專利名稱：人胚源性神經(jīng)干細(xì)胞分化誘導(dǎo)過(guò)程中的細(xì)胞克隆誘導(dǎo)分化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種人胚源性神經(jīng)干細(xì)胞分化誘導(dǎo)過(guò)程中的細(xì)胞克隆誘導(dǎo)分化方法，其應(yīng)用于人胚源性神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的正常成人腦脊液誘導(dǎo)過(guò)程。
背景技術(shù)：
神經(jīng)干細(xì)胞是一種具有自我更新及廣泛分化潛能的細(xì)胞，它處于分化的非終末狀態(tài)，可通過(guò)對(duì)稱或不對(duì)稱分裂出新的干細(xì)胞或分化潛能逐漸變小的子細(xì)胞，最終產(chǎn)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)的3種主要細(xì)胞，即神經(jīng)元細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。人胚來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞除具有上述特點(diǎn)外，更以其與人體組織相容性好的的優(yōu)點(diǎn)成為神經(jīng)移植治療的理想細(xì)胞。目前誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞體外分化的方法很多，最常用的是血清，而神經(jīng)干細(xì)胞在腦脊液中的存活和分化情況尚不明確。本發(fā)明通過(guò)神經(jīng)干細(xì)胞在腦脊液環(huán)境中的培養(yǎng)，為神經(jīng)干細(xì)胞的移植治療提供理論依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提出一種人胚源性神經(jīng)干細(xì)胞分化誘導(dǎo)過(guò)程中的細(xì)胞克隆誘導(dǎo)分化方法，其應(yīng)用于人胚源性神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的正常成人腦脊液誘導(dǎo)過(guò)程，所述誘導(dǎo)過(guò)程應(yīng)用正常成人腦脊液培養(yǎng)基(DMEM/F12+B27+30%腦脊液)將原代培養(yǎng)的人胚來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞分化誘導(dǎo)為各類神經(jīng)細(xì)胞，在分化的不同時(shí)間對(duì)分化的細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，計(jì)算各類神經(jīng)細(xì)胞的比例。最終分別占(10. 88士0.79)%、 (86. 70 士 1. 99) %，少突膠質(zhì)細(xì)胞很少只有0 % 2 %。具體的，本發(fā)明的人胚源性神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的正常成人腦脊液誘導(dǎo)過(guò)程包括如下步驟Sl 原代細(xì)胞的分離和培養(yǎng)取胚齡13周水囊引產(chǎn)的新鮮人胚胎，無(wú)菌條件下分離出胚胎大腦皮層組織，剝除腦膜及表面血管，在PBS液中漂洗3次，用細(xì)吸管反復(fù)吹打組織碎塊至完全散開(kāi)，離心洗滌后吹打制成細(xì)胞懸液，經(jīng)100目不銹鋼濾網(wǎng)過(guò)濾，制成單細(xì)胞懸液，加入含 B 27(1 50) (GibcoBRL)和 EGF (Serotec. )20ng/ml、bFGF (Chemicon) 20ng/ ml的DMEM/F12(1 1) (GibcoBRL)無(wú)血清培養(yǎng)基，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為IX 105/ml，將原代細(xì)胞種植于25cm2培養(yǎng)瓶(8ml細(xì)胞懸液/瓶)，37°C、5 % (X)2條件下靜置培養(yǎng)。S2:克隆誘導(dǎo)分化選取單細(xì)胞形成的克隆球，機(jī)械分離成單細(xì)胞懸液，種植于多個(gè)培養(yǎng)皿中，置入多聚賴氨酸包被的玻片，用含有正常成人腦脊液培養(yǎng)基(DMEM/ F12+B27+30%腦脊液)培養(yǎng)，觀察其生長(zhǎng)分化情況，分別于1、3、7、14、21d行免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)。S3 免疫細(xì)胞化學(xué)染色將貼附有細(xì)胞的玻片取出用4%多聚甲醛固定，用SABC組織化學(xué)染色試劑盒分別檢測(cè)神經(jīng)微絲(neurofilament，NF)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、 feilc在分化細(xì)胞中的表達(dá)。S4 細(xì)胞計(jì)數(shù)免疫細(xì)胞化學(xué)染色NF(+)的細(xì)胞代表神經(jīng)元，GFAP (+)細(xì)胞代表星型膠質(zhì)細(xì)胞，Galc (+)細(xì)胞代表少突膠質(zhì)細(xì)胞，蘇木精復(fù)染成藍(lán)色的細(xì)胞代表總細(xì)胞數(shù)。