí)。(2)微藻的高密度培養(yǎng)。將平板培養(yǎng)物接種至生物反應(yīng)器培養(yǎng)，在異養(yǎng)培養(yǎng)基中高密度培養(yǎng)；生物反應(yīng)裝置包括搖瓶、通氣瓶、光生物反應(yīng)器、發(fā)酵罐和開(kāi)放培養(yǎng)池。在上述適宜條件培養(yǎng)，直到細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞密度達(dá)到(IO6-IOki以上)。所述的自養(yǎng)培養(yǎng)條件如下溫度控制在20-45°C的范圍內(nèi)，以為最佳；光照培養(yǎng)氮源如甘氨酸、酵母提取物等初始濃度介于1-15 g.L—1，優(yōu)選4 g.L—1，通入空氣或空氣與 CO2的混合氣體，通氣量50-300 L/h,優(yōu)選80-120L/h ；CO2濃度0. 9_3%。培養(yǎng)過(guò)程中采用 10-200 μ mol. HT2s-1的日光照射，pH值控制在5-9之間，以7. 0為佳；總培養(yǎng)時(shí)間視細(xì)胞生長(zhǎng)情況而定，一般介于50-400小時(shí)，優(yōu)選120-200小時(shí)。所述的異養(yǎng)培養(yǎng)條件如下有機(jī)碳源如葡萄糖濃度0. 01-200 g. L—1，優(yōu)選20 g. L—1 ；通入空氣，通氣量100-400 L/h，優(yōu)選150-250L/h ；培養(yǎng)過(guò)程中采用5-40 μ mol. πΓ、—1 的日光照射，PH值控制在5-9之間，以7. 0為佳；總培養(yǎng)時(shí)間視細(xì)胞生長(zhǎng)情況而定，一般介于72-200小時(shí)，優(yōu)選100-150小時(shí)。
(3)能成球的真菌的孢子的培養(yǎng)。從-70度冰箱取出凍存真菌菌株并用接種環(huán)刮取少許到固體平板培養(yǎng)4-7天，然后用無(wú)菌水反復(fù)沖洗獲得新鮮的真菌孢子。(4)添加新鮮孢子懸浮液到微藻培養(yǎng)基中在微藻細(xì)胞培養(yǎng)到細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期， 細(xì)胞密度達(dá)到(IO6-IOki以上)，向微藻的培養(yǎng)基中添加一定數(shù)量的真菌孢子。以海棗曲霉 {Aspergillus. Sp.)為例，添加1 X IO2 L—1至1 X 101° L—1的新鮮孢子到微藻的培養(yǎng)基中， 優(yōu)選IXlO4 L—1的真菌孢子濃度并以微藻異養(yǎng)的條件培養(yǎng)。為防止微藻與真菌共生成球的過(guò)程中引起的雜菌污染，所有操作均在無(wú)菌工作臺(tái)中進(jìn)行。(5)真菌介導(dǎo)的大顆粒菌藻共生體形成。優(yōu)化培養(yǎng)條件，直至所有微藻與真菌形成大顆粒菌藻共生的球體。(6)用簡(jiǎn)單的過(guò)濾方法收獲大顆粒菌藻共生球體，并用于并用于生物能源生產(chǎn)。上述異養(yǎng)培養(yǎng)基配方為=K2HPO4· 3H20 0. 04g/L, MgSO4 · 7H20 0. 075g/L, CaCl2· 2H20 0.036g/L, Citric acid 0.006g/L, Ferric ammonium citrate 0.006g/L, EDTA 0. OOlg/L, NaNO3 1. 5g/L，Na2CO3 0. 02g/L, A5 微量元素液 1. 5ml/L，其中 A5 微量元素液組成H3B03 2. 86g/L, MnCl2 · 4H20 1. 81g/L, ZnSO4 · 7H20 0. 222g/L, NaMoO4 · 2H20 0. 39g/ L，CuSO4 · 5H20 0. 079g/L和CoCl2 · 6H20 0. 05g/L,并加入有機(jī)碳源至初始還原糖濃度為 0. 01-200g. Γ1 ；優(yōu)選范圍在 1-20 g. I71。本發(fā)明是通過(guò)在即將收獲的微藻培養(yǎng)基中引用能成球的真菌菌株并混合培養(yǎng)，從而達(dá)到真菌-微藻共生并成球的目的(如圖1-圖8所示)，最后通過(guò)簡(jiǎn)單的過(guò)濾方法即可收獲真菌介導(dǎo)的大顆粒菌藻共生體并用于生物能源生產(chǎn)。本發(fā)明的有益效果在于引入了真菌介導(dǎo)的菌藻共生成球機(jī)制。該工藝有效地控制了微藻收集的成本，滿足了微藻生物柴油工業(yè)化應(yīng)用的要求，是一條經(jīng)濟(jì)、高效地制微藻收獲的新途徑。


圖1真菌-微藻共生機(jī)制模式圖。
圖2成球真菌在固體斜面培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀態(tài)圖。
圖3成球真菌在固體平板培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀態(tài)圖。
圖4成球真菌液態(tài)培養(yǎng)成球狀態(tài)圖。
圖5液態(tài)培養(yǎng)基中微藻生長(zhǎng)狀態(tài)圖。
圖6向微藻液態(tài)培養(yǎng)體系中接種成球真菌孢子前期菌藻共生狀態(tài)圖。
