專利名稱：人胚皮層神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種人胚皮層神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法。
技術(shù)背景
神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的重大突破，為神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)組織移植等研究領(lǐng)域開辟了廣闊前景。神經(jīng)干細(xì)胞是一種具有自我更新及廣泛分化潛能的細(xì)胞，它處于分化的非終末狀態(tài)，可通過對稱或不對稱分裂出新的干細(xì)胞或分化潛能逐漸變小的子細(xì)胞，最終產(chǎn)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)的三種主要細(xì)胞，即神經(jīng)元細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。一般認(rèn)為神經(jīng)干細(xì)胞主要存在于哺乳動(dòng)物胎腦的紋狀體、小腦半球、腦室區(qū)等，成年哺乳動(dòng)物腦的側(cè)腦室壁和海馬等區(qū)。有關(guān)哺乳動(dòng)物胚胎階段和成年動(dòng)物在特定腦區(qū)存在神經(jīng)干細(xì)胞已不斷得到證實(shí)，但對人類神經(jīng)干細(xì)胞的研究尚少。發(fā)明內(nèi)容
從人胚皮層中分離培養(yǎng)并鑒定神經(jīng)干細(xì)胞利用無血清培養(yǎng)和單細(xì)胞克隆技術(shù)在人胚皮層中分離具有單細(xì)胞克隆能力的細(xì)胞，并進(jìn)行培養(yǎng)、傳代，貼壁分化觀察，采用間接免疫熒光檢測克隆細(xì)胞的神經(jīng)巢蛋白(Nestin)抗原和分化后特異性成熟神經(jīng)細(xì)胞抗原的表達(dá)。
具體的，為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，所述的人胚皮層神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法包括以下步驟
Sl 原代細(xì)胞的分離和培養(yǎng)取胚齡12周水囊引產(chǎn)的新鮮人胚胎，在無菌條件下分離出胎腦大腦皮層，剝離硬膜及表面血管，在DMEM/F12(1 1)的細(xì)胞培養(yǎng)液中漂洗三次，用細(xì)吸管反復(fù)吹打瓶內(nèi)組織碎塊至完全散開，制成細(xì)胞懸液，經(jīng)100目不銹鋼網(wǎng)過濾， 制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)分胎藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞加入含化7和bFGF的DMEM/F12無血清培養(yǎng)基， 調(diào)整細(xì)胞含量為1 X IO51Iir1，將細(xì)胞懸液分裝于25ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶，每瓶3ml，37°C，5 % CO2條件下靜置培養(yǎng)7天。
S2 傳代培養(yǎng)及單細(xì)胞克隆、傳代將原代培養(yǎng)7天后的細(xì)胞克隆懸液用吸管輕柔吹打進(jìn)行機(jī)械分離，制成單細(xì)胞懸液，用含化7和bFGF的無血清培養(yǎng)液將細(xì)胞懸液按 IXIOW濃度傳代接種于培養(yǎng)瓶，在37°C，5% CO2條件下靜置培養(yǎng)7天，同時(shí)進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)，計(jì)數(shù)每代的克隆形成率，每7-9天機(jī)械分離傳代，方法同前。采用有限稀釋法，將原代克隆細(xì)胞制成的單細(xì)胞懸液，稀釋到40Π1Γ1，于96孔培養(yǎng)板中滴加稀釋的細(xì)胞懸液，選取僅有一個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)孔作記號(hào)，并動(dòng)態(tài)觀察。待長成單細(xì)胞克隆球后機(jī)械分離成單細(xì)胞懸液，再將一個(gè)克隆的所有細(xì)胞種至培養(yǎng)瓶中，待次代克隆長成后連續(xù)傳代，最后得到大量來自某單個(gè)細(xì)胞的亞克隆。
S3 克隆誘導(dǎo)分化分別選取部分傳代及單細(xì)胞克隆的細(xì)胞種植于多個(gè)多聚賴氨酸包被的玻片上，并加入含血清培養(yǎng)基(DMEM/F12/B27/bFGF+5 %胎牛血清)，觀察其生長分化情況，分別于7天、14天行免疫熒光檢測。
S4 間接免疫熒光檢測將克隆細(xì)胞滴至多聚賴氨酸包被的玻片上，貼壁12小時(shí)后用4%多聚甲醛固定，行Nestin抗體免疫熒光染色(抗Nestin IgG)。分別將傳代及單細(xì)胞克隆的細(xì)胞種植于預(yù)置多聚賴氨酸包被玻片的含血清培養(yǎng)集中，于7天、14天時(shí)取出， 進(jìn)行Nestin、NeuN, GFAP, CNP抗體的免疫熒光單標(biāo)染色及NeuN和CNP抗體的免疫熒光雙標(biāo)染色。
本發(fā)明采用無血清培養(yǎng)和單細(xì)胞克隆技術(shù)從從胚齡12周的新鮮人胚皮層中成功建立一株人胚神經(jīng)干細(xì)胞，該細(xì)胞具有連續(xù)克隆能力，可傳達(dá)培養(yǎng)，表達(dá)神經(jīng)巢蛋白抗原。 分化后的細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的特異性抗原。


