專利名稱：氫氧化細(xì)菌wmq-7及其分離方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及氫氧化細(xì)菌WMQ-7及其分離方法和應(yīng)用，具體涉及一種不含吸氫酶的豆科植物根際土壤中分離培養(yǎng)出的氫氧化細(xì)菌惡臭假單胞菌i^Pseucbmorms putida)mQ-7 及其微生物制劑，該氫氧化細(xì)菌WMQ-7菌株于2011年3月8號保藏于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物中心，保藏編號為CCTCC M 2011060。
背景技術(shù)：
豆科作物的輪作、間作效益多被認(rèn)為是來自豆科作物根部的殘留氮的作用，而新近的研究表明氮肥并不能完全取代豆科作物的輪作效果，大約75%的增產(chǎn)效應(yīng)還不能用已有的理論來解釋。研究發(fā)現(xiàn)，不含吸氫酶(Without Uptake Hydrogenase，HUP —)的根瘤菌在固氮過程中釋放的吐能夠促進(jìn)根際氫氧化細(xì)菌的生長，并進(jìn)一步促進(jìn)植物生長，即“氫肥理論”。即Hup_豆科根瘤在固氮過程中釋放的H2可以通過改變豆科根瘤周圍的特定土壤微生物種群——?dú)溲趸?xì)菌來促進(jìn)植物的生長。最新研究表明，某些氫氧化細(xì)菌通過促進(jìn)植物對礦質(zhì)元素的吸收和利用、產(chǎn)生某種促進(jìn)植物生長的代謝物、抑制有害病原菌等，直接或間接增進(jìn)土壤肥力、增強(qiáng)植物抗病和抗干旱能力調(diào)控作物生長。氫氧化細(xì)菌是能夠利用H2作為能源并同化CO2作為碳源的一類細(xì)菌，在自然界中氫氧化細(xì)菌的營養(yǎng)要求比較簡單，而分離培養(yǎng)氫氧化細(xì)菌的培養(yǎng)基，需要特定的營養(yǎng)和條件，如以銨鹽形式存在的氮元素、鈉或鉀的磷酸鹽、硫酸鎂、鐵鹽和鈣鹽。多年來人們一直致力于如何有效分離、純化出氫氧化細(xì)菌，以便進(jìn)行進(jìn)一步的研究，但由于氫氧化細(xì)菌的生長需要消耗H2,導(dǎo)致菌株的分離工作極其困難，這是因?yàn)镠2混合氣體存在一定的安全隱患(H2 濃度> 5%易于爆炸)。培養(yǎng)設(shè)備、混合氣體濃度、培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分、溫度、PH及鹽濃度等都可能影響氫氧化細(xì)菌的生長。氫氧化細(xì)菌屬于植物根際促生菌(Plant Growth-Promoting Rhizobacteria, PGPR)，對農(nóng)作物的增產(chǎn)具有重要作用，其研究價值已引起廣泛重視。由于技術(shù)限制，至今未得到大面積推廣應(yīng)用。選擇正確的氫氧化細(xì)菌的分離培養(yǎng)方法，構(gòu)建完善的培養(yǎng)體系，是實(shí)現(xiàn)大規(guī)模菌種選育工作的基礎(chǔ)，進(jìn)一步制備出促進(jìn)植物生長的氫氧化細(xì)菌制劑，是當(dāng)前所面臨的主要問題。因此，本發(fā)明的發(fā)明者在研究土壤微生物的同時，采用氣體循環(huán)培養(yǎng)體系，模擬自然土壤環(huán)境，從豆科作物根際土壤中篩選出自然條件下的優(yōu)良?xì)溲趸?xì)菌。分離鑒定了可定植于小麥植物根系內(nèi)外的氫氧化細(xì)菌WMQ-7，并發(fā)現(xiàn)該菌株可替代豆科作物固氮過程中釋放的氫氣的作用，促進(jìn)農(nóng)作物生長，大幅度地減少土壤的退化和水系的污染，改善土壤肥力，促進(jìn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種氫氧化細(xì)菌WMQ-7及含有氫氧化細(xì)菌WMQ-7或由其產(chǎn)生的次級代謝物的環(huán)境親和性氫氧化細(xì)菌制劑。
本發(fā)明的另一目的是提供上述氫氧化細(xì)菌的分離方法。本發(fā)明的氫氧化細(xì)菌為惡臭假單胞菌G^ewi/offloaas putida)·-],已于2011年 3月8號在武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物中心保藏，其保藏登記號為CCTCC M 2011060。在自然條件下，氫氧化細(xì)菌WMQ-7定植于植物根系內(nèi)外，分泌植物生長促進(jìn)物質(zhì)， 并通過對植物病原菌的拮抗作用來抑制多種病原體的生長。本發(fā)明的氫氧化細(xì)菌WMQ-7為在的MSA培養(yǎng)基中培養(yǎng)的革蘭式陰性桿狀細(xì)菌。本發(fā)明的氫氧化細(xì)菌的分離培養(yǎng)方法首先是利用持續(xù)通H2的培養(yǎng)裝置實(shí)現(xiàn)對土壤樣品的富集，然后將其稀釋涂布于MSA培養(yǎng)基平板，篩選能夠以吐為能源并同化(X)2為唯一碳源的菌株，進(jìn)而純化并轉(zhuǎn)接MSA培養(yǎng)基斜面，氣相色譜檢測菌株的吐消耗量，從而進(jìn)一步篩選出吐消耗能力比較強(qiáng)的氫氧化細(xì)菌。而后經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵，制備氫氧化細(xì)菌制劑不同劑型，最后分析氫氧化細(xì)菌制劑不同劑型對冬小麥促生效果。其鑒定特征如下 1、生理生化特征