圖7真菌與微藻共生成球中期狀態(tài)圖。
圖8真菌與微藻完全共生成球狀態(tài)圖。
圖9真菌介導(dǎo)微藻收獲并制備生物能源示意圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明將通過(guò)以下實(shí)例作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例1。含油藻株一小球藻(aWordh ra^aris)本地篩選，其自養(yǎng)培養(yǎng)基配方如下。
上述自養(yǎng)培養(yǎng)基配方為=K2HPO4· 3H20 0. 04g/L, MgSO4 · 7H20 0. 075g/L, CaCl2 · 2H20 0. 036g/L，檸檬酸 0. 006g/L，檸檬酸鐵銨 0. 006g/L，EDTA 0. OOlg/L, NaNO3 1. 5g/L，Na2CO3 0. 02g/L, A5 微量元素液 1. 5ml/L，其中 A5 微量元素液組成=H3BO3 2. 86g/L， MnCl2 · 4H20 1. 81g/L, ZnSO4 · 7H20 0. 222g/L, NaMoO4 · 2H20 0. 39g/L, CuSO4 · 5H20 0. 079g/ L，和 CoCl2 · 6H20 0. 05g/L。異養(yǎng)培養(yǎng)基配方同上，并加入有機(jī)碳源至初始還原糖濃度為20 g. Γ1。通過(guò)步驟1中所描述的方法，將生長(zhǎng)在固體培養(yǎng)基上的小球藻強(qiáng)勢(shì)單株群落接種至250 mL搖瓶中搖床培養(yǎng)，溫度控制在士5°C ；當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期后，準(zhǔn)備接種真菌孢子。于-70°C冰箱中接種海棗曲霉(As/^r^/Bm. Sp.)孢子到固體平板培養(yǎng)基中活化真菌菌株，然后用無(wú)菌水反復(fù)沖洗平板表面，獲得每升含有IXio6 L—1的新鮮海棗曲霉 {Aspergillus. Sp.)孢子，在液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)生成大顆粒的小球藻WholorelIa vulgaris)-海棗曲霉(Aspergillus. Sp )菌絲的菌藻共生球體(如圖8所示)。通過(guò)簡(jiǎn)單的過(guò)濾方法收獲固定化的小球藻(a^orWh vulgaris)-海棗曲霉 {Aspergillus. Sp)菌絲的菌藻共生球體，并以豬糞廢水過(guò)濾液作為培養(yǎng)基規(guī)模化擴(kuò)大培養(yǎng)，連續(xù)收獲的大顆粒菌藻共生體用于生物柴油的生產(chǎn)。豬糞廢水過(guò)濾液得到凈化處理。本發(fā)明應(yīng)用效果如圖9所示。實(shí)施例2。含油藻株一柵藻(Scenedestnus sp.)本地篩選，其自養(yǎng)培養(yǎng)基配方如下。上述自養(yǎng)培養(yǎng)基配方為=K2HPO4· 3H20 0. 04g/L, MgSO4 · 7H20 0. 075g/L, CaCl2 · 2H20 0. 036g/L，檸檬酸 0. 006g/L，檸檬酸鐵銨 0. 006g/L，EDTA 0. OOlg/L, NaNO3 1. 5g/L，Na2CO3 0. 02g/L, A5 微量元素液 1. 5ml/L，其中 A5 微量元素液組成=H3BO3 2. 86g/L， MnCl2 · 4H20 1. 81g/L, ZnSO4 · 7H20 0. 222g/L, NaMoO4 · 2H20 0. 39g/L, CuSO4 · 5H20 0. 079g/ L，和 CoCl2 · 6H20 0. 05g/L。異養(yǎng)培養(yǎng)基配方同上，并加入有機(jī)碳源至初始還原糖濃度為22 g.L—1。通過(guò)步驟1中所描述的方法，將生長(zhǎng)在固體培養(yǎng)基上的小球藻強(qiáng)勢(shì)單株群落接種至250 mL搖瓶中搖床培養(yǎng)，溫度控制在士5°C ；當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期后，準(zhǔn)備接種真菌孢子。于_70°C冰箱中接種里氏木霉(Jrichoderma reesei)孢子到固體平板培養(yǎng)基中活化真菌菌株，然后用無(wú)菌水反復(fù)沖洗平板表面，獲得每升含有ι χ IO6 L—1的新鮮里氏木霉 (Jrichoderma reesei)孢子，在液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)生成大顆粒的小球藻Wholorella vulgaris)-里氏木霉ijrichoderma reesei)菌絲的菌藻共生球體(如圖8所示)。通過(guò)簡(jiǎn)單的過(guò)濾方法收獲固定化的柵藻r&e/^i/M^AS 5/7.」-里氏木霉 {Trichoderma reesei)菌絲的菌藻共生球體，并以啤酒廠有機(jī)廢水作為培養(yǎng)基規(guī)?；瘮U(kuò)大培養(yǎng)，連續(xù)收獲的大顆粒菌藻共生體用于生物柴油的生產(chǎn)。啤酒廠有機(jī)廢水得到凈化處理。 本發(fā)明應(yīng)用效果如圖9所示。
