專利名稱：一種簡易快速的豬囊胚差異染色方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種簡易快速的豬囊胚差異染色方法，屬于發(fā)育生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬既是重要的肉用家畜，又是良好的潛在生物醫(yī)學(xué)模型動物。但是，隨著豬相關(guān)研究課題的進展，越來越多的學(xué)者們意識到豬早期胚胎發(fā)育方面的解析遠不如小鼠清晰的事實已經(jīng)構(gòu)成豬在生物醫(yī)學(xué)模型方面發(fā)展的瓶頸。熒光染料在細胞計數(shù)上的應(yīng)用可以被追溯到上個世紀80年代，由Ebert等人在嚙齒類動物上的初次嘗試和此后陸續(xù)在其他哺乳動物研究中的利用?，F(xiàn)有技術(shù)對于豬囊胚細胞染色存在染色效率較低、染色周期長等缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種簡易快速的豬囊胚差異染色方法。為解決上述技術(shù) 問題，本發(fā)明的技術(shù)方案為:I)酸性操作液去除豬囊胚透明帶；2)將囊胚放入液體I中同時進行透膜和滋養(yǎng)層細胞特異性染色過程；3)將囊胚放入液體2中進行囊胚全細胞核染色的過程；4)對胚胎進行常規(guī)壓片，在正置熒光顯微鏡上觀察。所述液體I的組成為:含10_50ug/mL碘化丙唳(Propidium iodide, PI)和
0.01-0.1%(V/V) TritonX 的 PBS。所述液體2的組成為:含Hoechst33342的PBS。其中液體I 優(yōu)選組成為:含 30ug/mL PI 和 0.02% (V/V) TritonXlOO 的 PBS0囊胚在液體I中處理時間優(yōu)選40s。液體2 的優(yōu)選組成為:含 10ug/mL Hoechst33342 的 PBS。囊胚在液體2中處理時間優(yōu)選5min。本發(fā)明簡化了對豬囊胚進行差異染色的實驗步驟，大大縮短了實驗時間(只需IOmin),并且降低了實驗成本。


圖1利用24孔板進行豬囊胚差異染色操作的圖示。依據(jù)所需的平行染色的組數(shù)決定添加幾行液體。A列加入酸性操作液，作用5s ；B列加入清洗液，作用30s ；C列加入液體1，作用40s ；D列加入清洗液，作用30s ；E列加入液體2，作用5min ；F列加入清洗液，作用 lmin。圖2豬囊胚差異染色結(jié)果。
具體實施例方式實施例1
液體I 的組成為:含 30ug/mL PI 和 0.02% (V/V) TritonXlOO 的 PBS。液體2 的組成為:含 10ug/mL Hoechst33342 的 PBS。下面結(jié)合說明書附圖對本發(fā)明進一步說明。準備工作:1，實驗前按著圖1說明在24孔板一行中加入相應(yīng)的液體。每一行為一組，需要多組進行同步染色時將液體照第一行給出的順序依次加入24板其他行中。每一行用于一組實驗。2，在載玻片上添加5ul防猝滅劑用于最后壓片。3，拉制2個直徑較囊胚直徑大一些的玻璃口吸管，將口燒盾，以免操作中玻璃刺刮破囊胚。4，實驗開始時將24孔板避光放在35度溫臺上。實驗操作:1，從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)6-7天的胚胎，在實體顯微鏡下挑出囊胚，按著圖1所示將囊胚加入24孔板A孔，立即換口吸管。依據(jù)所需的平行染色的組數(shù)決定添加幾行液體。A列加入酸性操作液，作用5s ；B列加入清洗液，作用30s ；C列加入液體1，作用40s ；D列加入清洗液，作用30s ；E列加入液體2，作用5min ；F列加入清洗液，作用lmin。2，經(jīng)歷6孔操作后，將囊胚加入以上準備的防猝滅劑中，蓋上18X 18mm蓋玻片，在正置熒光顯微鏡下觀察。注意事項:1，A，B孔之間必須更換口吸管，因為用于從培養(yǎng)液中吸出囊胚的口吸管上沾的石蠟油會對去了透明帶的囊胚產(chǎn)生破壞。2，實驗全程注意避光。3，所有過程在水平搖床上進行，轉(zhuǎn)速調(diào)至70rpm以下。結(jié)果分析:將制作的片子分別用UV光和564-nm波長激發(fā)光下進行拍照。并對，兩個圖片進
