本發(fā)明屬于植物生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種浙江楠體細(xì)胞胚誘導(dǎo)方法。
背景技術(shù)：
：浙江楠(phoebechekiangensis)屬樟科楠屬的高大喬木,是“金絲楠木”的原種植物種之一,具有很高的經(jīng)濟(jì)價值，為亞熱帶東部區(qū)特有珍貴樹種，自然分布于浙江、福建北部、江西東北部和安徽南部(中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會，1982；安徽植物志協(xié)作組,1986)。樹干通直，材質(zhì)優(yōu)美，是高檔家具制作的特用材；樹體高大，四季翠綠，也是園林綠化優(yōu)良樹種。雖然浙江楠經(jīng)濟(jì)與觀賞價值特高，但現(xiàn)存資源極少,保護(hù)和擴(kuò)繁優(yōu)異種質(zhì)資源成為該種研究的熱點(diǎn)與重點(diǎn)。之前的研究多集中于種子休眠(史曉華和史忠禮,1990)、苗木培育(李冬林和向其柏,2004,2006；王藝等,2013)、人工林栽培(彭龍福,2003；吳載嶂,2005)和生態(tài)學(xué)(馬明東等,2008；王琦等,2013)等方面，而利用現(xiàn)代生物技術(shù)對其進(jìn)行體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)等快繁未見研究報道。浙江楠主要行種子繁殖，但因其大樹資源極少、結(jié)實(shí)不穩(wěn)定，種子量少，導(dǎo)致其種苗的供應(yīng)嚴(yán)重不足。同時，實(shí)生苗后代分離嚴(yán)重，不能固定優(yōu)異母本的優(yōu)良性狀?？梢?，亟需用現(xiàn)代生物技術(shù)進(jìn)行無性方式擴(kuò)繁優(yōu)良基因型，以此保育、繁育浙江楠優(yōu)異種質(zhì)。一般無性繁殖主要通過扦插和組織培養(yǎng)兩方面來實(shí)現(xiàn)。但浙江楠至今扦插繁殖成活率低，且受扦插用穗條材料和季節(jié)限制，大樹因生理年齡大而不能成活，無法實(shí)現(xiàn)規(guī)?；庇龖?yīng)用。組織培養(yǎng)具有繁殖速度快、能保持母本的優(yōu)良遺傳特性等優(yōu)點(diǎn)，是實(shí)現(xiàn)種質(zhì)大量繁殖、長期保存的重要可選擇途徑，尤其是采用體細(xì)胞胚性愈傷，誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生，以實(shí)現(xiàn)體胚快繁浙江楠優(yōu)質(zhì)種苗。同時，實(shí)現(xiàn)體胚培養(yǎng)對于優(yōu)異種質(zhì)資源保存以及進(jìn)一步的基因轉(zhuǎn)化技術(shù)、優(yōu)良雜交組合擴(kuò)繁等均具有重要意義。因此，構(gòu)建完善的體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系，提高人工繁殖效率是保證具有優(yōu)良性狀浙江楠能穩(wěn)定遺傳并擴(kuò)大繁殖滿足種質(zhì)保育與林業(yè)生產(chǎn)需求的重要途徑。目前落葉松、云杉、杉木等樹種已有較好的體胚發(fā)生體系，但不同類樹種具有特異的體胚發(fā)生技術(shù)，尤其是瀕危樹種會有更高的技術(shù)要求。針對瀕危樹種浙江楠，采用從不同發(fā)育階段的未成熟胚采集入手，尋找特殊的誘導(dǎo)培養(yǎng)的時間，篩選最適體胚發(fā)生培養(yǎng)基及其培養(yǎng)條件，創(chuàng)出完善的浙江楠體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了解決上述問題，本發(fā)明提供一種浙江楠體細(xì)胞胚誘導(dǎo)方法。