WMQ-7菌株的生理生化特征顯示在表1中。所述WMQ-7菌株呈短桿狀，大小約0. 52μπι 0. 76μπι X 0. 84 μ m 1. 80 μ m，革
蘭氏染色陰性。在MSA半固體培養(yǎng)基上觀°C培養(yǎng)7 d可形成1.5 mm菌落，呈圓形、邊緣不整齊，白色，表面光滑。
權(quán)利要求
1.一種氫氧化細(xì)菌WMQ-7，其特征在于該細(xì)菌為惡臭假單胞菌O^e^/offloaas putida) WMQ-7，保藏登記號為 CCTCC M 2011060。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氫氧化細(xì)菌WMQ-7，其特征在于氫氧化細(xì)菌WMQ-7的生態(tài)特征如下WMQ-7菌落特征在MSA半固體培養(yǎng)基上觀°C培養(yǎng)7 d可形成1. 5 mm菌落，呈圓形、 邊緣不整齊，白色，表面光滑；WMQ-7個體形態(tài)短桿狀，大小約0. 52 μ m 0. 76 μ m X 0. 84 μ m 1. 80 μ m，一端叢生鞭毛，革蘭氏染色陰性。
3.含有權(quán)利要求1所述的氫氧化細(xì)菌的固體菌劑。
4.權(quán)利要求3所述的氫氧化細(xì)菌固體菌劑的制備方法，其特征在于將新鮮的氫氧化細(xì)菌發(fā)酵液以草炭、泥炭土、米糠、菜園土、鋸木屑或蒙脫土為吸附劑制成固體菌劑。
5.權(quán)利要求1所述的氫氧化細(xì)菌的制備方法，包括以下步驟(1)樣品采集按常規(guī)方法采集生長旺盛且不含吸氫酶的結(jié)瘤豆科植物根際土壤；(2)土壤富集將采集的土壤樣品置于持續(xù)通吐的培養(yǎng)裝置，富集土壤中的氫氧化細(xì)菌；(3)菌種分離與純化土壤稀釋涂布于礦質(zhì)鹽培養(yǎng)基平板，置入密閉容器，室溫倒置培養(yǎng)，待平板長出明顯菌落，挑取單菌落用稀釋涂布法進(jìn)一步純化；(4)菌種篩選氣相色譜儀進(jìn)行檢測并篩選氫氧化細(xì)菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的氫氧化細(xì)菌的制備方法，其特征在于其中步驟(1)所述的不含吸氫酶的豆科植物包括紫花苜蓿、大豆、紫云英和三葉草，根際土壤范圍為距離根瘤5 mm 以內(nèi)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的氫氧化細(xì)菌的制備方法，其特征在于，其中步驟(2)所述采集的根際土壤用16目的篩子過篩后與石英砂以體積比2:1混合，將混合土壤裝入兩端密閉的玻璃管中，H2流速為觀0 mL/min，H2含量為4. 16 X 1(Γ4-2· 42 X 1(T3 mol/L的混合氣體，富集土壤中的氫氧化細(xì)菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的氫氧化細(xì)菌的制備方法，其特征在于，其中步驟(3)所述的礦質(zhì)鹽培養(yǎng)基=NaNO3 2. 0 g, KH2PO4 0. 14 g, K2HPO4 1. 2 g，酵母膏 0. 02 g, MgSO4 0. 5 g, Fe2 (SO4) 3 ·3Η20 0.01 g，KCl 0.5 g，瓊脂 15 g，蒸餾水 1 L，pH 7-7. 2 ；取富集 1 個月的混合土壤與水混勻，以10_3-10_6梯度稀釋涂布MSA培養(yǎng)基平板。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的氫氧化細(xì)菌的制備方法，其特征在于，其中步驟(4)所述的氣相色譜條件為內(nèi)裝5A分子篩的1 mX2 mm的色譜柱，載氣為高純度N2，流速20 mL/min, 進(jìn)樣口溫度150 °C，檢測器溫度160 °C，檢測溫度40 °C。
10.權(quán)利要求1所述的氫氧化細(xì)菌在促進(jìn)植物生長中應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種氫氧化細(xì)菌惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)WMQ-7，已于2011年3月8號在武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物中心保藏，其保藏登記號為CCTCC M 2011060；還涉及從不含吸氫酶的豆科植物根際土壤中分離培養(yǎng)出該氫氧化細(xì)菌的方法，首先是利用持續(xù)通H2的培養(yǎng)裝置、礦質(zhì)鹽培養(yǎng)基實(shí)現(xiàn)對氫細(xì)菌的富集、分離和培養(yǎng)，并通過氣相色譜法篩選具有較強(qiáng)氧化H2的菌株。以最優(yōu)菌株在實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵，制備氫細(xì)菌制劑。該生物制劑用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)可以提高植物生長，提高產(chǎn)量，提高肥效和提高植物的抗逆能力。
文檔編號C05F11/08GK102268391SQ201110191379
公開日2011年12月7日 申請日期2011年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月9日
發(fā)明者付博, 王衛(wèi)衛(wèi), 蒙淵 申請人:西北大學(xué)