專利名稱：一種神經(jīng)干細(xì)胞儲(chǔ)存管的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種用于神經(jīng)干細(xì)胞儲(chǔ)存的容器。
背景技術(shù)：
神經(jīng)干細(xì)胞(Neural Stem Cell，NSC)是存在于胚胎或成體腦、脊髓等組織中的一種干細(xì)胞，是一類具有分裂潛能和自我更新能力的母細(xì)胞，可通過(guò)不對(duì)等的分裂方式分化成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞等神經(jīng)組織的各類細(xì)胞，也可轉(zhuǎn)分化成血細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞。目前的科學(xué)技術(shù)已經(jīng)可以在體外培養(yǎng)擴(kuò)增神經(jīng)干細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中一般呈懸浮狀態(tài)，不貼壁，并有形成神經(jīng)球(Neurosphere)的特性。體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞可用于生命科學(xué)研究、藥物篩選測(cè)試、臨床應(yīng)用研究等領(lǐng)域。神經(jīng)干細(xì)胞的長(zhǎng)期儲(chǔ)存方式一般是添加凍存保護(hù)劑后裝入凍存管凍存于_196°C 液氮罐中(一般可保存I年以上)，短期儲(chǔ)存方式可將神經(jīng)干細(xì)胞重懸于生理鹽水或細(xì)胞培養(yǎng)液中裝入保存管在4°C冰箱中暫存(一般在12小時(shí)以下)。目前常用的市售細(xì)胞凍存管一般是聚丙烯材質(zhì)，并且管底垂直面與水平面交接處為死角，在將管內(nèi)儲(chǔ)存的神經(jīng)干細(xì)胞取出時(shí)，凍存管的內(nèi)壁殘留的神經(jīng)干細(xì)胞非常多，從而造成儲(chǔ)存回收率低、損耗大，提高了神經(jīng)干細(xì)胞的儲(chǔ)存成本。另外神經(jīng)干細(xì)胞離心、常溫暫存常用的容器一般是聚苯乙烯或聚乙烯材質(zhì)的離心管，也會(huì)因吸附等原因造成一定數(shù)量的細(xì)胞損失。而本發(fā)明提供的內(nèi)壁管底或管底交界處呈圓滑弧形、內(nèi)壁為白蛋白包被層的儲(chǔ)存管，能夠大大減少神經(jīng)干細(xì)胞在內(nèi)壁的殘留，降低儲(chǔ)存過(guò)程中的損耗，并延長(zhǎng)細(xì)胞儲(chǔ)存時(shí)間，提高神經(jīng)干細(xì)胞儲(chǔ)存效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種低殘留率的神經(jīng)干細(xì)胞儲(chǔ)存管。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種神經(jīng)干細(xì)胞儲(chǔ)存管，包括瓶蓋⑴和可立瓶體(2)，瓶蓋⑴外旋或外扣在可立瓶體(2)的瓶口處，所述可立瓶體(2)的內(nèi)壁的垂直面(3)與水平面(4)的連接處呈圓滑的弧形(5)，或者內(nèi)壁整個(gè)底部呈弧形(7)，并且所述可立瓶體(2)的內(nèi)壁表面為白蛋白包被層(6)。上述神經(jīng)干細(xì)胞儲(chǔ)存管在用于保存人類神經(jīng)干細(xì)胞時(shí)，所述的白蛋白包被層優(yōu)選使用人血白蛋白包被。上述神經(jīng)干細(xì)胞儲(chǔ)存管的瓶蓋和可立瓶體的基本材質(zhì)可使用任何具有一定機(jī)械強(qiáng)度、耐低溫并對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害的高分子材質(zhì)，在低溫儲(chǔ)存時(shí)優(yōu)選使用聚丙烯材質(zhì)，常溫儲(chǔ)存時(shí)優(yōu)選使用聚苯乙烯或聚乙烯材質(zhì)。白蛋白(又稱清蛋白，Albumin)屬于球蛋白，是血衆(zhòng)中含量最多的蛋白質(zhì),具有維持血漿膠體滲透壓、血漿物質(zhì)載運(yùn)、保護(hù)血細(xì)胞、提供營(yíng)養(yǎng)、結(jié)合重金屬離子和毒素等功能，在生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中常添加于細(xì)胞培養(yǎng)液中。