首先，本發(fā)明提供一種浙江楠體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基組，其包括體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基、體細(xì)胞胚增殖培養(yǎng)基和體細(xì)胞胚萌發(fā)培養(yǎng)基，所述的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基為含有下述成分的ms固體培養(yǎng)基：谷氨酰胺400-600mg/l、水解酪蛋白400-600mg/l、2,4-d0.4-0.6mg/l、6-ba0.8-1.2mg/l，所述的體細(xì)胞胚增殖培養(yǎng)基為含有下述成分的ms固體培養(yǎng)基：6-ba0.1-1.0mg/l、naa0.1-1.0mg/l，所述的體細(xì)胞胚萌發(fā)培養(yǎng)基為含有下述成分的ms固體培養(yǎng)基：6-ba1.0mg/l、iba0.1mg/l或者naa0.1mg/l。其中，所述的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基為含有下述成分的ms固體培養(yǎng)基：谷氨酰胺500mg/l、水解酪蛋白500mg/l、2,4-d0.5mg/l、6-ba1.0mg/l，所述的體細(xì)胞胚增殖培養(yǎng)基為含有下述成分的ms固體培養(yǎng)基：naa0.1-1.0mg/l，所述的體細(xì)胞胚萌發(fā)培養(yǎng)基為含有下述成分的ms固體培養(yǎng)基：6-ba1.0mg/l、iba0.1mg/l。本發(fā)明還提供一種浙江楠體細(xì)胞胚誘導(dǎo)方法，其包括如下步驟：1)以浙江楠未成熟果實(shí)為外植體，進(jìn)行表面滅菌；2)剝?nèi)》N子幼胚，接種于所述的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，進(jìn)行體細(xì)胞胚誘導(dǎo)；3)將步驟2)誘導(dǎo)體細(xì)胞胚接種于所述的體細(xì)胞胚增殖培養(yǎng)基上，進(jìn)行體細(xì)胞胚的增殖，產(chǎn)生次生胚。在本發(fā)明一個設(shè)施方案中，所述的浙江楠體細(xì)胞胚誘導(dǎo)方法還包括：將步驟3)得到的次生胚接種于所述的體細(xì)胞胚萌發(fā)培養(yǎng)基進(jìn)行體細(xì)胞胚的萌發(fā)。在本發(fā)明一個實(shí)施方案中，在步驟2)體細(xì)胞胚誘導(dǎo)過程中或者在步驟3)體細(xì)胞胚增殖過程中，體細(xì)胞胚表面產(chǎn)生黃色顆粒狀的胚性愈傷組織，將所述胚性愈傷組織接種于所述體細(xì)胞胚增殖培養(yǎng)基上，每隔半個月繼代一次，進(jìn)行愈傷組織的增殖和體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)。其中，步驟1)表面滅菌方法為：將種子洗凈，在流水中沖洗1-3h，然后用75％酒精處理20-40s，無菌水沖洗3～4次后，用0.1％升汞滅菌8-15min，再用無菌水沖洗5～7次，洗去殘余升汞。在本發(fā)明一個實(shí)施方案中，幼胚接種到體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基前，將幼胚置于0.4-0.6m蔗糖中，4℃預(yù)處理48-96h。其中，所述種子幼胚胚齡為球形胚至心形胚之間。本發(fā)明通過外植體不同消毒方式的比較，獲得了浙江楠未成熟果實(shí)最佳的消毒方法；通過定期(間隔一周)收集未成熟種子，并結(jié)合解剖觀察，系統(tǒng)研究了不同發(fā)育階段的合子胚對體胚發(fā)生率的影響，得知處于球形胚或向心形胚轉(zhuǎn)換時的合子胚體胚發(fā)生率較高；通過篩選不同激素配比的培養(yǎng)基對體胚發(fā)生率的影響，獲得了浙江楠體胚誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基，發(fā)生率可達(dá)65％；通過對增殖培養(yǎng)基的篩選，獲得了最佳增殖培養(yǎng)基，增殖系數(shù)可達(dá)14.3；通過對體胚萌發(fā)培養(yǎng)基的篩選，獲得了最佳體胚萌發(fā)培養(yǎng)基，萌發(fā)率可達(dá)68.5％。