專利名稱：BPI－Fc重組蛋白的高效生產(chǎn)方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域重組蛋白的高效生產(chǎn)方法及其應(yīng)用。
細(xì)菌耐藥是臨床抗感染治療中遇到的最為嚴(yán)重和棘手的問題，迄今尚未獲得有效的解決辦法。來自臨床的研究報(bào)導(dǎo)指出，感染患者中約半數(shù)以上為革蘭氏陰性(G-)菌感染，其中發(fā)展為G-菌敗血癥(GNS)引起休克死亡的比率也相對(duì)較高[Dahlberg PS,Acton RD and Battafarano RJ.J Surg Res.63:44-8(1996)]。目前傳統(tǒng)抗菌素治療[Verhoef J,Hustinx WM,Frase H and Hoepelman AI.J AntimicrobChemother.38(2):167-82(1996)]和采用抗脂多糖類脂A/內(nèi)核心單克隆抗體或抗IL-1/TNF單克隆抗體進(jìn)行免疫治療[Mccloskey RU,Straube RC,Sander C et al.Ann Intern Med.121:1(1994)]，效果均不理想。
殺菌/滲透增強(qiáng)蛋白(Bactericidal/Permeability Increasing Protein,BPI)是在多形核白細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種56kd的陽(yáng)離子抗菌糖蛋白[Weiss J,Elsbach P and OlsonI et al.J Biol Chem.253:2664-72(1978)]，隨后重組BPI及其N端功能片段相繼研制成功[Gazzano-Santoro et al,Infect.Immun.60:4754-4761(1992)]。研究表明，上述重組蛋白與天然BPI具有完全相同的生物功能，即對(duì)細(xì)菌脂多糖和類脂A有很高的親合力，它們不僅能非特異性殺傷G-菌，并可中和其內(nèi)毒素，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景[Liu Y,Ammons WS and Leach WJ et al.Shock.2:324-31(1994)]。但初步應(yīng)用結(jié)果表明，重組BPI及其N端功能片段作為抗感染生物制劑，易被蛋白酶降解而不穩(wěn)定，在體內(nèi)血清半衰期短(小于60分鐘)，因而影響其臨床療效[Robert JB,Kenneth D and Nneka OI et al.Pharm-Res.14(2):224-9(1997)]。
Ig樣重組蛋白是應(yīng)用基因工程技術(shù)產(chǎn)生的由某種蛋白或功能多肽片段與免疫球蛋白(Ig)或其重鏈恒定區(qū)(Fc)片段嵌合組成的雜合蛋白，它不僅不易被蛋白酶降解、穩(wěn)定性好、在血清中半衰期長(zhǎng)，而且具有該種蛋白或功能多肽所特有的生物功能，并具有免疫球蛋白的激活補(bǔ)體和調(diào)理作用等特性[Hodges TL.et al.Antimicro-Agonts-Chemother.35:2580-2586.(1991)]。由BPI或其N端功能片段與免疫球蛋白Fc片段或其等位體嵌合組成的Ig樣重組蛋白(稱為BPI-Fc)，在具備較好穩(wěn)定性和較長(zhǎng)血清半衰期的同時(shí)，具有BPI廣譜殺傷G-菌和中和內(nèi)毒素作用，并可通過Fc激活補(bǔ)體和調(diào)理作用增強(qiáng)BPI的殺菌作用，是一種理想的新型非抗生素類抗感染生物制劑。
Ig樣重組蛋白具有分子較大、二硫鍵多、結(jié)構(gòu)和功能復(fù)雜等特點(diǎn)，一般均采用真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)，以便通過糖基化修飾和自然折疊，產(chǎn)生具有天然蛋白或其功能片段生物功能的糖基化重組蛋白；但真核表達(dá)系統(tǒng)存在表達(dá)量低、成本高等問題，因而影響其實(shí)際應(yīng)用。BPI或其功能片段和Fc片段上均有糖基化位點(diǎn)[Gray PW.et al.J Biol Chem.264:9505-9509.(1989)]，而原核宿主細(xì)胞不對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行糖基化修飾，迄今未見采用原核表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)BPI-Fc重組蛋白的報(bào)導(dǎo)。但原核表達(dá)系統(tǒng)具有表達(dá)量高、成本低等優(yōu)勢(shì)。