此外因其能夠與免疫反應(yīng)板上的蛋白結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，也常在免疫實(shí)驗(yàn)中用作封閉液，以阻止后續(xù)操作步驟中的抗原或抗體與反應(yīng)板結(jié)合。人血白蛋白(Human Albumin)是人體產(chǎn)生的白蛋白，可從健康人的血液中提取,能夠直接靜脈注射到病人體內(nèi)，主要用于失血?jiǎng)?chuàng)傷、燒傷弓I起的休克,腦水腫及損傷弓I起的顱壓升高，肝硬化及腎病引起的水腫或腹水，癌癥術(shù)后恢復(fù)等方面的治療，是一種臨床藥品， 國(guó)內(nèi)多家生物醫(yī)藥企業(yè)有生產(chǎn)銷售。本發(fā)明中的白蛋白包被層可以通過(guò)物理吸附或共價(jià)交聯(lián)等多種方式附著在神經(jīng)干細(xì)胞儲(chǔ)存管的內(nèi)壁上。本發(fā)明通過(guò)在儲(chǔ)存管底部引入呈圓滑弧形的表面避免了神經(jīng)干細(xì)胞在死角處的殘留，通過(guò)在內(nèi)壁表面添加一層白蛋白包被層減少了儲(chǔ)存管內(nèi)壁對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的吸附，從而極大降低了神經(jīng)干細(xì)胞在儲(chǔ)存管的殘留率。此外，本發(fā)明用于4°C儲(chǔ)存神經(jīng)干細(xì)胞時(shí)可達(dá)到48小時(shí)而活細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯降低，極大延長(zhǎng)了神經(jīng)干細(xì)胞在4°C的儲(chǔ)存時(shí)間。本發(fā)明的有益效果是，能夠降低神經(jīng)干細(xì)胞在儲(chǔ)存過(guò)程中的損耗，降低儲(chǔ)存成本， 延長(zhǎng)神經(jīng)干細(xì)胞在4°C的儲(chǔ)存時(shí)間，提高神經(jīng)干細(xì)胞儲(chǔ)存效果。


圖I :本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的縱切面。圖2 :普通細(xì)胞凍存管的縱切面。圖3 :本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施例的縱切面。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明可以通過(guò)以下手段制造或?qū)崿F(xiàn)(I)使用模具和高分子聚合物材料如聚丙烯制作成所需形狀；(2)將5%白蛋白溶液加入管內(nèi)，放置于水平搖床上4°C反應(yīng)12個(gè)小時(shí)，形成白蛋白包被層；(3)用超純水洗滌、晾干。實(shí)施例I(I)使用模具和高分子聚合物材料聚丙烯制作成所需形狀(圖I) ; (2)將5%人血白蛋白溶液加入管內(nèi)，放置于水平搖床上4°C反應(yīng)12個(gè)小時(shí)，形成人血白蛋白包被層(圖 I)。從ICR鼠腦組織皮層獲取的神經(jīng)干細(xì)胞(經(jīng)免疫熒光鑒定表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物巢蛋白nestin)進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增后取其中I. 2X 10~7個(gè)，重懸于一定體積的凍存液(含10% DMS0，0. lg/ml BSA)，使細(xì)胞懸液的最終濃度為I. OX 10~6個(gè)細(xì)胞/ml，分裝到6支本發(fā)明制作的神經(jīng)干細(xì)胞儲(chǔ)存管(實(shí)驗(yàn)組)和6支普通細(xì)胞凍存管(對(duì)照組)中，每管lml，放入程序降溫儀，以_1°C /min的速度降溫，然后轉(zhuǎn)入液氮中凍存。I周后將液氮中的凍存細(xì)胞取出，在37°C水浴鍋中溫育復(fù)融，加入5倍體積的 DMEM培養(yǎng)液重懸，離心去上清；重復(fù)該洗滌步驟；然后加入I倍體積的DMEM培養(yǎng)基(購(gòu)自 Invitrogen公司)重懸,經(jīng)自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù),實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的計(jì)數(shù)結(jié)果如下實(shí)驗(yàn)組(單位10~5個(gè)細(xì)胞/ml) :7. 5,7. 8,7. 2,7. 6,8. 1,7. 7 ；對(duì)照組(單位10~5個(gè)細(xì)胞/ml) 5. 5,5. 8,5. 7,6. 1,5. 5,5. 9