倒置顯微鏡下O0X)對(duì)分化的細(xì)胞隨機(jī)選擇6個(gè)獨(dú)立視野計(jì)數(shù)NF (+)的細(xì)胞數(shù)、GFAP (+)細(xì)胞數(shù)、Galc (+)細(xì)胞數(shù)及總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算各系細(xì)胞比例并求其平均數(shù)。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在最早期的分化當(dāng)中神經(jīng)元占的比例較高，約為 27. 25%，正常成人腦脊液能誘導(dǎo)人胚來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞分化成神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞，與在胎牛血清中的分化相比星型膠質(zhì)細(xì)胞比例增多，而其他類型細(xì)胞比例無(wú)顯著性差異。神經(jīng)干細(xì)胞在腦脊液中可以存活和分化，為神經(jīng)干細(xì)胞的移植治療提供理論依據(jù)。


通過(guò)下面結(jié)合附圖的詳細(xì)描述，本發(fā)明前述的和其他的目的、特征和優(yōu)點(diǎn)將變得顯而易見(jiàn)。其中圖1所示為本發(fā)明的人胚源性神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的正常成人腦脊液誘導(dǎo)方法的步驟示意圖。
具體實(shí)施例方式如圖1所示為本發(fā)明的人胚源性神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的正常成人腦脊液誘導(dǎo)方法的步驟示意圖，所述方法具體實(shí)施步驟如下Sl 原代細(xì)胞的分離和培養(yǎng)取胚齡13周水囊引產(chǎn)的新鮮人胚胎，無(wú)菌條件下分離出胚胎大腦皮層組織，剝除腦膜及表面血管，在PBS液中漂洗3次，用細(xì)吸管反復(fù)吹打組織碎塊至完全散開(kāi)，離心洗滌后吹打制成細(xì)胞懸液，經(jīng)100目不銹鋼濾網(wǎng)過(guò)濾，制成單細(xì)胞懸液，加入含 B 27(1 50) (GibcoBRL)和 EGF (Serotec. )20ng/ml、bFGF (Chemicon) 20ng/ ml的DMEM/F12(1 1) (GibcoBRL)無(wú)血清培養(yǎng)基，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為IX 105/ml，將原代細(xì)胞種植于25cm2培養(yǎng)瓶(8ml細(xì)胞懸液/瓶)，37°C、5 % (X)2條件下靜置培養(yǎng)。S2:克隆誘導(dǎo)分化選取單細(xì)胞形成的克隆球，機(jī)械分離成單細(xì)胞懸液，種植于多個(gè)培養(yǎng)皿中，置入多聚賴氨酸包被的玻片，用含有正常成人腦脊液培養(yǎng)基(DMEM/ F12+B27+30%腦脊液)培養(yǎng)，觀察其生長(zhǎng)分化情況，分別于1、3、7、14、21d行免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)。S3 免疫細(xì)胞化學(xué)染色將貼附有細(xì)胞的玻片取出用4%多聚甲醛固定，用SABC 組織化學(xué)染色試劑盒分別檢測(cè)神經(jīng)微絲(neurofilament，NF)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、 feilc在分化細(xì)胞中的表達(dá)。S4細(xì)胞計(jì)數(shù)免疫細(xì)胞化學(xué)染色NF (+)的細(xì)胞代表神經(jīng)元，GFAP (+)細(xì)胞代表星型膠質(zhì)細(xì)胞，Galc (+)細(xì)胞代表少突膠質(zhì)細(xì)胞，蘇木精復(fù)染成藍(lán)色的細(xì)胞代表總細(xì)胞數(shù)。倒置顯微鏡下(20 X)對(duì)分化的細(xì)胞隨機(jī)選擇6個(gè)獨(dú)立視野計(jì)數(shù)NF (+)的細(xì)胞數(shù)、GFAP (+)細(xì)胞數(shù)、Galc (+)細(xì)胞數(shù)及總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算各系細(xì)胞比例并求其平均數(shù)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析如下人胚來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞在體外懸浮生長(zhǎng)，常聚集成球即神經(jīng)球(neurosphere)。 將生長(zhǎng)良好的神經(jīng)球種植在經(jīng)多聚氨酸處理的培養(yǎng)皿中，在含有正常成人腦脊液培養(yǎng)基 (DMEM/F12+B27+30%腦脊液)中可發(fā)現(xiàn)神經(jīng)球貼壁現(xiàn)象。神經(jīng)球在新鮮正常成人腦脊液中的分化過(guò)程與在胎牛血清中的相似，只是貼壁時(shí)間較晚04 48h)，貼壁的神經(jīng)球有 50% 90%，未貼壁的神經(jīng)球?qū)⒅饾u死亡。貼壁的神經(jīng)球2天后，周?chē)从屑?xì)胞分化游出， 神經(jīng)球的直徑放射狀擴(kuò)大，聚集著許多由神經(jīng)球中遷移出來(lái)的單極和多極細(xì)胞，形狀酷似神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，神經(jīng)球周?chē)坞x出來(lái)的細(xì)胞越來(lái)越多，這些細(xì)胞通過(guò)突起與鄰近細(xì)胞形成聯(lián)系，3周以后這些細(xì)胞不再增多，呈穩(wěn)定狀態(tài)。