本發(fā)明的目的是提供一種采用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)BPI-Fc重組蛋白的高效生產(chǎn)方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案為一種BPI-Fc重組蛋白的高效生產(chǎn)方法，包括以下步驟(1)、構(gòu)建BPI-Fc嵌合基因表達(dá)載體；(2)、BPI-Fc重組蛋白在原核宿主細(xì)胞中表達(dá)。
所述表達(dá)載體是包含由BPI或其功能片段基因和免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)Fc或其等位體基因嵌合組成的BPI-Fc嵌合基因，并能在原核宿主細(xì)胞中表達(dá)BPI-Fc重組蛋白的DNA。
所述BPI-Fc嵌合基因?yàn)锽PI-Fcγ1嵌合基因，由BPI1-199功能片段基因和人IgG1重鏈恒定區(qū)Fcγ1基因嵌合組成，其中連接5’端BPI1-199功能片段基因與3’端Fcγ1基因的鉸鏈區(qū)核苷酸序列描述為5’…GAAGCTTCTAC…3’；在5’端BPI1-199功能片段基因前加入含EcoRⅠ位點(diǎn)和起始密碼ATG的核苷酸序列為5’GAATTCATG 3’；在3’端Fcγ1基因后采用TAA作為終止密碼。
所述的在原核宿主細(xì)胞中表達(dá)是將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化原核宿主細(xì)胞并誘導(dǎo)表達(dá)BPI-Fc重組蛋白。
所述原核宿主細(xì)胞為大腸桿菌。
所述大腸桿菌為E.coli DH5α。
BPI-Fc重組蛋白在原核宿主細(xì)胞中表達(dá)后，用親和層析方法提純BPI-Fc重組蛋白。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種高效生產(chǎn)BPI-Fc重組蛋白的表達(dá)載體。
本發(fā)明的這一目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種高效生產(chǎn)BPI-Fc重組蛋白的表達(dá)載體，它是包含由BPI或其功能片段基因和免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)Fc或其等位體基因嵌合組成的BPI-Fc嵌合基因，并能在原核宿主細(xì)胞中表達(dá)BPI-Fc重組蛋白的DNA。
所述的BPI-Fc嵌合基因?yàn)锽PI-Fcγ1嵌合基因；所述的BPI-Fcγ1嵌合基因由BPI1-199功能片段基因和人IgG1重鏈恒定區(qū)Fcγ1基因嵌合組成，其中連接5’端BPI1-199功能片段基因與3’端Fcγ1基因的鉸鏈區(qū)核苷酸序列描述為5’…GAAGCTTCTAC…3’。
所述BPI-Fcγ1嵌合基因編碼的BPI-Fcγ1重組蛋白N端BPI1-199功能片段與C端Fcγ1片段的鉸鏈區(qū)氨基酸序列描述為…:EAS:TCPPCPAPELL…。
所述BPI-Fcγ1嵌合基因中在5’端BPI1-199功能片段基因前加入含EcoRⅠ位點(diǎn)和起始密碼ATG的核苷酸序列為5’GAATTCATG3’。
所述BPI-Fcγ1嵌合基因在3’端Fcγ1基因后采用TAA作為終止密碼。