統(tǒng)計(jì)分析表明實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異顯著(P < O. 001)，說(shuō)明本發(fā)明能夠改善細(xì)胞凍存復(fù)蘇率。實(shí)施例2(I)使用模具和高分子聚合物材料聚丙烯制作成所需形狀(圖I) ; (2)將5%人血白蛋白溶液加入管內(nèi)，放置于水平搖床上4°C反應(yīng)12個(gè)小時(shí)，形成人血白蛋白包被層(圖 I)。從ICR鼠腦組織皮層獲取的神經(jīng)干細(xì)胞(經(jīng)免疫熒光鑒定表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物巢蛋白nestin)進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增后取其中I. 2X 10~7個(gè)，重懸于生理鹽水中，使細(xì)胞懸液的最終濃度為1.0X10~6個(gè)細(xì)胞/ml，分裝到6支本發(fā)明制作的神經(jīng)干細(xì)胞儲(chǔ)存管(實(shí)驗(yàn)組)和 6支普通細(xì)胞凍存管(對(duì)照組)中，每管lml，放入4°C冰箱。12小時(shí)后將冷藏的細(xì)胞從冰箱中取出，經(jīng)自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的計(jì)數(shù)結(jié)果如下實(shí)驗(yàn)組(單位10~5個(gè)細(xì)胞/ml) 9. 8,9. 5,9. 7,9. 6,9. 9,9. 4 ；對(duì)照組(單位10~5個(gè)細(xì)胞/ml) 8. 3,8. 2,8. 4,7. 9,8. 5,8. 2 統(tǒng)計(jì)分析表明實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異顯著(P < O. 001)，說(shuō)明本發(fā)明能夠改善細(xì)胞冷藏效果。
權(quán)利要求
1.一種神經(jīng)干細(xì)胞儲(chǔ)存管，包括瓶蓋(I)和可立瓶體(2)，瓶蓋(I)外旋或外扣在可立瓶體(2)的瓶口處，其特征在于，所述可立瓶體(2)的內(nèi)壁的垂直面(3)與水平面(4)的連接處呈圓滑的弧形(5)，或者內(nèi)壁整個(gè)底部呈弧形(7)，并且所述可立瓶體(2)的內(nèi)壁表面附有白蛋白包被層￠);其中白蛋白包被層以物理吸附或共價(jià)交聯(lián)的方式附著在可立瓶體的內(nèi)壁上。
2.權(quán)利要求I所述的一種神經(jīng)干細(xì)胞儲(chǔ)存管，其特征在于，所述的白蛋白包被層為人血白蛋白包被層。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種神經(jīng)干細(xì)胞儲(chǔ)存管，涉及細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞儲(chǔ)存管內(nèi)壁底部的形狀進(jìn)行了改進(jìn)，并在內(nèi)壁添加了一層白蛋白包被層，能夠大大減少神經(jīng)干細(xì)胞在內(nèi)壁的殘留，降低儲(chǔ)存過(guò)程中的損耗，延長(zhǎng)神經(jīng)干細(xì)胞在4℃儲(chǔ)存時(shí)間，提高神經(jīng)干細(xì)胞儲(chǔ)存效果。
文檔編號(hào)A01N1/02GK102599145SQ20121003461
公開(kāi)日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月16日
發(fā)明者楊立敏, 鄭佳威, 金宜強(qiáng), 馬曉春 申請(qǐng)人:上海安集協(xié)康生物技術(shù)有限公司