專利名稱：提高牛的瘦肉率、肌間脂肪含量和生殖能力的轉(zhuǎn)基因載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提高牛的瘦肉率、肌間脂肪含量和生殖能力的轉(zhuǎn)基因載體。
背景技術(shù)：
牛肉作為中國人民的主要肉類食品之一，保證全國人民有充足的、優(yōu)質(zhì)的牛肉供應(yīng)是關(guān)系到人民日常生活的重要事件。而隨著人口的增長和人民生活水平的提高，除了對牛肉的需求量增加以外，對牛肉的質(zhì)量和口感的要求也提高了。上海浦東國際機(jī)場就曾發(fā)現(xiàn)從日本走私運(yùn)入價(jià)值一百萬余元、八百多公斤的頂級和牛肉(又稱雪花牛肉)，由此可見中國對高檔肉類產(chǎn)品的消費(fèi)需求。因此，有必要建立和改良中國自己的牛的品種，改善牛肉口感和質(zhì)量，以滿足人民群眾的生活需求。前面提到的頂級和牛肉的特點(diǎn)是肉色艷麗，脂肪有如大理石花紋般分布在肌肉內(nèi)，可比秋季降霜時(shí)的美麗，而且由于肌肉中富含脂肪，入口柔融欲化，風(fēng)味鮮美。因此，可通過降低牛全身的脂肪含量來提高瘦肉率，同時(shí)，增加肌肉中的脂肪含量來改善牛肉的口感和品質(zhì)。在肌肉中過表達(dá)PEPCK-C的(PEPCK-Cmus)轉(zhuǎn)基因小鼠有著令人吃驚和興奮的表型。首先，PEPCK-Cmus轉(zhuǎn)基因小鼠的運(yùn)動能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對照小鼠，可以以20米/分鐘的速度跑上5公里(對照小鼠在同樣的速度下只能跑0.2公里)。其次，PEPCK-Cmus轉(zhuǎn)基因小鼠的壽命遠(yuǎn)遠(yuǎn)長于對照小鼠，而且在30-35月時(shí)還能夠產(chǎn)下正常的小鼠后代(大多數(shù)小鼠在12-18月時(shí)就失去生殖能力了)。PEPCK-Cmus轉(zhuǎn)基因小鼠的高運(yùn)動能力可能與骨骼肌里的甘油三酯的增加有關(guān)。盡管PEPCK -Cmus轉(zhuǎn)基因小鼠全身的脂肪含量下降，不到對照小鼠脂肪含量的一半，但是PEPCK-Cmus轉(zhuǎn)基因小鼠比對照小鼠卻有更多的脂肪分布于骨骼肌中(Hakimi, P.et al.“Overexpression of the cytosolic form of phosphoenolpyruvatecarboxykinase(GTP) in skeletal muscle repatterns energy metabolism in themouse.”J Biol Chem，2007.282 (45):32844-32855)。PEPCK-Cmus 轉(zhuǎn)基因小鼠中低脂肪含量和高肌間脂肪含量的特點(diǎn)和頂級和牛肉的特性是類似的。基于PEPCK-Cmus轉(zhuǎn)基因小鼠的神奇表型，我們預(yù)期在牛的骨骼肌中過表達(dá)PEPCK-C可降低牛的脂肪含量，并在肉質(zhì)和口感上得到大幅度的提高，這樣的牛肉有著巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。大規(guī)模的生產(chǎn)PEPCK-Cnius轉(zhuǎn)基因牛有望填補(bǔ)國內(nèi)在高品質(zhì)牛肉的空白，豐富人民群眾的菜籃子，對提高人民群眾的生活質(zhì)量有重要的意義。而且PEPCK-C轉(zhuǎn)基因可提高小鼠的生殖能力，因此，PEPCK-Cmus轉(zhuǎn)基因牛很可能在繁殖能力上有所提高，在優(yōu)良品種的繁殖上有著廣泛的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種能提高牛的瘦肉率、肌間脂肪含量和生殖能力的轉(zhuǎn)基因載體。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