本發(fā)明應(yīng)用基因工程技術(shù)在原核宿主細(xì)胞中高效表達(dá)了BPI-Fc重組蛋白，表達(dá)產(chǎn)生的重組蛋白是非糖基化重組蛋白，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，首次發(fā)現(xiàn)原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)產(chǎn)生的非糖基化BPI-Fc重組蛋白具有BPI的生物功能和Fc的生物功能，可通過激活補(bǔ)體和調(diào)理作用極大增強(qiáng)殺傷G-菌的作用。因此本發(fā)明對(duì)研制新型高效抗感染生物制劑具有重要價(jià)值，在制藥行業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景。
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。


圖1為Sepharose CL-4B Protein A親和層析提純BPI-Fcγ1的單一洗脫峰圖2為親和層析純化的BPI-Fcγ1的SDS-PAGE電泳分析圖3表示補(bǔ)體對(duì)BPI-Fcγ1重組蛋白殺傷G-菌的增強(qiáng)作用圖4表示白細(xì)胞對(duì)BPI-Fcγ1重組蛋白殺傷G-菌的增強(qiáng)作用實(shí)施例一、BPI功能片段基因和Fcγ1片段基因的克隆1．BPI功能片段基因的克隆從早幼粒細(xì)胞白血病HL-6細(xì)胞系(ATCCCCL240)中提取mRNA，用設(shè)計(jì)合成的人BPI基因引物(P1 5’CAGAATTCATGGTCAACCCTGGCGTCGTG3’和P2 5’GCAAGCTTCTATTTTGGTCATTACTGGCAG3’)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增(48℃逆轉(zhuǎn)錄45分鐘后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)PCR擴(kuò)增，循環(huán)參數(shù)為94℃變性30秒、53.5℃復(fù)性40秒、72℃延伸45秒)，得到約620bp的BPI基因片段BPI620；用EcoRⅠ/Hind Ⅲ雙酶切BPI620得到約200bp的BPI基因片段BPI200(EcoRⅠ/EcoRⅠ粘性末端)和約420bp的BPI基因片段BPI420(EcoRⅠ/HindⅢ粘性末端)；按照分子克隆操作方法[Sambrook J.et al.Molecular cloning:alaboratory manual,second edition,1989,Cold Spring Harbor Laboratory,NewYork.]，將BPI200和BPI420分別克隆到PUC18質(zhì)粒的EcoRⅠ位點(diǎn)和EcoRⅠ/HindⅢ雙酶切位點(diǎn)上得到PUC18-BPI200和PUC18-BPI420。
2．Fcγ1片段基因的克隆從正常人外周血白細(xì)胞中提取mRNA，用設(shè)計(jì)合成的人IgG1的Fcγ1片段基因引物(P3 5’GTAAGCTTCTACATGCCCACCGTGCCCAG3’和P4 5’TCGGATCCTTATTTACCCGGAGACAGGGAG3’)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增(48℃逆轉(zhuǎn)錄45分鐘后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)PCR擴(kuò)增，循環(huán)參數(shù)為94℃變性30秒、56℃復(fù)性40秒、72℃延伸45秒)，得到約700bp的Fcγ1基因片段Fcγ1700；Fcγ1700經(jīng)HindⅢ/BamHⅠ雙酶切后克隆到PUC18的HindⅢ/BamHⅠ雙酶切位點(diǎn)上得到PUC18-Fcγ1700。
二、pBV-BPI-Fcγ1表達(dá)載體的構(gòu)建按照分子克隆操作方法，把PUC18-BPI420上的EcoRⅠ/HindⅢ雙酶切片段BPI420和PUC18-Fcγ1700上的HindⅢ/BamHⅠ雙酶切片段Fcγ1700共連接到pBV220表達(dá)載體[張智清等.病毒學(xué)報(bào)，6:111,(1990)]的EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切位點(diǎn)上，得到表達(dá)載體中間體pBV-BPI420-Fcγ1；再把PUC18-BPI200上的EcoRⅠ酶切片段BPI200連接插入到pBV-BPI420-Fcγ1的EcoRⅠ位點(diǎn)上，篩選得到正向插入BPI-Fcγ1嵌合基因的表達(dá)載體pBV-BPI-Fcγ1。經(jīng)過雙脫氧核苷酸末端終止法測(cè)序，構(gòu)建于pBV-BPI-Fcγ1上的BPI-Fcγ1嵌合基因的讀碼框架準(zhǔn)確無誤；其中連接5’端BPI1-199功能片段基因與3’端Fcγ1基因的鉸鏈區(qū)(hinge)核苷酸序列描述為5’…GAAGCTTCTAC…3’，對(duì)應(yīng)位置的BPI-Fcγ1重組蛋白鉸鏈區(qū)(hinge)的氨基酸序列描述為…:EAS:TCPPCPAPELL…；在5’端BPI1-199功能片段基因前加入含EcoRⅠ位點(diǎn)和起始密碼ATG的核苷酸序列為5’GAATTCATG3’；在3端’Fcγ1基因后含采用的TAA終止密碼和加入的BamHⅠ位點(diǎn)的序列為5’TAAGGATCC3’。
三、BPI-Fcγ1重組蛋白在E.coli中高效表達(dá)把表達(dá)載體pBV-BPI-Fcγ1轉(zhuǎn)化原核宿主細(xì)胞E.coli DH5α[基因型supE44*lacU169(Ф801acⅠ M15)hsdR17 recA1 end A1 gyrA96 thi-1 relA1](保藏號(hào)CGMCC No.0450)，在30℃ LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD值約0.4-0.6時(shí)，立即轉(zhuǎn)入42℃中溫控誘導(dǎo)表達(dá)，6小時(shí)后離心收集細(xì)菌；細(xì)菌經(jīng)裂解后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，經(jīng)薄層掃描凝膠分析，BPI-Fcγ1的表達(dá)量達(dá)菌體總蛋白的25％。所用的大腸桿菌宿主細(xì)胞也可以是其它的大腸桿菌品種(如E.coli HB101、JM109等)。
四、BPI-Fcγ1重組蛋白的提純超聲破碎誘導(dǎo)表達(dá)后離心收集的菌體，經(jīng)洗滌、離心收集包涵體沉淀；把包涵體溶于含8M尿素的裂解液中，進(jìn)行Sephadex G-100凝膠層析初步提取，收集BPI-Fcγ1重組蛋白洗脫峰；將洗脫峰分步稀釋并在含5mM還原型谷胱甘肽/2mM氧化型谷胱甘肽復(fù)性液中復(fù)性；用Sepharose CL-4B Protein A親和層析提純復(fù)性的BPI-Fcγ1重組蛋白，如
圖1所示，得到并收集重組蛋白單一洗脫峰1；經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，如圖2所示，純化的非糖基化BPI-Fcγ1重組蛋白在還原條件下為單-48kd譜帶2。同時(shí)，還可以利用Fc片段親和結(jié)合特性，應(yīng)用其它親和層析介質(zhì)的親和層析方法提純BPI-Fc重組蛋白。
五、BPI-Fcγ1重組蛋白的ELISA分析1．抗BPI抗體對(duì)BPI-Fcγ1重組蛋白的鑒定取100μl不同稀釋度的BPI-Fcγ1包被聚苯乙烯板，4℃過夜；洗滌，各孔加入100μl免抗人BPI抗體，37℃作用30分鐘；洗滌，各孔加入100μl HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體，37℃作用30分鐘；洗滌，加入100μlTMB底物，37℃作用10分鐘后，加入50μl終止液終止反應(yīng)，測(cè)OD值(450nm)。試驗(yàn)用Anti-BPI EIA Kit(Lot:030361,THE BINDING SITE,Birmingham,UK)中的BPI COATED WELLS(Code:EA141)作為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果表明抗BPI抗體可特異性結(jié)合BPI-Fcγ1重組蛋白(表1)，證實(shí)該重組蛋白具有BPI結(jié)構(gòu)。
表1
2．抗Fcγ1抗體對(duì)BPI-Fcγ1重組蛋白的鑒定用100μl兔抗人BPI抗體包被聚苯乙烯板，4℃過夜；洗滌，各孔加入100μl不同稀釋度的BPI-Fcγ1,37℃作用30分鐘；洗滌，各孔加入100μlHRP標(biāo)記的羊抗人IgG抗體，37℃作用30分鐘；洗滌，加入100μlTMB底物，37℃作用10分鐘后，加入50μl終止液終止反應(yīng)，測(cè)OD值(450nm)。試驗(yàn)用稀釋人血清作為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果表明抗Fcγ1抗體可特異性結(jié)合BPI-Fcγ1重組蛋白(表2)，證實(shí)該重組蛋白具有Fcγ1結(jié)構(gòu)。
表2
六、BPI-Fcγ1重組蛋白對(duì)LPS的中和作用用50μl不同稀釋度的BPI-Fcγ1與50μl(1 Eu/ml)純化LPS混勻，37℃水浴60分鐘；加入50μl鱟試劑混勻，37℃水浴25分鐘；加入50μl顯色基質(zhì)鱟三肽混勻，37℃水浴3分鐘；再加入偶氮試劑混勻顯色，測(cè)OD值(545nm)。同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照(只含LPS，不含BPI-Fcγ1)和陰性對(duì)照(只含BPI-Fcγ1，不含LPS)。結(jié)果表明OD值與BPI-Fcγ1含量呈負(fù)相關(guān)(表3)，證實(shí)該重組蛋白具有中和內(nèi)毒素的作用。
表3
七、補(bǔ)體對(duì)BPI-Fcγ1重組蛋白殺傷G-菌的增強(qiáng)作用本試驗(yàn)用E.coli(CMCC No.44101)作為殺傷靶細(xì)菌，按104/ml配成菌液。本試驗(yàn)分為四組，即細(xì)菌對(duì)照組、補(bǔ)體對(duì)照組、重組蛋白對(duì)照組和重組蛋白加補(bǔ)體試驗(yàn)組。細(xì)菌對(duì)照組取100μl菌液加100μl生理鹽水混勻，37℃水浴1小時(shí)，菌液均勻涂布四塊平板(50μl/平板)，37℃16小時(shí)，菌落計(jì)數(shù)。補(bǔ)體對(duì)照組取100μl菌液與100μl豚鼠新鮮血清混勻，37℃水浴1小時(shí)，菌液均勻涂布四塊平板(50μl/平板)，37℃16小時(shí)，菌落計(jì)數(shù)。重組蛋白對(duì)照組取100μl菌液分別與100μl不同稀釋度BPI-Fcγ1混勻，37℃水浴16小時(shí)，每管菌液均勻涂布四塊平板(50μl/平板)，37℃16小時(shí)，菌落計(jì)數(shù)。重組蛋白加補(bǔ)體試驗(yàn)組取100μl菌液分別與100μl不同稀釋度BPI-Fcγ1混勻，37℃水浴16小時(shí)，每管各加100μl豚鼠新鮮血清混勻，37℃水浴1小時(shí)，每管菌液均勻涂布四塊平板(50μl/平板)，37℃16小時(shí)，菌落計(jì)數(shù)。結(jié)果表明在補(bǔ)體參與下，可極大增強(qiáng)BPI-Fcγ1重組蛋白對(duì)細(xì)菌的殺傷作用。如圖3所示，橫坐標(biāo)為重組蛋白濃度(μg/ml)，縱坐標(biāo)為菌落數(shù)，3為細(xì)菌對(duì)照組，4為補(bǔ)體對(duì)照組，5、7、9、11為重組蛋白對(duì)照組，6、8、10、12為重組蛋白加補(bǔ)體試驗(yàn)組。
八、白細(xì)胞對(duì)BPI-Fcγ1重組蛋白殺傷G-菌的增強(qiáng)作用本試驗(yàn)用E.coli(CMCC No.44101)作為殺傷靶細(xì)菌，按104/ml配成菌液。試驗(yàn)分為四組，即細(xì)菌對(duì)照組、白細(xì)胞對(duì)照組、重組蛋白對(duì)照組和重組蛋白加白細(xì)胞試驗(yàn)組。細(xì)菌對(duì)照組取100μl菌液加100μl生理鹽水混勻，37℃水浴1小時(shí)，菌液均勻涂布四塊平板(50μl/平板)，37℃16小時(shí)，菌落計(jì)數(shù)。白細(xì)胞對(duì)照組取100μl菌液與100μl白細(xì)胞(105/ml)混勻，37℃水浴1小時(shí)，菌液均勻涂布四塊平板(50μl/平板)，37℃16小時(shí)，菌落計(jì)數(shù)。重組蛋白對(duì)照組取100μl菌液分別與100μl不同稀釋度BPI-Fcγ1混勻，37℃水浴3小時(shí)，每管菌液均勻涂布四塊平板(50μl/平板)，37℃16小時(shí)，菌落計(jì)數(shù)。重組蛋白加白細(xì)胞試驗(yàn)組取100μl菌液分別與100μl不同稀釋度BPI-Fcγ1混勻，37℃水浴3小時(shí)，每管各加100μl白細(xì)胞(105/ml)混勻，37℃水浴1小時(shí)，每管菌液均勻涂布四塊平板(50μl/平板)，37℃16小時(shí)，菌落計(jì)數(shù)。結(jié)果表明在白細(xì)胞參與下，可極大增強(qiáng)BPI-Fcγ1重組蛋白對(duì)細(xì)菌的殺傷作用。如圖4所示，橫坐標(biāo)為重組蛋白濃度(μg/ml)，縱坐標(biāo)為菌落數(shù)，13為細(xì)菌對(duì)照組，14為自細(xì)胞對(duì)照組，15、17、19為重組蛋白對(duì)照組，16、18、20為重組蛋白加白細(xì)胞試驗(yàn)組。
本發(fā)明表明，非糖基化BPI-Fcγ1重組蛋白具有BPI和Fc的結(jié)構(gòu)和生物功能。采用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)產(chǎn)生由BPI或其N端功能片段(包含BPI N端功能片段中的糖基化位點(diǎn))與各種免疫球蛋白(如IgG其它亞型，IgA,IgM等)Fc片段或其等位體嵌合組成的BPI-Fc重組蛋白時(shí)，同樣可以產(chǎn)生具有BPI的結(jié)構(gòu)和生物功能并具備Ig樣重組蛋白不易被蛋白酶降解、穩(wěn)定性好、在血清中半衰期長(zhǎng)等特性的非糖基化BPI-Fc重組蛋白，對(duì)研制新型高效的BPI抗感染生物制劑、改善BPI作為抗感染生物制劑的臨床療效具有重要價(jià)值；因此，嵌合組成BPI-Fc重組蛋白的BPI或其N端功能片段和各種免疫球蛋白Fc片段或其等位體適用于本發(fā)明。再者，原核宿主細(xì)胞不對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行糖基化修飾，同理，應(yīng)用各種原核宿主細(xì)胞(如枯草桿菌、格氏鏈球菌等)均可表達(dá)產(chǎn)生有生物功能的非糖基化BPI-Fc重組蛋白；因此，各種原核表達(dá)系統(tǒng)的原核宿主細(xì)胞和對(duì)應(yīng)的可穩(wěn)定轉(zhuǎn)化并表達(dá)BPI-Fc重組蛋白的表達(dá)載體及其構(gòu)建方法也適用于本發(fā)明。
權(quán)利要求
1.一種BPI-Fc重組蛋白的高效生產(chǎn)方法，包括以下步驟(1)、構(gòu)建BPI-Fc嵌合基因表達(dá)載體；(2)、BPI-Fc重組蛋白在原核宿主細(xì)胞中表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種BPI-Fc重組蛋白的高效生產(chǎn)方法，其特征在于所述表達(dá)載體是包含由BPI或其功能片段基因和免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)Fc或其等位體基因嵌合組成的BPI-Fc嵌合基因，并能在原核宿主細(xì)胞中表達(dá)BPI-Fc重組蛋白的DNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種BPI-Fc重組蛋白的高效生產(chǎn)方法，其特征在于所述BPI-Fc嵌合基因?yàn)锽PI-Fcγ1嵌合基因，由BPI1-199功能片段基因和人IgG1重鏈恒定區(qū)Fcγ1基因嵌合組成，其中連接5’端BPI1-199功能片段基因與3’端Fcγ1基因的鉸鏈區(qū)核苷酸序列描述為5’…GAAGCTTCTAC…3’；在5’端BPI1-199功能片段基因前加入含EcoRⅠ位點(diǎn)和起始密碼ATG的核苷酸序列為5’GAATTCATG3’；在3’端Fcγ1基因后采用TAA作為終止密碼。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種BPI-Fc重組蛋白的高效生產(chǎn)方法，其特征在于所述的在原核宿主細(xì)胞中表達(dá)是將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化原核宿主細(xì)胞并誘導(dǎo)表達(dá)BPI-Fc重組蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種BPI-Fc重組蛋白的高效生產(chǎn)方法，其特征在于所述原核宿主細(xì)胞為大腸桿菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種BPI-Fc重組蛋白的高效生產(chǎn)方法，其特征在于所述大腸桿菌為E.coli DH5α。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種BPI-Fc重組蛋白的高效生產(chǎn)方法，其特征在于BPI-Fc重組蛋白在原核宿主細(xì)胞中表達(dá)后，用親和層析方法提純BPI-Fc重組蛋白。
8.一種高效生產(chǎn)BPI-Fc重組蛋白的表達(dá)載體，其特征在于它是包含由BPI或其功能片段基因和免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)Fc或其等位體基因嵌合組成的BPI-Fc嵌合基因，并能在原核宿主細(xì)胞中表達(dá)BPI-Fc重組蛋白的DNA。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種高效生產(chǎn)BPI-Fc重組蛋白的表達(dá)載體，其特征在于所述的BPI-Fc嵌合基因?yàn)锽PI-Fcγ1嵌合基因；所述的BPI-Fcγ1嵌合基因由BPI1-199功能片段基因和人IgG1重鏈恒定區(qū)Fcγ1基因嵌合組成，其中連接5’端BPI1-199功能片段基因與3’端Fcγ1基因的鉸鏈區(qū)核苷酸序列描述為5’…GAAGCTTCTAC…3’。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種高效生產(chǎn)BPI-Fc重組蛋白中的表達(dá)載體，其特征在于所述BPI-Fcγ1嵌合基因編碼的BPI-Fcγ1重組蛋白N端BPI1-199功能片段與C端Fcγ1片段的鉸鏈區(qū)氨基酸序列描述為…:EAS:TCPPCPAPELL…。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種高效生產(chǎn)BPI-Fe重組蛋白的表達(dá)載體，其特征在于所述BPI-Fcγ1嵌合基因中在5’端BPI1-199功能片段基因前加入含EcoRⅠ位點(diǎn)和起始密碼ATG的核苷酸序列為5’GAATTCATG3’。
12.根據(jù)權(quán)利要求9或11所述的一種高效生產(chǎn)BPI-Fc重組蛋白的表達(dá)載體，其特征在于所述BPI-Fcγ1嵌合基因在3’端Fcγ1基因后采用TAA作為終止密碼。
13.權(quán)利要求1所述的方法在制藥中的應(yīng)用。
14.權(quán)利要求8所述的表達(dá)載體在制藥中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了采用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)由殺菌/滲透性增強(qiáng)蛋白(BPI)與免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)(Fc)嵌合組成的BPI－Fc重組蛋白的高效生產(chǎn)方法,包括(1)、構(gòu)建BPI－Fc嵌合基因表達(dá)載體;(2)、BPI－Fc重組蛋白在原核宿主細(xì)胞中表達(dá);本發(fā)明還公開了在原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)BPI－Fcγ1重組蛋白過程中的特異表達(dá)載體;本發(fā)明對(duì)研制新型高效抗感染生物制劑具有重要價(jià)值,在制藥行業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/62GK1324803SQ00107590
公開日2001年12月5日 申請(qǐng)日期2000年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2000年5月22日
發(fā)明者安云慶, 陳金棟 申請(qǐng)人:首都醫(yī)科大學(xué), 陳金棟