通過下面結(jié)合附圖的詳細(xì)描述，本發(fā)明前述的和其他的目的、特征和優(yōu)點(diǎn)將變得顯而易見。其中
圖1所示為本發(fā)明的人胚皮層神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法的步驟流程圖。
具體實(shí)施方式
如圖1所示的本發(fā)明的人胚皮層神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法的步驟流程圖，所述方法包括以下步驟
Sl 原代細(xì)胞的分離和培養(yǎng)取胚齡12周水囊引產(chǎn)的新鮮人胚胎，在無菌條件下分離出胎腦大腦皮層，剝離硬膜及表面血管，在DMEM/F12(1 1)的細(xì)胞培養(yǎng)液中漂洗三次，用細(xì)吸管反復(fù)吹打瓶內(nèi)組織碎塊至完全散開，制成細(xì)胞懸液，經(jīng)100目不銹鋼網(wǎng)過濾， 制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)分胎藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞加入含化7和bFGF的DMEM/F12無血清培養(yǎng)基， 調(diào)整細(xì)胞含量為1 X IO51Iir1，將細(xì)胞懸液分裝于25ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶，每瓶3ml，37°C，5 % CO2條件下靜置培養(yǎng)7天。
S2 傳代培養(yǎng)及單細(xì)胞克隆、傳代將原代培養(yǎng)7天后的細(xì)胞克隆懸液用吸管輕柔吹打進(jìn)行機(jī)械分離，制成單細(xì)胞懸液，用含B27和bFGF的無血清培養(yǎng)液將細(xì)胞懸液按 IXIOW濃度傳代接種于培養(yǎng)瓶，在37°C，5% CO2條件下靜置培養(yǎng)7天，同時(shí)進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)，計(jì)數(shù)每代的克隆形成率，每7-9天機(jī)械分離傳代，方法同前。采用有限稀釋法，將原代克隆細(xì)胞制成的單細(xì)胞懸液，稀釋到40Π1Γ1，于96孔培養(yǎng)板中滴加稀釋的細(xì)胞懸液，選取僅有一個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)孔作記號(hào)，并動(dòng)態(tài)觀察。待長成單細(xì)胞克隆球后機(jī)械分離成單細(xì)胞懸液，再將一個(gè)克隆的所有細(xì)胞種至培養(yǎng)瓶中，待次代克隆長成后連續(xù)傳代，最后得到大量來自某單個(gè)細(xì)胞的亞克隆。
S3 克隆誘導(dǎo)分化分別選取部分傳代及單細(xì)胞克隆的細(xì)胞種植于多個(gè)多聚賴氨酸包被的玻片上，并加入含血清培養(yǎng)基(DMEM/F12/B27/bFGF+5 %胎牛血清)，觀察其生長分化情況，分別于7天、14天行免疫熒光檢測。
S4 間接免疫熒光檢測將克隆細(xì)胞滴至多聚賴氨酸包被的玻片上，貼壁12小時(shí)后用4%多聚甲醛固定，行Nestin抗體免疫熒光染色(抗Nestin IgG)。分別將傳代及單細(xì)胞克隆的細(xì)胞種植于預(yù)置多聚賴氨酸包被玻片的含血清培養(yǎng)集中，于7天、14天時(shí)取出， 進(jìn)行Nestin、NeuN, GFAP, CNP抗體的免疫熒光單標(biāo)染色及NeuN和CNP抗體的免疫熒光雙標(biāo)染色。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
1.克隆細(xì)胞形態(tài)觀察人胚皮層原代培養(yǎng)細(xì)胞成圓形球狀，懸浮生長，經(jīng)分胎藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞在80 %以上，培養(yǎng)7天時(shí)細(xì)胞數(shù)目明顯增加，可見數(shù)十個(gè)至數(shù)萬個(gè)細(xì)胞組成的細(xì)胞球，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，邊界清楚，折光性強(qiáng)。有少數(shù)細(xì)胞貼壁生長，分化出有突起的神經(jīng)原細(xì)胞，經(jīng)傳代克隆后仍未出現(xiàn)與原代培養(yǎng)相同的大量次代克隆。單細(xì)胞克隆顯示單個(gè)細(xì)胞在培養(yǎng)3天時(shí)細(xì)胞克隆增大至數(shù)十個(gè)，此后隨密度增加生長加快，經(jīng)傳代后仍成懸浮生長，細(xì)胞形態(tài)不變。
2.誘導(dǎo)分化結(jié)果將傳代克隆及單細(xì)胞克隆后獲得的克隆細(xì)胞經(jīng)胎牛血清培養(yǎng) 12h后即見部分克隆細(xì)胞團(tuán)向四周發(fā)出放射狀細(xì)胞索，2天后可見大部分細(xì)胞貼壁生長，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞索不斷增粗和伸長，一周后大部分細(xì)胞已從其邊緣向外遷移分化成大量形態(tài)不一的、分散成片的多突起星狀細(xì)胞或神經(jīng)原樣細(xì)胞，突起互相交織成網(wǎng)狀，2周后部分神經(jīng)細(xì)胞開始衰退、死亡。
3.間接免疫熒光檢測將原代、傳代和單細(xì)胞克隆的細(xì)胞進(jìn)行Nestin免疫熒光染色，結(jié)果顯示大部分細(xì)胞呈Nestin抗原陽性，尤其是傳代3次以上的克隆90%以上均呈陽性。NeuN免疫熒光染色呈陰性。經(jīng)含血清培養(yǎng)7天、14天行NeuN、GFAP和CNP免疫熒光單標(biāo)染色顯示均有陽性表達(dá)細(xì)胞存在，NeuN、GFAP和CNP雙標(biāo)染色證實(shí)有神經(jīng)元細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞同時(shí)存在。Nestin免疫熒光染色在7天時(shí)尚可見部分陽性細(xì)胞，2周時(shí)幾乎未找到 Nestin陽性細(xì)胞。
本發(fā)明并不局限于所述的實(shí)施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的精神即公開范圍內(nèi)，仍可作一些修正或改變，故本發(fā)明的權(quán)利保護(hù)范圍以權(quán)利要求書限定的范圍為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1. 一種人胚皮層神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其包括以下步驟51原代細(xì)胞的分離和培養(yǎng)取胚齡12周水囊引產(chǎn)的新鮮人胚胎，在無菌條件下分離出胎腦大腦皮層，剝離硬膜及表面血管，在DMEM/F12(1 1)的細(xì)胞培養(yǎng)液中漂洗三次，用細(xì)吸管反復(fù)吹打瓶內(nèi)組織碎塊至完全散開，制成細(xì)胞懸液，經(jīng)100目不銹鋼網(wǎng)過濾，制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)分胎藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞加入含B27和bFGF的DMEM/F12無血清培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞含量為1 X IO51Iir1，將細(xì)胞懸液分裝于25ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶，每瓶3ml,37°C,5% CO2條件下靜置培養(yǎng)7天；52傳代培養(yǎng)及單細(xì)胞克隆、傳代將原代培養(yǎng)7天后的細(xì)胞克隆懸液用吸管輕柔吹打進(jìn)行機(jī)械分離，制成單細(xì)胞懸液，用含化7和bFGF的無血清培養(yǎng)液將細(xì)胞懸液按1 X IO41Iir1 濃度傳代接種于培養(yǎng)瓶，在37°C，5% CO2條件下靜置培養(yǎng)7天，同時(shí)進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)，計(jì)數(shù)每代的克隆形成率，每7-9天機(jī)械分離傳代，方法同前；采用有限稀釋法，將原代克隆細(xì)胞制成的單細(xì)胞懸液，稀釋到40Π1Γ1，于96孔培養(yǎng)板中滴加稀釋的細(xì)胞懸液，選取僅有一個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)孔作記號(hào)，并動(dòng)態(tài)觀察；待長成單細(xì)胞克隆球后機(jī)械分離成單細(xì)胞懸液，再將一個(gè)克隆的所有細(xì)胞種至培養(yǎng)瓶中，待次代克隆長成后連續(xù)傳代，最后得到大量來自某單個(gè)細(xì)胞的亞克隆；53克隆誘導(dǎo)分化分別選取部分傳代及單細(xì)胞克隆的細(xì)胞種植于多個(gè)多聚賴氨酸包被的玻片上，并加入含血清培養(yǎng)基(DMEM/F12/B27/bFGF+5%胎牛血清)，觀察其生長分化情況，分別于7天、14天行免疫熒光檢測；54間接免疫熒光檢測將克隆細(xì)胞滴至多聚賴氨酸包被的玻片上，貼壁12小時(shí)后用 4%多聚甲醛固定，行Nestin抗體免疫熒光染色(抗Nestin IgG)；分別將傳代及單細(xì)胞克隆的細(xì)胞種植于預(yù)置多聚賴氨酸包被玻片的含血清培養(yǎng)集中，于7天、14天時(shí)取出，進(jìn)行 Nestin, NeuN, GFAP, CNP抗體的免疫熒光單標(biāo)染色及NeuN和CNP抗體的免疫熒光雙標(biāo)染色。
全文摘要
本發(fā)明提出一種人胚皮層神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其包括以下步驟原代細(xì)胞的分離和培養(yǎng)；傳代培養(yǎng)及單細(xì)胞克隆、傳代；克隆誘導(dǎo)分化；以及間接免疫熒光檢測。本發(fā)明采用無血清培養(yǎng)和單細(xì)胞克隆技術(shù)從從胚齡12周的新鮮人胚皮層中成功建立一株人胚神經(jīng)干細(xì)胞，該細(xì)胞具有連續(xù)克隆能力，可傳達(dá)培養(yǎng)，表達(dá)神經(jīng)巢蛋白抗原。分化后的細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的特異性抗原。
文檔編號(hào)C12N5/0735GK102533636SQ20111044787
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月27日
發(fā)明者陸華 申請人:陸華