行重疊。由于UV光所得信號為對囊胚所有細胞核進行染色的HoeChst33342的藍色信號，而564-nm波長激發(fā)光所得信號為PI對囊胚外層滋養(yǎng)層細胞細胞核染色的紅色信號，經(jīng)過重疊，外層由于同時發(fā)出藍色和紅色熒光而顯示為粉色，而內(nèi)細胞團細胞只顯示藍色信號。圖2示例，我們可以清晰的辨認出該囊胚中的滋養(yǎng)層細胞數(shù)(粉色核)為48，內(nèi)細胞團細胞數(shù)(藍色核)為11,總細胞數(shù)為59。實施例2與實施例1區(qū)別在于:液體I 組成:液體 I 的組成為:含 10ug/mL PI 和 0.1% (V/V) TritonXlOO 的 PBS。液體2 的組成為:含 20ug/mL Hoechst33342 的 PBS。實施例3與實施例1區(qū)別在于:液體I 組成:液體 I 的組成為:含 50ug/mL PI 和 0.01% (V/V)TritonX100 的 PBS0液體 2 的組成為:含 20ug/mL Hoechst33342 的 PBS。
權(quán)利要求
1.一種簡易快速的豬囊胚差異染色方法，其特征在于，步驟如下: 1)酸性操作液去除豬囊胚透明帶； 2)將囊胚放入液體I中同時進行透膜和滋養(yǎng)層細胞特異性染色過程； 3)將囊胚放入液體2中進行囊胚全細胞核染色的過程； 4)對胚胎進行常規(guī)壓片，在正置熒光顯微鏡上觀察； 所述液體I的組成為:含10-50ug/mL碘化丙啶和0.01-0.1%(V/V) TritonX的PBS ； 所述液體2的組成為:含Hoechst33342的PBS。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述液體I組成為含30ug/mLPI和0.02%TritonX100 的 PBS。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述液體2組成為含10ug/mLHoechst33342的 PBS。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，囊胚在液體I中處理時間為40s。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，囊胚在液體2中處理時間為5min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，具體步驟如下: (一)準備工作: 1)在24孔板中A列加入酸 性操作液，B列加入清洗液，C列加入液體1，D列加入清洗液，E列加入液體2，F(xiàn)列加入清洗液； 2)在載玻片上添加5ul防猝滅劑用于最后壓片； 3)拉制2個直徑較囊胚直徑大的玻璃口吸管，將口燒盾，以免操作中玻璃刺刮破囊胚； 4)實驗開始時將24孔板避光放在35度溫臺上； (二)實驗操作: 1)從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)6-7天的胚胎，在實體顯微鏡下挑出囊胚，將囊胚加入24孔板A孔，立即換口吸管；A列作用5s，B列作用30s，C列作用40s，D列作用30s，E列作用5min，F(xiàn)列作用Imin ； 2)經(jīng)歷6孔操作后，將囊胚加入以上準備的防猝滅劑中，蓋上18X18mm蓋玻片，在正置突光顯微鏡下觀察。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述方法，其特征在于，A,B列之間更換口吸管。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述方法，其特征在于，操作全程避光。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述方法，其特征在于，操作過程在水平搖床上進行，轉(zhuǎn)速調(diào)至70rpm以下。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種簡易快速的豬囊胚差異染色方法，屬于發(fā)育生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。是對豬囊胚進行表面活性劑TritonX100透膜處理后，利用兩種核染料碘化丙啶和Hoechst的分子大小上的區(qū)別對囊胚外層滋養(yǎng)層細胞和內(nèi)側(cè)的內(nèi)細胞團細胞進行差異染色。本發(fā)明簡化了對豬囊胚進行差異染色的實驗步驟，大大縮短了實驗時間，并且降低了實驗成本。
文檔編號G01N1/30GK103245546SQ20131016306
公開日2013年8月14日 申請日期2013年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月7日
發(fā)明者格日樂其木格, 劉忠華, 何文騰, 朱江 申請人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)