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1誘導(dǎo)未成熟合子胚體胚發(fā)生分別于7月中旬至8月下旬采取潘山生長健壯，無病蟲害的優(yōu)良浙江楠單株上未成熟的果實(shí)。首先在流動的自來水中沖洗2h。在無菌室內(nèi)的超凈工作臺上用75％酒精處理30s，無菌蒸餾水沖洗3～4次后，分別用0.1％升汞滅菌8min、10min、12min和14min，再用無菌蒸餾水沖洗5～7次，洗去殘余升汞。不同時間的升汞處理后，對外植體的影響顯著不同，如表1。表1不同升汞處理時間對外植體消毒的的影響升汞處理時間消毒效果外植體狀態(tài)8min不徹底、仍有菌殘留果皮保持綠色10min好果皮保持綠色12min好果皮有些褐化14min好果皮褐化較嚴(yán)重取同一時間，大小基本一致的浙江楠未成熟果實(shí)，在無菌條件下，取其幼胚，分為五組，分別放入0m、0.5m、1.0m蔗糖中，每一組放置大約90個幼胚，置于4℃冰箱中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。每隔24h(分別為24h、48h和72h)每組取出30個接種到bim培養(yǎng)基中，共接種3次，每次90個幼胚，共270個，1個月后測定其體胚發(fā)生率。表2不同蔗糖預(yù)處理濃度和時間對體胚發(fā)生率的影響從表2的結(jié)果中可以看出，蔗糖溶液預(yù)處理能明顯提高浙江楠的體細(xì)胞胚的發(fā)生率。但不同的蔗糖濃度和不同預(yù)處理時間對于體胚發(fā)生有顯著影響。0.5m的蔗糖溶液，預(yù)處理72h為最佳的預(yù)處理方法。在無菌條件下切開果實(shí)，取出幼胚，將幼胚置于0.5m蔗糖中，4℃預(yù)處理72h，將幼胚接種于含有不同激素濃度組合的ms+ch500mg/l+l-谷氨酰胺500mg/l固體培養(yǎng)基中進(jìn)行體胚發(fā)生實(shí)驗(yàn)。每個處理的幼嫩胚數(shù)均為15個，每皿接5個，共3皿，4個重復(fù)。培養(yǎng)溫度25℃±2℃，暗培養(yǎng)。表3不同培養(yǎng)基對于浙江楠幼胚體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的影響將浙江楠的未成熟合子胚接種到體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，經(jīng)過4周后在外植體表面可觀察到體細(xì)胞胚的發(fā)生。這些體細(xì)胞胚是通過直接發(fā)生途徑得到的，培養(yǎng)結(jié)束時，從外植體上脫落于培養(yǎng)基中。誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束時，在培養(yǎng)基中可觀察到發(fā)育良好的初生胚，部分初生胚表面有黃色、顆粒狀的胚性愈傷組織產(chǎn)生。得到的大部分體細(xì)胞胚形態(tài)正常，具兩片子葉，而部分體細(xì)胞胚的形態(tài)異常，通常表現(xiàn)為具3片子葉或多片子葉同時著生于一個胚上。不同的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基對于誘導(dǎo)率的影響如表3所示。從表3中可以看出，最適培養(yǎng)基為ms+ch500mg/l+l-谷氨酰胺500mg/l+6-ba1.0mg/l+2,4-d0.5mg/l。實(shí)施例2幼胚不同發(fā)育階段對體胚發(fā)生率的影響分別于2016年7月17日、7月24日、7月31日、8月7日、8月14日、8月21日采集4棵優(yōu)株的種子各150顆，其中135顆用于體胚發(fā)生試驗(yàn)，另15顆用做解剖觀察，分析各采集時間下的合子胚所處的發(fā)育階段。4棵優(yōu)株的種子分別記作a、b、c、d，將剝好的幼胚置于0.5m蔗糖中，4℃預(yù)處理72h，接種于bim培養(yǎng)基即ms+ch500mg/l+谷氨酰胺500mg/l+6-ba1.0mg/l+2,4-d0.5mg/l中進(jìn)行體胚發(fā)生實(shí)驗(yàn)，測定不同采集時間即合子胚不同發(fā)育階段對體胚發(fā)生率的影響。