權(quán)利要求
1.一種真菌介導(dǎo)的微藻收獲方法，其特征是包括以下步驟(1)微藻的轉(zhuǎn)接；(2)微藻的高密度培養(yǎng)；(3)能成球的真菌的孢子的培養(yǎng)；(4)添加新鮮孢子懸浮液到微藻培養(yǎng)基中；(5)真菌介導(dǎo)的大顆粒菌藻共生體形成；(6)用過(guò)濾方法收獲大顆粒菌藻共生體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種真菌介導(dǎo)的微藻收獲方法，其特征是所述的微藻包括小球藻屬、筒柱藻屬、硅藻、菱形藻、裂壺藻、杜氏藻屬、柵藻、微綠球藻、衣藻屬、扁藻、空球藻 jM ο
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種真菌介導(dǎo)的微藻收獲方法，其特征是所述的微藻培養(yǎng)基包括BG-Il培養(yǎng)基、F/2培養(yǎng)基、walne培養(yǎng)基、TAP培養(yǎng)基，以及其他任何經(jīng)過(guò)修改的微藻培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種真菌介導(dǎo)的微藻收獲方法，其特征在于，所述的能成球的真菌菌株包括米根霉、變色木耳、糙皮側(cè)耳、羊肚菌、產(chǎn)黃青霉、雙孢蘑菇、毛霉屬、深黃被孢霉、海棗曲霉、里氏木霉、黃孢平革菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種真菌介導(dǎo)的微藻收獲方法，其特征是所述菌藻共生體的培養(yǎng)包含了為自養(yǎng)培養(yǎng)或異養(yǎng)培養(yǎng)的方法。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種真菌介導(dǎo)的微藻收獲方法，其特征是所述接種所述能成球的真菌的孢子數(shù)為IXlO2 L—1至IXIOiq L-1。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述一種真菌介導(dǎo)的微藻收獲方法，其特征在于，所述的自養(yǎng)培養(yǎng)條件如下溫度控制在20-45°C的范圍內(nèi)，光照培養(yǎng)氮源甘氨酸或酵母提取物的初始濃度介于1-15 g. L—1，通入空氣或空氣與CO2的混合氣體，通氣量50-300 L/h，CO2濃度0. 9-3% ； 培養(yǎng)過(guò)程中采用IOjOOym0LnT2s-1的日光照射，pH值控制在5-9之間；總培養(yǎng)時(shí)間介于 50-400 小時(shí)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述一種真菌介導(dǎo)的微藻收獲方法，其特征在于，所述的自養(yǎng)培養(yǎng)條件如下溫度控制在^°C，光照培養(yǎng)氮源甘氨酸或酵母提取物的初始濃度為4 g. L—1，空氣或空氣與(X)2的混合氣體的通氣量為80-120L/h，培養(yǎng)過(guò)程中pH值為7. 0，總培養(yǎng)時(shí)間為 120-200 小時(shí)。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述一種真菌介導(dǎo)的微藻收獲方法，其特征在于，所述的異養(yǎng)培養(yǎng)條件如下有機(jī)碳源葡萄糖濃度0. 01-200 g.廠1，通入空氣，通氣量100-400 L/h，培養(yǎng)過(guò)程中采用5-40 μ mol. m^s"1的日光照射，pH值控制在5_9之間，總培養(yǎng)時(shí)間介于72-200小時(shí)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述一種真菌介導(dǎo)的微藻收獲方法，其特征在于，所述的異養(yǎng)培養(yǎng)條件如下有機(jī)碳源葡萄糖濃度為20 g. Γ1 ；通氣量為150-250L/h，培養(yǎng)過(guò)程中pH值為 7. 0，總培養(yǎng)時(shí)間為100-150小時(shí)。
全文摘要
一種真菌介導(dǎo)的微藻收獲方法，其特征是包括以下步驟(1)微藻的轉(zhuǎn)接；(2)微藻的高密度培養(yǎng)；(3)能成球的真菌的孢子的培養(yǎng)；(4)添加新鮮孢子懸浮液到微藻培養(yǎng)基中；(5)真菌介導(dǎo)的大顆粒菌藻共生體形成；(6)用過(guò)濾方法收獲大顆粒菌藻共生體。本發(fā)明是通過(guò)在即將收獲的微藻培養(yǎng)基中引用能成球的真菌菌株并混合培養(yǎng)，從而達(dá)到真菌-微藻共生并成球的目的，最后通過(guò)簡(jiǎn)單的過(guò)濾方法即可收獲真菌介導(dǎo)的大顆粒菌藻共生體。
文檔編號(hào)C12N1/12GK102391953SQ20111032921
公開(kāi)日2012年3月28日 申請(qǐng)日期2011年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月26日
發(fā)明者劉玉環(huán), 周文廣, 李筠, 林向陽(yáng), 程艷玲, 阮榕生 申請(qǐng)人:南昌大學(xué)