專利名稱：通過體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)四合木再生植株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)四合木再生植株的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
四合木(Tetraena mongolica Maxim)，落葉小灌木，強(qiáng)旱生植物，是1. 4億年前古 地中海孑遺種，屬蒺藜科，四合木屬，單一種。主要分布于我國內(nèi)蒙古自治區(qū)西部巴彥高勒 至寧夏回族自治區(qū)賀蘭山東麓的石嘴山之間，多生于石質(zhì)低山，沙礫質(zhì)高平原及山前洪積 扇等地，目前僅存有1萬公頃左右。四合木以有性生殖為主，但僅有11%的植株能正常開 花，結(jié)實(shí)率低、胚胎敗育率高。而且由于其種子對萌發(fā)條件要求苛刻，僅的種子能順利成 熟、實(shí)現(xiàn)繁殖。四合木的生殖特征決定了它繁殖更新速度非常緩慢。此外，近年來，由于過 度放牧和工廠建設(shè)中濫墾濫伐，嚴(yán)重破壞了四合木的生存環(huán)境，使這一物種種群的面積和 現(xiàn)存數(shù)量越來越少、日漸瀕危。有專家認(rèn)為，四合木具有極高的保護(hù)和科學(xué)研究的價值它的葉和嫩枝中能富集 Fe、Mn、Cu、Zn等多種微量元素；含有生物堿、黃酮類、有機(jī)酸類、酚性化合物，可作藥用；其 莖中能積累大量油脂，可用作生物能源的原料；研究其莖中大量積累三脂酰甘油的生理生 化基礎(chǔ)和分子機(jī)理對利用營養(yǎng)器官儲存油脂的生物工程具有重要的科學(xué)意義。綜上所述，研究四合木的快速繁殖技術(shù)，擴(kuò)大其種群、挽救這一瀕危植物，已迫在 眉睫。賈玉華等已對扦插繁殖做了研究，5-lOcm的枝條，用ABT處理后，插穗成活率較高。 何麗君等曾對四合木愈傷組織培養(yǎng)、誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎等進(jìn)行過一些研究，初步建立了組織 培養(yǎng)體系，分析了組織培養(yǎng)過程中的一些基本規(guī)律。但目前尚未見報道適用于四合木大規(guī) 模快速擴(kuò)繁、通過體細(xì)胞胚胎途徑誘導(dǎo)再生出完整植株的技術(shù)體系。體細(xì)胞胚胎的概念源于20世紀(jì)初德國植物學(xué)家Haberlandt提出的“細(xì)胞全能 性”的概念。他預(yù)言每個細(xì)胞都有在合適的條件下都能形成完整植株的潛力。后來，為了證 實(shí)這一論斷，許多科學(xué)家做了大量實(shí)驗(yàn)。經(jīng)過50余年的不斷探索，至1958年，Steward等 將離體培養(yǎng)的胡蘿卜脫分化細(xì)胞通過體細(xì)胞胚胎途徑形成完整的再生植株。此后，組織培 養(yǎng)技術(shù)迅速發(fā)展，通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑形成再生植株在金花茶、枸杞、木瓜、丁香、刺五 加、沙棘等多種灌木中均多有報道，而四合木中則尚未有成熟的體細(xì)胞胚胎發(fā)生、再生植株 的體系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種四合木的胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。本發(fā)明提供的胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基是在1/2MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加2-(N_嗎 啡啉)乙磺酸(MES)、水解酪蛋白、肌醇、活性炭、CuSO4, AgN03、6-BA、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆 醇、煙酸、肌醇、碳源和凝膠劑，得到的固體培養(yǎng)基；所述添加的物質(zhì)在所述胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的終濃度是:MES 0. 4-1. Og/ L、水解酪蛋白 450-550mg/L、肌醇 80_120mg/L、活性炭 0. 3-0. 7g/L、CuSO4 20_30mg/L、AgNO3 3-8mg/L、6-BA 0. 5-1. 5mg/L、鹽酸硫胺素 0. 5_12mg/L、鹽酸吡哆醇 0. 5-1. 5mg/L、煙 酸 0. 5-1. 5mg/L、肌醇 90-110mg/L ；所述1/2MS培養(yǎng)基的溶劑是水，溶質(zhì)如表2所示。表2、1/2MS培養(yǎng)基的溶質(zhì)
權(quán)利要求
四合木的胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，是在1/2MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加MES、水解酪蛋白、肌醇、活性炭、CuSO4、AgNO3、6 BA、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、煙酸、肌醇、碳源和凝膠劑，得到的固體培養(yǎng)基；所述添加的物質(zhì)在所述胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的終濃度是MES 0.4 1.0g/L、水解酪蛋白450 550mg/L、肌醇80 120mg/L、活性炭0.3 0.7g/L、CuSO4 20 30mg/L、AgNO3 3 8mg/L、6 BA 0.5 1.5mg/L、鹽酸硫胺素0.5 12mg/L、鹽酸吡哆醇0.5 1.5mg/L、煙酸0.5 1.5mg/L、肌醇90 110mg/L；所述1/2MS培養(yǎng)基的溶劑是水，溶質(zhì)如表2所示。
2.如權(quán)利要求1所述的胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特征在于所述添加的物質(zhì)在所 述胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的終濃度是MES 0. 6g/L、水解酪蛋白500mg/L、肌醇IOOmg/ L、活性炭 0. 5g/L,CuSO4 25. 025mg/L、AgN03 5mg/L、鹽酸硫胺素 10mg/L、鹽酸吡哆醇 lmg/L、 煙酸 lmg/L、肌醇 100mg/L、6-BA 1. Omg/L。
3.如權(quán)利要求1或2所述的胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特征在于所述凝膠劑是瓊 脂、卡拉膠或植物凝膠，優(yōu)選是植物凝膠；所述植物凝膠的終濃度是2-5g/L，優(yōu)選為3. Og/ L ；所述碳源是葡萄糖、麥芽糖或蔗糖，優(yōu)選為蔗糖；所述蔗糖的終濃度是25-40g/L，優(yōu)選 為 30g/L。
4.一種生產(chǎn)四合木再生植株的方法，包括如下步驟1)將切下的四合木的莖誘導(dǎo)，形成愈傷組織；2)將步驟1)得到的愈傷組織接入權(quán)利要求1-3中任一所述的胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng) 基中，形成胚性愈傷組織；3)將步驟2)得到的胚性愈傷組織進(jìn)行成熟和萌發(fā)培養(yǎng)，形成芽，得到所述再生植株。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于步驟1)中，所述誘導(dǎo)是將所述切下的四 合木的莖接入愈傷培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的；所述愈傷培養(yǎng)基是在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加2，4-D、6-BA、碳源和凝膠劑得到的固體培養(yǎng)基；所述2，4-D和6-BA在所述愈傷培養(yǎng)基中的終 濃度是如下a)或b)a)2，4-D0. 15-1. 35mg/L 和 6-BA 0. 05-1. 5mg/L ；b)2,4-D0. 25mg/L 和 6-BA 0. lmg/L ；所述MS培養(yǎng)基的溶劑是水，溶質(zhì)如表1所示。
6.如權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于所述方法還包括步驟1)和步驟2)之 間的繼代培養(yǎng)，所述繼代培養(yǎng)是將所述步驟1)得到的愈傷組織接入繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行繼 代培養(yǎng)；所述繼代培養(yǎng)基與所述愈傷培養(yǎng)基相同。
7.如權(quán)利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于步驟3)中，所述成熟和萌發(fā)培養(yǎng) 包括如下步驟將所述步驟2)得到的胚性愈傷組織接入成熟和萌發(fā)培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到芽； 所述成熟和萌發(fā)培養(yǎng)基是在權(quán)利要求1-3中任一所述的胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的基礎(chǔ) 上去掉所述活性炭、所述6-BA濃度減半并且添加NAA得到的培養(yǎng)基；所述成熟和萌發(fā)培養(yǎng) 基中的NAA終濃度是0. 1-0. 5mg/L，優(yōu)選是0. 5mg/L。
8.如權(quán)利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于所述方法還包括步驟3)之后的芽 伸長；所述芽伸長包括如下步驟將步驟3)得到的芽插入伸長培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得到小苗；所述伸長培養(yǎng)基在權(quán)利要求1-3中任一所述的胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加 GA3得到的培養(yǎng)基；所述伸長培養(yǎng)基中的GA3終濃度是0. 1-0. 2mg/L，優(yōu)選是0. lmg/L。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述方法還包括芽伸長之后的生根培養(yǎng)， 所述生根培養(yǎng)包括如下步驟將所述小苗插入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，得到帶根的植 株；所述生根培養(yǎng)基是1/2MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加MES、水解酪蛋白、肌醇、活性炭、CuSO4, AgN03、6-BA、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、煙酸、肌醇、碳源和凝膠劑，得到的固體培養(yǎng)基；所述添加的物質(zhì)在生根培養(yǎng)基中的終濃度是MES 0. 4-1. Og/L、肌醇80-120mg/L、IBA 0. 2-0. 5mg/L、鹽酸硫胺素10mg/L、鹽酸吡哆醇lmg/L、煙酸lmg/L、肌醇100mg/L ；所述1/2MS培養(yǎng)基的溶劑是水，溶質(zhì)如表2所示。
10.如權(quán)利要求4-9中任一所述的方法，其特征在于所述愈傷培養(yǎng)基、所述繼代培養(yǎng) 基和所述生根培養(yǎng)基中的凝膠劑均是瓊脂、卡拉膠或植物凝膠，均優(yōu)選是瓊脂；所述瓊脂的 終濃度均是5-10g/L，均優(yōu)選為8. Og/L ；所述愈傷培養(yǎng)基、所述繼代培養(yǎng)基和所述生根培養(yǎng)基中的碳源均是葡萄糖、麥芽糖或 蔗糖，均優(yōu)選為蔗糖；所述蔗糖的終濃度均是25-40g/L，均優(yōu)選為30g/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種通過體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)四合木再生植株的方法。該方法，包括如下步驟1)將切下的四合木的莖誘導(dǎo)，形成愈傷組織；2)將步驟1得到的愈傷組織接入胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，形成胚性愈傷組織；3)將步驟2得到的胚性愈傷組織進(jìn)行成熟和萌發(fā)培養(yǎng)，形成芽；4)將步驟3的芽接入伸長、生根培養(yǎng)基中，得到所述完整的再生植株。本研究旨在以四合木愈傷組織為外植體誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚胎、進(jìn)而形成再生植株，為建立高效穩(wěn)定的體細(xì)胞胚胎發(fā)生系統(tǒng)奠定基礎(chǔ)，這對于四合木的快速繁殖、基因工程、遺傳轉(zhuǎn)化、遺傳改良等方面的研究，都有十分重要的意義。
文檔編號A01H4/00GK101953306SQ201010511430
公開日2011年1月26日 申請日期2010年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月19日
發(fā)明者吳韓英, 平文麗, 李敏春, 許亦農(nóng) 申請人:中國科學(xué)院植物研究所