具體操作步驟同實(shí)施例1。表4幼胚的不同發(fā)育階段對于體胚發(fā)生的影響表4所示為不同發(fā)育階段的浙江楠合子胚對體胚發(fā)生率的影響，可以看出，處于球形胚或向心形胚轉(zhuǎn)換時的合子胚體胚發(fā)生率較高。實(shí)施例3體細(xì)胞胚的增殖將誘導(dǎo)所得的體細(xì)胞胚置于增殖培養(yǎng)基，進(jìn)行增殖。每個處理的體胚數(shù)均為25個，每皿接5個，共5皿，每個處理設(shè)3次重復(fù)。培養(yǎng)溫度25℃±2℃，暗培養(yǎng)。表5不同增殖培養(yǎng)基對于體細(xì)胞胚增殖的影響1234566-ba0001.01.01.0naa0.10.51.00.10.51.0增殖系數(shù)4.8±1.314.3±2.47.9±2.05.2±1.96.4±2.34.0±1.4將誘導(dǎo)所得的初生胚在增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，3周后觀察到初生胚表面產(chǎn)生類似母體的白色胚狀結(jié)構(gòu)，這是通過次生胚發(fā)生方式得到的次生胚。延長增殖培養(yǎng)的時間，可觀察到次生胚表面有胚性愈傷組織的產(chǎn)生。楠木的次生胚極容易發(fā)生，增殖培養(yǎng)一個月即可得到10倍以上的次生胚，并且即使是在已經(jīng)成熟變綠的體細(xì)胞胚，甚至已經(jīng)萌發(fā)的體細(xì)胞胚上，也可以觀察到次生胚的發(fā)生。次生胚發(fā)生一旦開始，得到的次生胚上又可以產(chǎn)生新的次生胚，這種不斷循環(huán)的次生胚重復(fù)發(fā)生在增殖培養(yǎng)基上可以長期持續(xù)，使次生胚數(shù)量快速增加。經(jīng)過4周統(tǒng)計，最佳增殖培養(yǎng)基為ms+naa0.5mg/l。實(shí)施例4浙江楠胚性愈傷組織的獲得胚性愈傷組織在體細(xì)胞的誘導(dǎo)階段即可產(chǎn)生，但是發(fā)生的頻率很低。而將誘導(dǎo)所得的體細(xì)胞胚置于增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時，1-2個月后，體細(xì)胞胚表面產(chǎn)生次生胚，并伴隨有胚性愈傷組織的形成。浙江楠的胚性愈傷組織在增殖培養(yǎng)基上可以長期保存，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，每隔半個月進(jìn)行繼代對于保持胚性愈傷組織的狀態(tài)非常重要，長時間不繼代會導(dǎo)致部分愈傷組織褐變，而部分愈傷組織則發(fā)育為體細(xì)胞胚。而這些由愈傷組織發(fā)育成的體細(xì)胞胚也可以通過規(guī)律性的繼代得以保持，延長或縮短繼代時間間隔，胚性愈傷組織又會形成。因此在浙江楠的各個胚性系培養(yǎng)過程中，經(jīng)?？梢钥吹脚咝杂鷤M織和體細(xì)胞胚共同存在的現(xiàn)象。實(shí)施例5浙江楠體細(xì)胞胚的萌發(fā)次生胚轉(zhuǎn)入萌發(fā)培養(yǎng)基進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)，在ms培養(yǎng)基中添加tdz、6-ba、naa、iba生長調(diào)節(jié)劑，具體見表6。2個月后統(tǒng)計萌發(fā)率和觀察體胚表型和生根情況。試驗(yàn)得知浙江楠體胚萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基為ms+6-ba1.0mg/l+iba0.1mg/l。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)2個月后減小iba濃度，萌發(fā)得到的再生植株能更好的生長，培養(yǎng)3個月后可發(fā)現(xiàn)生長旺盛的幼苗。表6不同激素組合對體胚萌發(fā)的影響以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁12