專利名稱：產(chǎn)氫細(xì)菌及其篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)氫細(xì)菌新種以及產(chǎn)氫細(xì)菌新種(Ethanologenbacterium hitB49)的篩選方法。
背景技術(shù)：
生物制氫技術(shù)作為可再生的清潔能源生產(chǎn)，在世界上已引起高度重視。微生物產(chǎn)氫機(jī)制分為兩種類型光合法生物制氫和發(fā)酵法生物制氫。提供充分的光能是光合微生物產(chǎn)氫的必要條件，由于光的穿透能力有限，若要提供足夠的光源需要消耗大量的能源，更重要的是光源的維護(hù)與管理十分復(fù)雜，并且所占空間較大，使得實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化氫氣生產(chǎn)難度很大。發(fā)酵微生物產(chǎn)氫有著無需光照，產(chǎn)氫穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，具有更為廣闊的前景。
目前，發(fā)酵法生物制氫技術(shù)在國際上仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，究其原因，是因?yàn)槿藗儗⒅饕ν度氲焦夂袭a(chǎn)氫微生物的研究中。盡管大多數(shù)發(fā)酵產(chǎn)氫菌株的產(chǎn)氫率比光合微生物要高，如陰溝腸桿菌IIT-BT08最大產(chǎn)氫速率為29.63mmol/g·h，但仍需進(jìn)一步提高產(chǎn)氫能力。但尚未分離到較理想的產(chǎn)氫細(xì)菌。沒有合適理想的產(chǎn)氫細(xì)菌分離培養(yǎng)基可能是制約新的菌種被分離的最大頸瓶。在目前對高效產(chǎn)氫細(xì)菌的分離工作，所分離到的高效產(chǎn)氫發(fā)酵菌株大多是梭菌屬和腸桿菌屬，這可能是由于在分離中所應(yīng)用的分離基礎(chǔ)培養(yǎng)基較不理想，更適合這兩個(gè)屬的細(xì)菌生長。陳曉蕾(1998)使用培養(yǎng)基I和Fumiaki Taguchi(1993)使用的PY培養(yǎng)基都分離到了一定量的細(xì)菌種類和數(shù)量，但仍不是十分理想。所以進(jìn)一步研究出新的厭氧發(fā)酵細(xì)菌培養(yǎng)基是十分必要的，是能否分離到高效產(chǎn)氫菌株的前提保證。
產(chǎn)氫細(xì)菌的丁酸型發(fā)酵的應(yīng)用最為普遍，即在pH＞6條件下，發(fā)生以乙酸、丁酸、H2和CO2為主要產(chǎn)物的產(chǎn)氫發(fā)酵。由于發(fā)酵產(chǎn)氫細(xì)菌產(chǎn)氫過程中主要副產(chǎn)物是有機(jī)酸，使得反應(yīng)器內(nèi)pH下降，抑制微生物產(chǎn)氫，因此常需采取一定方法調(diào)節(jié)pH，這即不經(jīng)濟(jì)，又容易因失誤而導(dǎo)致反應(yīng)器生態(tài)系統(tǒng)受到破壞。所以，開展嗜酸或具有較強(qiáng)耐酸能力的產(chǎn)氫細(xì)菌研究是十分必要的。Yokoi曾分離到一株較耐酸的產(chǎn)氫細(xì)菌(產(chǎn)氣腸桿菌HO-39)，能在pH4.0條件下厭氧生長，而嗜酸產(chǎn)氫細(xì)菌的分離至今未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有高產(chǎn)氫能力、強(qiáng)耐酸能力的產(chǎn)氫細(xì)菌(保藏日期2004.5.25，保藏單位名稱中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡稱CGMCC，保藏編號CGMCCNo.1153。)及其篩選方法，該產(chǎn)氫細(xì)菌命名為哈工大產(chǎn)乙醇桿菌B49(Ethanologenbacterium hit B49)，保藏編號為CGMCCNo.1153。產(chǎn)氫細(xì)菌CGMCC1153的篩選方法，它使用常規(guī)的分離、純化和篩選過程，篩選過程中所使用的培養(yǎng)基為葡萄糖20g；胰蛋白胨4g；牛肉膏2g；酵母汁1g；NaCl 4g；K2HPO41.5g；L-半胱氨酸0.5g；FeSO4.7H2O 0.1g；MgCl20.1g；微量元素10ml；維生素10ml；刃天青0.2％w/v pH6～6.4；上述微量元素為MnSO4.7H2O 0.01g；ZnSO4.7H2O 0.05g；H3BO30.01；N(CH2COOH)34.5g；CaCl2.2H2O 0.01g；Na2MoO40.01g；CoCl2.6H2O 0.2g；AlK(SO4)20.01g；定容1000mL；上述維生素為鈷銨素0.01g；抗壞血酸0.025g；核黃素0.025g；檸檬酸0.02g；吡多醛0.05g；葉酸0.01g；對氨基苯甲酸0.01g；肌酸0.025g；定容1000mL。本發(fā)明所述的產(chǎn)氫細(xì)菌新種Ethanologenbacterium hit B49(其樣品已送中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保存，保存號為CGMCC No.1153)，是從連續(xù)流生物制氫反應(yīng)器CSTR中取出一定量產(chǎn)氫發(fā)酵活性污泥，通過自主設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基，采用改進(jìn)的Hungate厭氧技術(shù)分離獲得。是一株既有高效的產(chǎn)氫效率和耐酸特征的細(xì)菌，該株細(xì)菌為實(shí)現(xiàn)生物制氫產(chǎn)業(yè)化提供了寶貴的出發(fā)菌株，對生物制氫技術(shù)實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)具有重大理論意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，有利于實(shí)際工程應(yīng)用，有很大推廣價(jià)值。本發(fā)明產(chǎn)氫細(xì)菌哈工大產(chǎn)乙醇桿菌B49在篩選過程中使用了發(fā)明人自主研制的培養(yǎng)基配方，具有適于產(chǎn)氫細(xì)菌分離、生長和發(fā)酵的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明產(chǎn)氫細(xì)菌CGMCC 1153的生理生化和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果證實(shí)為一新種，它的生物學(xué)特點(diǎn)如下1、菌株的形態(tài)特征產(chǎn)氫細(xì)菌CGMCC1153為單胞生長的規(guī)則桿菌(長1～5.5μm，寬0.3～0.4μm)；周生鞭毛(8～12μm)；革蘭氏陽性菌；無莢膜；無芽孢；乳白色圓形菌落(直徑1～3cm)見圖1。
2、菌株的生理生化特征產(chǎn)氫細(xì)菌CGMCC1153為專性厭氧細(xì)菌，可以在28～43℃，pH3.3～8.5條件下生長；37℃和pH4.8分別為最適生長條件，代時(shí)為7.2h?？梢岳脵幟仕嵘L，牛乳石蕊試驗(yàn)、M.R.、V.P.、明膠試驗(yàn)均為陽性，硝酸鹽試驗(yàn)和H2S試驗(yàn)均呈陰性。產(chǎn)氫細(xì)菌CGMCC1153為專性厭氧桿菌，代謝特征為乙醇發(fā)酵，酵解葡萄糖的主要發(fā)酵產(chǎn)物為乙醇、乙酸、H2、CO2和少量的乳酸，乙醇和乙酸的百分含量占揮發(fā)酸和醇總量的90％以上，乙醇含量不低于揮發(fā)酸和醇總量的45％。最大比產(chǎn)氫速率為32.28mmolH2/g drycell·h，單位體積產(chǎn)氫速率為2382.5mL/L培養(yǎng)液，該菌株屬高效產(chǎn)氫細(xì)菌，具有很好耐酸能力，可在pH3.3～8.5條件下生長。
3、菌株的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果16S rRNA序列GenBank注冊號為AF481148，與其最相近種屬纖維素梭菌(Clostridium Cellulosi)的相似性為94％，為一新種細(xì)菌。
所屬分類學(xué)“屬”為一新屬，命名為產(chǎn)乙醇桿菌屬(Ethanologenbacteriumssp.)，為首次命名的分類學(xué)新屬。其特征是該屬細(xì)菌為專性厭氧生長，革蘭氏陽性菌；桿菌；周生鞭毛；無芽孢；代謝特征為乙醇發(fā)酵；通過16S rRNA基因序列比對分析與其最相近種屬梭菌屬的纖維素梭菌(Clostridium Cellulosi)的相似性為94％。


圖1是本發(fā)明產(chǎn)氫細(xì)菌CGMCC 1153的電子顯微鏡結(jié)構(gòu)形態(tài)示意圖。
保藏日期2004.5.25，保藏單位名稱中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡稱CGMCC，保藏編號CGMCCNo.1153。
具體實(shí)施例方式具體實(shí)施方式
一產(chǎn)氫細(xì)菌，命名為哈工大產(chǎn)乙醇桿菌B49(Ethanologenbacterium hit B49)，保藏編號為CGMCC No.1153。
產(chǎn)氫細(xì)菌CGMCC1153的篩選方法，它使用常規(guī)的分離、純化和篩選過程。
一、分離、純化和篩選從生物制氫反應(yīng)器中取出10ml產(chǎn)氫發(fā)酵活性污泥，放入充滿氮?dú)獾娜瞧恐校尤氩Ａе?，在振蕩器上振?～2h，然后用無菌水進(jìn)行倍比稀釋，再接種于固體培養(yǎng)基中，制成滾管，培養(yǎng)7～14d，用無菌毛細(xì)管挑取單菌落，轉(zhuǎn)接入固體培養(yǎng)基中；重復(fù)以上操作3～10次，直至管內(nèi)菌落和顯微鏡下的細(xì)胞形態(tài)一致；將分離純化的發(fā)酵細(xì)菌轉(zhuǎn)接于液體培養(yǎng)基中，35℃、120r/min振蕩培養(yǎng)5～8d，用1mL無菌注射器從其氣相中取樣，檢測其氣相成分中是否有氫氣存在，如果有，即為產(chǎn)氫菌；上述過程所使用的培養(yǎng)基為葡萄糖20g；胰蛋白胨4g；牛肉膏2g；酵母汁1g；NaCl 4g；K2HPO41.5g；L-半胱氨酸0.5g；FeSO4.7H2O 0.1g；MgCl20.1g；微量元素10ml；維生素10ml；刃天青0.2％w/v；pH 6～6.4；所述微量元素為MnSO4.7H2O 0.01g；ZnSO4.7H2O 0.05g；H3BO30.01；N(CH2COOH)34.5g；CaCl2.2H2O 0.01g；Na2MoO40.0lg；CoCl2.6H2O 0.2g；AlK(SO4)20.01g；定容1000mL；所述維生素為鈷銨素0.01g；抗壞血酸0.025g；核黃素0.025g；檸檬酸0.02g；吡多醛0.05g；葉酸0.01g；對氨基苯甲酸0.01g；肌酸0.025g；定容1000mL。
在上述液體培養(yǎng)基中加入1％(W/V)瓊脂即成為固體培養(yǎng)基。
二、高效產(chǎn)氫菌株優(yōu)選將篩選出的產(chǎn)氫菌株，重復(fù)分離、純化操作，待其產(chǎn)氣穩(wěn)定后，測其產(chǎn)氫能力，并將產(chǎn)氫能力高的菌株，重復(fù)分離操作，用無菌毛細(xì)管挑取在固體培養(yǎng)基中產(chǎn)生氣泡較大的細(xì)菌菌落進(jìn)行純化，反復(fù)上述步驟，直至滾管中細(xì)菌穩(wěn)定產(chǎn)生大而多的氣泡為止。富集后，再測其產(chǎn)氫能力。反復(fù)多次，直至優(yōu)選出產(chǎn)氫能力最高的菌株為止。
三、細(xì)菌的生理生化分析細(xì)菌的生長用紫外分光光度計(jì)，在600nm處測定樣品的吸光度值，作為菌濁。不同菌濁的細(xì)菌干重測定是將樣品在5000r/min下離心，棄上清液，用無菌純水洗細(xì)菌沉淀2次，80℃干燥12h，用精密電子天平稱其重量。形態(tài)學(xué)鑒定和碳源利用指標(biāo)測定參照文獻(xiàn)方法(東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊.北京科學(xué)出版社，2001.)四、菌株分類鑒定提取細(xì)菌基因組DNA后進(jìn)行16S rDNA序列擴(kuò)增，用于擴(kuò)增的PCR反應(yīng)引物為通用引物正向引物BSF8/205′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物BSR1541/15225′-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3′，分別對應(yīng)于大腸埃希氏菌(E.coli)16SrRNA的8～27和16S rRNA的1522～1541堿基。PCR反應(yīng)體系(50μL)如下10×buffer(mg2+)5μL、2.5mmol/L dNTP 5μL、20pmol/L引物各1μL、ExTaq DNA酶0.25μL。PCR擴(kuò)增條件95℃ 5min；94℃ 1min；60℃ 30S；72℃ 1min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 8min。用pMD18-T載體克隆，進(jìn)行序列測定。
五、產(chǎn)氫細(xì)菌哈工大產(chǎn)乙醇桿菌B49發(fā)酵產(chǎn)氫工藝發(fā)酵產(chǎn)物的分析揮發(fā)酸和醇類測定，使用GC122型氣相色譜儀，取1mL培養(yǎng)液，離心5000r/min，取上清液進(jìn)樣，柱長2m，擔(dān)體GDX103，60～80目，氫火焰檢測器，氮?dú)庾鬏d氣，流速60mL/min，氫氣流速為50mL/min，空氣流速為490mL/min，汽化室210℃，柱和檢測室190℃。氫氣和二氧化碳測定，使用SC-II型氣相色譜儀，柱長2m，擔(dān)體為TDS-01，60～80目，熱導(dǎo)池檢測器，氮?dú)庾鬏d氣，流速為70mL/min，柱和檢測室150℃。通過靜態(tài)試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵工藝。確定影響發(fā)酵工藝的最適底物、最佳生長和產(chǎn)氫溫度、PH值、氧化還原電位(ORP)、金屬離子等參數(shù)。
利用產(chǎn)氫細(xì)菌哈工大產(chǎn)乙醇桿菌B49進(jìn)行產(chǎn)氫的方法，它使用常規(guī)的產(chǎn)氫方法，以糖蜜和葡萄糖為底物，發(fā)酵產(chǎn)氫溫度為35℃，生長pH為4.5，產(chǎn)氫pH為4.0。
附件序列表產(chǎn)氫細(xì)菌新種哈工大產(chǎn)乙醇桿菌B49(Ethanologenbacterium hit B49)的16SrRNA序列(GenBank注冊號為AF481148)<110>哈爾濱工業(yè)大學(xué)<120>產(chǎn)氫細(xì)菌及其篩選方法<160>1<210>1<211>1465<212>RNA<213>產(chǎn)乙醇桿菌屬(Ethanologenbacterium ssp.)<400>1aaggaattga cgggggcccg cacaagcagt ggagtatgtg gtttaattcg aagcaacgcg 900aagaacctta ccaggtcttg acatccaccg aatcccccag agatggggga gtgcccttcg 960gggagcggtg agacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt 1020aagtccctca acgagcgcaa cccttgtgaa tagttgctac gaaagagcac tctattcaga 1080ccgccgttga caaaacggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac 1140ctgggctaca cacgtactac aatggccatc aacagaggga agcaaggccg cgaggtggag 1200cgaaccccta aaaatggtct cagttcagat tgcaggctga aacccgcctg catgaagatg 1260gaattgctag taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac 1320accgcccgtc acaccatgag agccggggac acccgaagtc ggttgggtaa ccgtaaggag 1380cccgccgccg aaggtggaat cggtaattgg ggtgaagtcg taacaaggta gccgtatcgg 1440aaggtgcggc tggatcacct cctta146權(quán)利要求
1.一株產(chǎn)氫細(xì)菌，命名為哈工大產(chǎn)乙醇桿菌B49(Ethanologenbacterium hitB49)，保藏編號為CGMCC No.1153。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)氫細(xì)菌，其特征在于所述產(chǎn)氫細(xì)菌哈工大產(chǎn)乙醇桿菌B49GenBank注冊號為AF481148，它的16S rRNA序列如下aaggaattga cgggggcccg cacaagcagt ggagtatgtg gtttaattcg aagcaacgcg900aagaacctta ccaggtcttg acatccaccg aatcccccag agatggggga gtgcccttcg960gggagcggtg agacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt 1020aagtccctca acgagcgcaa cccttgtgaa tagttgctac gaaagagcac tctattcaga 1080ccgccgttga caaaacggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac 1140ctgggctaca cacgtactac aatggccatc aacagaggga agcaaggccg cgaggtggag 1200cgaaccccta aaaatggtct cagttcagat tgcaggctga aacccgcctg catgaagatg 1260gaattgctag taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac 1320accgcccgtc acaccatgag agccggggac acccgaagtc ggttgggtaa ccgtaaggag 1380cccgccgccg aaggtggaat cggtaattgg ggtgaagtcg taacaaggta gccgtatcgg 1440aaggtgcggc tggatcacct cctta 1465。
3.一種產(chǎn)氫細(xì)菌的篩選方法，它使用常規(guī)的分離、純化和篩選過程，其特征在于篩選過程中所使用的培養(yǎng)基為葡萄糖20g；胰蛋白胨4g；牛肉膏2g；酵母汁1g；NaCl 4g；K2HPO41.5g；L-半胱氨酸0.5g；FeSO4.7H2O 0.1g；MgCl20.1g；微量元素10ml；維生素10ml；刃天青0.2％w/v；pH6～6.4；上述微量元素為MnSO4.7H2O 0.01g；ZnSO4.7H2O 0.05g；H3BO30.01；N(CH2COOH)34.5g；CaCl2.2H2O 0.01g；Na2MoO40.01g；CoCl2.6H2O 0.2g；AlK(SO4)20.01g；定容1000mL；上述維生素為鈷銨素0.01g；抗壞血酸0.025g；核黃素0.025g；檸檬酸0.02g；吡多醛0.05g；葉酸0.01g；對氨基苯甲酸0.01g；肌酸0.025g；定容1000mL。
全文摘要
產(chǎn)氫細(xì)菌及其篩選方法，涉及一種產(chǎn)氫細(xì)菌新種、產(chǎn)氫細(xì)菌新種的篩選方法。盡管大多數(shù)發(fā)酵產(chǎn)氫菌株的產(chǎn)氫率比光合微生物要高，但仍需進(jìn)一步提高產(chǎn)氫能力。產(chǎn)氫細(xì)菌，命名為哈工大產(chǎn)乙醇桿菌B49(Ethanologenbacterium hit B49)，保藏編號為CGMCC No.1153。產(chǎn)氫細(xì)菌的篩選方法，它在篩選過程中所使用的培養(yǎng)基為新型培養(yǎng)基。本發(fā)明的菌株是一株既有高效的產(chǎn)氫效率和耐酸特征的細(xì)菌，該株細(xì)菌為實(shí)現(xiàn)生物制氫產(chǎn)業(yè)化提供了寶貴的出發(fā)菌株，對生物制氫技術(shù)實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)具有重大理論意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，有利于實(shí)際工程應(yīng)用。本發(fā)明具有適于產(chǎn)氫細(xì)菌分離、生長和發(fā)酵的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12N1/20GK1644679SQ20041004383
公開日2005年7月27日 申請日期2004年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月27日
發(fā)明者任南琪, 林明, 邢德峰, 李建政, 李永峰, 丁杰, 王相晶, 秦智, 李秋波 申請人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)