免疫細(xì)胞化學(xué)顯示，含有正常成人腦脊液培養(yǎng)基中，從神經(jīng)球中游離分化出的細(xì)胞成單極或多極，細(xì)胞化學(xué)分別為NF(+)細(xì)胞、GFAP(+)細(xì)胞和細(xì)胞。其中NF(+) 細(xì)胞由開(kāi)始時(shí)的06士3.40) %降至(10. 00士0. 74)%，GFAP⑴細(xì)胞數(shù)逐漸增多，從 (73. 53% 士3. 40)%升至(89. 83% ±1.96) %0 Galc (+)細(xì)胞在整個(gè)分化過(guò)程中均很少， 且在1周后才出現(xiàn)，約占0% 1.8%。NESTIN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)成直線下降，貼壁神經(jīng)球細(xì)胞呈 Nestin抗原全陽(yáng)性，使整個(gè)神經(jīng)球體成藍(lán)色(間接熒光染色)，14d時(shí)尚可見(jiàn)部分陽(yáng)性細(xì)胞， 21d尚有少量Nestin表達(dá)，30d后Nestin染色幾無(wú)陽(yáng)性表現(xiàn)。以上結(jié)果表明，在最早期的分化當(dāng)中神經(jīng)元占的比例較高，約為27. 25%，正常成人腦脊液能誘導(dǎo)人胚來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞分化成神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞，與在胎牛血清中的分化相比星型膠質(zhì)細(xì)胞比例增多，而其他類型細(xì)胞比例無(wú)顯著性差異。神經(jīng)干細(xì)胞在腦脊液中可以存活和分化，為神經(jīng)干細(xì)胞的移植治療提供理論依據(jù)。本發(fā)明并不局限于所述的實(shí)施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的精神即公開(kāi)范圍內(nèi)，仍可作一些修正或改變，故本發(fā)明的權(quán)利保護(hù)范圍以權(quán)利要求書(shū)限定的范圍為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1. 一種人胚源性神經(jīng)干細(xì)胞分化誘導(dǎo)過(guò)程中的細(xì)胞克隆誘導(dǎo)分化方法，其應(yīng)用于人胚源性神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的正常成人腦脊液誘導(dǎo)過(guò)程，所述誘導(dǎo)過(guò)程包括步驟原代細(xì)胞的分離和培養(yǎng)、克隆誘導(dǎo)分化、免疫細(xì)胞化學(xué)染色以及細(xì)胞計(jì)數(shù)；其中所述克隆誘導(dǎo)分化的步驟具體為選取單細(xì)胞形成的克隆球，機(jī)械分離成單細(xì)胞懸液，種植于多個(gè)培養(yǎng)皿中，置入多聚賴氨酸包被的玻片，用含有正常成人腦脊液培養(yǎng)基(DMEM/F12+B27+30%腦脊液)培養(yǎng)，觀察其生長(zhǎng)分化情況，分別于l、3、7、14、21d行免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)；。
全文摘要
本發(fā)明提出一種人胚源性神經(jīng)干細(xì)胞分化誘導(dǎo)過(guò)程中的細(xì)胞克隆誘導(dǎo)分化方法，其應(yīng)用于人胚源性神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的正常成人腦脊液誘導(dǎo)過(guò)程，所述誘導(dǎo)過(guò)程包括如下步驟原代細(xì)胞的分離和培養(yǎng)；克隆誘導(dǎo)分化；免疫細(xì)胞化學(xué)染色；以及細(xì)胞計(jì)數(shù)。本發(fā)明應(yīng)用正常成人腦脊液培養(yǎng)基將原代培養(yǎng)的人胚來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞分化誘導(dǎo)為各類神經(jīng)細(xì)胞，在分化的不同時(shí)間對(duì)分化的細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，計(jì)算各類神經(jīng)細(xì)胞的比例。其誘導(dǎo)人胚來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞分化成神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞，與在胎牛血清中的分化相比星型膠質(zhì)細(xì)胞比例增多，而其他類型細(xì)胞比例無(wú)顯著性差異。神經(jīng)干細(xì)胞在腦脊液中可以存活和分化，為神經(jīng)干細(xì)胞的移植治療提供理論依據(jù)。
文檔編號(hào)C12N5/0735GK102533638SQ20111044791
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2011年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月27日
發(fā)明者陸華 申請(qǐng)人:陸華