轉(zhuǎn)基因載體含有小鼠的肌酸激酶(muscle creatine kinase, MCK)增強(qiáng)子、2.7kb牛的a-骨骼肌肌動蛋白(a-skeletal actin)基因的啟動子、牛的PEPCK-C的cDNA和牛生長激素基因(bGH)的3’端不翻譯區(qū)域，且?guī)в胁溉閯游锛?xì)胞中篩選用的抗性基因一嘌呤霉素(Puromycin)基因和原核細(xì)胞中篩選用的抗性基因-博萊霉素(Zeocin)基因(見圖2)。2.7kb的a-骨骼肌肌動蛋白(a-skeletal actin)的啟動子可保證下游的基因在骨骼肌中特異表達(dá)，而且MCK增強(qiáng)子也具有肌肉組織特異性的增強(qiáng)子活性，可特異地促進(jìn)下游基因的高表達(dá)。在此轉(zhuǎn)基因載體中表達(dá)的是牛自身的PEPCK-C基因，所以從食品安全的角度講，對消費(fèi)者的健康沒有任何影響。此外，本發(fā)明在嘌呤霉素和博萊霉素抗性基因的兩端還加入LoxP序列，這樣，在PEPCK-C基因整合到基因組DNA后，如有需要，我們可通過表達(dá)Cre蛋白，誘導(dǎo)LoxP序列的重組，以除去抗性基因，進(jìn)一步保障轉(zhuǎn)基因動物的食品安全性。本發(fā)明所構(gòu)建的肌肉組織特異表達(dá)牛PEPCK-C的轉(zhuǎn)基因載體全序列如SEQID No:I所示。其中，第51-1919堿基為牛PEPCK-C編碼區(qū)，第2094-2307堿基為bGH 3’端不翻譯區(qū)，第2483-2516堿基為LoxP，第2872-3543堿基為嘌呤霉素抗性基因，第3601-3972堿基為博萊霉素(Zeocin)抗性基因，第3982-4015堿基為LoxP，第5489-5839堿基為MCK增強(qiáng)子，第6145-8892堿基為牛a -骨骼肌肌動蛋白基因的啟動子。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因載體可應(yīng)用于體細(xì)胞克隆，以構(gòu)建高瘦肉率、高肌間脂肪含量和高生殖能力的PEPCK-Cmus轉(zhuǎn)基因牛。


圖1是本發(fā)明的技術(shù)流程圖。 圖2是本發(fā)明構(gòu)建的PZT51轉(zhuǎn)基因載體的示意圖。
具體實(shí)施例方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。實(shí)施例1:插入 LoxP-Puro-Zeo-LoxP 片段,構(gòu)建 pZTl。將pO)NA3.1 (myc-His) a 載體(Invitrogen)用 PvuII 酶切，酶切體系為 2 ii g 質(zhì)粒DNA, 3 u I 10Xbuffer,2u I PvuII 酶，加入 ddH20 補(bǔ)足體積至 30 yl，37°C 溫浴 3 小時(shí).然后將酶切體系在I %的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出3.3kb大小的DNA條帶，用膠回收純化試劑盒純化DNA.具體步驟為，將紫外光下切下目的DNA條帶裝入1.5ml離心管中，稱重后加入3倍體積的溶膠液，55°C保溫10分鐘，使瓊脂糖凝膠完全融化；融化的凝膠待溫度降至室溫后，將混合液轉(zhuǎn)入附柱中，10，OOOg離心I分鐘，倒掉流出液；加入650 u I漂洗緩沖液，10，OOOg離心I分鐘，倒掉流出液；吸附柱再次離心，10，OOOg離心，I分鐘，倒掉流出液；將吸附柱轉(zhuǎn)移到一個新的1.5ml離心管中，加入50 u I ddH20，放置I分鐘，10，OOOg離心I分鐘收集純化產(chǎn)物.
從pSNAP載體用EcoRV酶切出LoxP-Puro-Zeo-LoxP片段，酶切體系為3 ii g質(zhì)粒DNA, 3 u I 10 X buffer, 2 u I EcoRV 酶，加入 ddH20 補(bǔ)足體積至 30 yl，37°C 溫浴 3 小時(shí)。然后將酶切體系在I %的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出1.7kb大小的DNA條帶，用膠回收純化試劑盒純化DNA.具體步驟同上。將pCDNA3.1 (myc-His) a (PvuII)和 LoxP-Puro-Zeo-LoxP (EcoRV)連接，連接反應(yīng)中加入2 ill載體，6 ill插入片段，I ill 10Xbuffer,l U I T4DNA連接酶，16°C溫浴16小時(shí)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coli的感受態(tài)細(xì)胞中。取一管50 ill的Trans5 a感受態(tài)細(xì)胞置于冰上，待其融化后，向其中加入4 Ul上述連接產(chǎn)物，輕彈混勻，后于冰上孵育30分鐘；42°C熱擊30秒，后冰上靜置10分鐘；加入500 u I無抗性的LB液體培養(yǎng)基，37°C震蕩培養(yǎng)I小時(shí)；4，OOOrpm離心5分鐘，吸走，保留IOOiU左右的培養(yǎng)基，用移液器將細(xì)菌沉淀吹打均勻后涂布在含氨節(jié)和博萊雙抗性的LB培養(yǎng)基平板上。然后將平板置于37°C溫箱培養(yǎng)16小時(shí)?？寺∩L出來后，挑單克隆菌落至3ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C震蕩培養(yǎng)12小時(shí)，提取質(zhì)粒DNA，用EcoRI酶切鑒定，陽性克隆中可得到2.9kb和2.0kb的兩條DNA條帶。再通過測序進(jìn)一步確定陽性克隆的正確性，得到的克隆即為PZT1。實(shí)施例2:插入牛a-骨骼肌肌動蛋白基因的啟動子DNA片段，構(gòu)建pZT2。將pZTl 用 PvuI 和 NdeI 雙酶切，酶切體系為 2iig 質(zhì)粒 DNA，3iil 10 X buffer,1.5 ill PvuI酶，1.5 ill NdeI酶，加入ddH20補(bǔ)足體積至30iil，37°C溫浴3小時(shí)。然后將酶切體系在I %的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出4.0kb大小的DNA條帶，用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。通過PCR擴(kuò)增得到2.7kb的牛a -骨骼肌肌動蛋白基因的啟動子DNA片段，PCR條件如下:lyl (約 IOOng)?；蚪M DNA，引物 I (ATG CCT CCT CAG CTCTCA AAC GG)和引物2 (TCA CAT CTG GCT GAT TCT CTG CTT C)的終濃度均為 0.5 u M, dNTPs 的終濃度為 0.2mM,5u I 10 X buffer, I u I HiFi Taq 酶，加入 ddH20 補(bǔ)足體積至 50 y I。PCR 循環(huán)為，95°C，2分鐘；接著是950C，30秒，550C，30秒，72。。，3分鐘，35個循環(huán)；72°C，5分鐘；4°C，保溫。將PCR產(chǎn)物在I %的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出2.7kb大小的DNA條帶，用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。將PCR擴(kuò)增得到的2.7kb的牛a -骨骼肌肌動蛋白基因的啟動子DNA片段通過TA克隆連接到pEASY-T3載體(全式金公司)上。Iyl pEASY_T3，加入4 2.7kb的牛a -骨骼肌肌動蛋白基因的啟動子DNA片段，250C，30分鐘。然后將連接反應(yīng)轉(zhuǎn)化到E.coli感受態(tài)細(xì)胞中，把轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布到含有IPTG和X-Gal以及氨芐青霉素的LB平板上生長。克隆生長出來后，挑白色的單克隆菌落至3ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C震蕩培養(yǎng)12小時(shí)，提取質(zhì)粒DNA，用EcoRI酶切鑒定，陽性克隆中可得到3.0kb和2.7kb的兩條DNA條帶。再通過測序進(jìn)一步確定陽性克隆的正確性，得到的克隆即為pLCNK3。從pLCNK3用PvuI和NdeI雙酶切以切出牛a -骨骼肌肌動蛋白基因的啟動子DNA，酶切體系為 g pLCNK3DNA, 3 u I 10 Xbuffer,1.5u I PvuI 酶，1.5 y I NdeI 酶，加入ddH20補(bǔ)足體積至30 u 1，37°C溫浴3小時(shí)。然后將酶切體系在I %的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出2.7kb大小的DNA條帶，用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。將pZTl (PvuI/NdeI)和牛a -骨骼肌肌動蛋白基因的啟動子DNA(PvuI/NdeI)連接，連接反應(yīng)同上。
將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coli的感受態(tài)細(xì)胞中。具體步驟同上，除了只用博萊霉素進(jìn)行抗性篩選?？寺∩L出來后，挑單克隆菌落至3ml含博萊霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C震蕩培養(yǎng)12小時(shí)，提取質(zhì)粒DNA，用EcoRI酶切鑒定，陽性克隆中可得到2.8kb、2.lkb、1.6kb和0.5kb的四條DNA條帶。再通過測序進(jìn)一步確定陽性克隆的正確性，得到的克隆即為pZT2。實(shí)施例3:插入牛PEPCK-C編碼區(qū)域DNA片段，構(gòu)建pZT4。將pZT2 用 NdeI 和 KpnI 雙酶切，酶切體系為 2iig 質(zhì)粒 DNA，3iil 10 X buffer,1.5 ill KpnI酶，1.5 ill NdeI酶，加入ddH20補(bǔ)足體積至30iil，37°C溫浴3小時(shí)。然后將酶切體系在I %的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出6.6kb大小的DNA條帶，用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。通過PCR擴(kuò)增得到1.9kb的牛PEPCK-C編碼區(qū)DNA片段，PCR條件如下:1 Ul胎牛成纖維細(xì)胞的 cDNA，引物 I (ATG CCT CCT CAG CTC TCA GAC G)和引物 2(GGTACC TTACAT CTG GCT GAT TCT CTG CTT C)的終濃度均為 0.5 y M，dNTPs 的終濃度為 0.2mM, 5 U I10 X buffer, I U I HiFi Taq 酶，加入 ddH20 補(bǔ)足體積至 50 yl。PCR 循環(huán)為，95°C，2 分鐘；接著是95 °C，30秒，55 °C，30秒，72 °C，2分鐘，35個循環(huán)；72 °C，5分鐘；4°C，保溫。將PCR產(chǎn)物在I %的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出1.9kb大小的DNA條帶,用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。 將PCR擴(kuò)增得到的的牛PEPCK-C編碼區(qū)DNA片段通過TA克隆連接到pEASY_T3載體(全式金公司)上。Iyl ￡45￥13，加入4111的牛？￡ 0(-(:編碼區(qū)0嫩片段，251:，30分鐘。然后將連接反應(yīng)轉(zhuǎn)化到E.coli感受態(tài)細(xì)胞中，把轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布到含有IPTG和X-Gal以及氨芐青霉素的LB平板上生長。克隆生長出來后，挑白色的單克隆菌落至3ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C震蕩培養(yǎng)12小時(shí)，提取質(zhì)粒DNA，用EcoRI酶切鑒定，陽性克隆中可得到3.0kb和1.9kb的兩條DNA條帶。再通過測序進(jìn)一步確定陽性克隆的正確性，得到的克隆即為PZT3。從pZT3中用NdeI和KpnI雙酶切以切出牛PEPCK-C編碼區(qū)域DNA片段，酶切體系為 3iig pZT3DNA, 3 u I 10 X buffer,1.5u I KpnI 酶，1.5 y I NdeI 酶，加入 ddH20 補(bǔ)足體積至30iU，37°C溫浴3小時(shí)。然后將酶切體系在I %的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出1.9kb大小的DNA條帶，用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。將pZT2 (KpnI/NdeI)和牛 PEPCK-C 編碼區(qū)域 DNA 片段(KpnI/NdeI)連接，連接反應(yīng)同上。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coli的感受態(tài)細(xì)胞中。具體步驟同上，除了只用博萊霉素進(jìn)行抗性篩選?？寺∩L出來后，挑單克隆菌落至3ml含博萊霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C震蕩培養(yǎng)
12小時(shí)，提取質(zhì)粒DNA，用EcoRI酶切鑒定，陽性克隆中可得到2.8kb、2.0kbU.9kb和1.6kb的四條DNA條帶。再通過測序進(jìn)一步確定陽性克隆的正確性，得到的克隆即為pZT4。實(shí)施例4:插入MCK增強(qiáng)子DNA片段，構(gòu)建pZT51。將pZT4 用 PvuI 酶切，酶切體系為 g 質(zhì)粒 DNA，3ii I 10Xbuffer,1.5 U IKpnI酶，1.5 u INdeI酶，加入ddH20補(bǔ)足體積至30 yl，37°C溫浴3小時(shí)。然后將酶切體系在1%的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出8.5kb大小的DNA條帶，用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。pZT4 載體的去磷酸化，35 ill pZT4 (PvuI), 4 U I 10 X buffer，I 牛小腸堿性去磷酸化酶(CIP)，37°C溫浴I小時(shí)。然后將反應(yīng)體系在I %的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出8.5kb大小的DNA條帶，用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。通過PCR擴(kuò)增得到MCK增強(qiáng)子DNA片段，PCR條件如下:I yl (約IOng)模板DNAPST181，引物 I (gataCGATCGACGGGCCAGATATACGCGTTAGAA)和引物 2 (ccggCGATCGGGCGGGCCATTTACCGTAAGTTAT)的終濃度均為 0.5 u M, dNTPs 的終濃度為 0.2mM, 5 u I 10 X buffer, I u IHiFi Taq酶，加入ddH20補(bǔ)足體積至50iU。PCR循環(huán)為，95°C，2分鐘；接著是95°C，30秒，550C，30秒，720C，30秒，35個循環(huán)；72°C，5分鐘；4°C，保溫。然后將PCR產(chǎn)物在I %的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出500bp大小的DNA條帶，用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。用PvuI 酶切 MCK 增強(qiáng)子 DNA 片段，酶切體系為 3 ii g DNA，4 ill 10 X buffer, 3 U IPvuI酶，加入ddH20補(bǔ)足體積至40iU，37°C溫浴3小時(shí)。然后將酶切體系在I %的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出500bp大小的DNA條帶,用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。將pZT4(PvuI/CIP)和MCK增強(qiáng)子DNA片段(PvuI)連接，連接反應(yīng)同上。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coli的感受態(tài)細(xì)胞中。具體步驟同上，除了只用博萊霉素進(jìn)行抗性篩選。克隆生長出來后，挑單克隆菌落至3ml含博萊霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C震蕩培養(yǎng)12小時(shí)，提取質(zhì)粒DNA，用PvuI酶切鑒定，陽性克隆中可得到8.5kb和0.5kb的兩條DNA條帶。再通過測序進(jìn)一步確定陽性克 隆的正確性，得到的克隆即為PZT51。
_核苷酸或氨基酸序列表_
SEQUENCE LISTING
<110〉南開大學(xué)
<120〉提高牛的痩肉率、肌間脂肪含量和生殖能力的轉(zhuǎn)基因載體 〈130〉 sglll02402 <160〉 I
<170> Patentln version 3.3
〈210〉 I <211〉 8971 <212〉 DNA <213〉肌肉組織特異表達(dá)牛PEPCK-C的轉(zhuǎn)基因載休全序列 〈400〉 I
tatggtcgac ctgcaggcgg ccgcgaattc actagtgatg gatcgccctt atgcctcctc 60
agctctcaga cggcctcaac tactcagcca aaatcgtccg gggctccctg gacagcctgc 120
cccaggccgt gaggagtttc gtggagagca gcgccaagct gtgccggcct gaccaagtcc 180
acatctgcga tggctccgag gaggagaacc ggcagctgct gagccacatg gaggaggagg 240
gtgtgatcaa gaggctgaag aagtatgaca actgctggtt ggctctcact gaccccaggg 300
atgtggccag aattgaaagc aagacggtca tcatcactcg agagcaaaga gatacggtgc 360
權(quán)利要求
1.一種提高牛的瘦肉率、肌間脂肪含量和生殖能力的轉(zhuǎn)基因載體，其特征在于該轉(zhuǎn)基因載體包含小鼠的肌酸激酶增強(qiáng)子、2.7kb牛的a-骨骼肌肌動蛋白基因的啟動子、牛的PEPCK-C的cDNA和牛生長激素基因的3’端不翻譯區(qū)域，且?guī)в胁溉閯游锛?xì)胞中篩選用的抗性基因一嘌呤霉素基因和··核細(xì)胞中篩選用的抗性基因-博萊霉素基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提高牛的瘦肉率、肌間脂肪含量和生殖能力的轉(zhuǎn)基因載體，該轉(zhuǎn)基因載體包含小鼠的肌酸激酶(muscle creatine kinase，MCK)增強(qiáng)子、2.7kb牛的α-骨骼肌肌動蛋白基因的啟動子、牛的PEPCK-C的cDNA和牛生長激素基因的3’端不翻譯區(qū)域，且?guī)в胁溉閯游锛?xì)胞中篩選用的抗性基因--嘌呤霉素基因和原核細(xì)胞中篩選用的抗性基因-博萊霉素基因。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因載體可應(yīng)用于體細(xì)胞克隆，以構(gòu)建高瘦肉率、高肌間脂肪含量和高生殖能力的PEPCK-Cmus轉(zhuǎn)基因牛。
文檔編號C12N15/85GK103074371SQ20111032913
公開日2013年5月1日 申請日期2011年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月26日
發(fā)明者戴一凡, 陳凌懿 申請人:南開大學(xué)