專利名稱：自絮凝產(chǎn)氫細菌及其篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株發(fā)酵產(chǎn)氫細菌及其篩選方法，具體涉及一株自絮凝發(fā)酵產(chǎn)氫細菌新種哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌YUAN-3(Ethanologenbacterium Harbin YUAN-3)及其篩選方法。
背景技術(shù)：
生物制氫技術(shù)是解決能源危機和環(huán)境污染問題的重要手段之一，由于其具有雙重功效和可持續(xù)性特點，日益受到世界各國的重視。提高產(chǎn)氫效率是生物制氫技術(shù)工業(yè)化亟待解決的難題。篩選出高效產(chǎn)氫細菌是加快實現(xiàn)生物制氫工業(yè)化的有效途徑。為了獲得高效產(chǎn)氫發(fā)酵細菌，國外研究者分離了大量的產(chǎn)氫發(fā)酵細菌，分離的產(chǎn)氫發(fā)酵菌株多數(shù)集中在梭菌屬和腸桿菌屬。Kumar等從樹葉榨出物中分離到陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)IIT-BT08，該菌株在36℃，培養(yǎng)液pH值6.0條件下，最大產(chǎn)氫速率為29.63mmol H2/g dry cell·h，是目前報道的產(chǎn)氫能力最高的細菌。產(chǎn)氫細菌的連續(xù)流發(fā)酵工藝是發(fā)酵法生物制氫技術(shù)實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。如Rachman等(1998)利用自絮凝細菌采用填充床式反應(yīng)器(PBR)對產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)HU-101和AY-2進行了18d連續(xù)培養(yǎng)。Kumar等(2000)以椰子殼纖維固定陰溝腸桿菌(Enterobacter clocae)IIT-BT08進行了連續(xù)流培養(yǎng)。目前主要是采用固定化技術(shù)，不僅增加了運行成本，而且不易保持生物量。因此分離自絮凝細菌采取非固定化的產(chǎn)氫細菌更具有實際意義。由于制氫反應(yīng)器的生長條件與靜態(tài)培養(yǎng)不同，尤其是產(chǎn)酸發(fā)酵過程中反應(yīng)系統(tǒng)的pH均較低，因此目前所分離的高效發(fā)酵細菌雖然具有較高的產(chǎn)氫能力，但是在反應(yīng)器內(nèi)往往不能達到其最佳產(chǎn)氫和生長條件，高效產(chǎn)氫細菌不能成為微生物群落中的優(yōu)勢種群，只能采取固定化方式，限制了其產(chǎn)氫效能，增加了運行成本。為了進一步提高系統(tǒng)的產(chǎn)氫能力，需要分離既高效產(chǎn)氫和強耐酸性，又能成為優(yōu)勢生長的自絮凝細菌，更具有現(xiàn)實意義和工程應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有自絮凝能力、高產(chǎn)氫能力和強耐酸能力的自絮凝產(chǎn)氫細菌及其篩選方法，它有利于實際工程應(yīng)用， 具有很大的推廣價值。本發(fā)明的自絮凝產(chǎn)氫細菌哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌YUAN-3已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址中國，北京，中關(guān)村，郵政編碼100080)保藏，命名為哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌YUAN-3(Ethanologenbacterium HarbinYUAN-3)，保藏編號為CGMCC No.1152，保藏日期為2004年5月25日。本發(fā)明的哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌YUAN-3是從連續(xù)流生物制氫反應(yīng)器CSTR中取出一定量產(chǎn)氫發(fā)酵活性污泥，通過自主設(shè)計的培養(yǎng)基，采用改進的Hungate厭氧技術(shù)分離獲得的，它是一株既有高效的產(chǎn)氫效率強絮凝能力又有耐酸特征的細菌。本發(fā)明的哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌YUAN-3的篩選方法如下(一)采用細菌分離培養(yǎng)基對菌株進行產(chǎn)氫細菌的分離、純化和篩選；(二)將篩選出的自絮凝產(chǎn)氫菌株重復(fù)分離、純化，進行自絮凝高效產(chǎn)氫菌株的優(yōu)選。本發(fā)明所得的菌株為細菌新種，所屬分類學(xué)“屬”為一新屬，命名為產(chǎn)乙醇桿菌屬(Ethanologenbacteriumssp.)，為首次命名的分類學(xué)新屬。哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌YUAN-3(Ethanologenbacterium Harbin YUAN-3)具有如下生物學(xué)特征一、形態(tài)特征細菌為革蘭氏陽性桿菌，有莢膜，無內(nèi)生芽孢，專性厭養(yǎng)生長，細菌長短多變(寬0.4μm～0.5μm×長2μm～8μm)。透射電鏡觀測，發(fā)現(xiàn)菌體周生鞭毛，掃描電鏡觀測菌體有表面呈現(xiàn)凹凸不平。在固體培養(yǎng)基上生長時，為乳白色圓形菌落，表面光滑，邊緣整齊。該菌株在液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)時具有很強的自絮凝效果，可形成大的絮體顆粒。
二、生理生化特征菌株YUAN-3的生長以O(shè)D600的吸光度值表示，通過細菌對數(shù)時期單位內(nèi)數(shù)量的增長計算生長代時為4.0h?？梢岳脵幟仕嵘L，牛乳石蕊試驗、M.R.、V.P.、明膠試驗均為陽性，硝酸鹽試驗和H2S試驗均呈陰性。以糖蜜和葡萄糖為底物，最適發(fā)酵產(chǎn)氫和自絮凝溫度為36℃，最適生長pH為4.5，最適產(chǎn)氫pH為4.0。菌株YUAN-3在以葡萄糖為碳源時主要發(fā)酵產(chǎn)物為乙醇、乙酸、H2、CO2和少量的乳酸，乙醇和乙酸的百分含量占揮發(fā)酸和醇總量的90％以上，乙醇含量不低于揮發(fā)酸和醇總量的45％。菌株YUAN-3的最大比產(chǎn)氫速率為22.6mmolH2/g drycell·h，最大累積產(chǎn)氫量為1568mL/L培養(yǎng)液。
三菌株的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果菌株YUAN-3的16S rRNA基因序列在GenBank的注冊號為AY675965，與其最相近種屬纖維素梭菌(ClostridiumCellulosi)的相似性為94％，為一新屬細菌。16S-23S rRNA間隔區(qū)序列注冊號為AY556390，序列比對結(jié)果顯示保守區(qū)域僅為tRNAAla和tRNAIle序列，變異區(qū)域與其它種屬細菌16S-23S rRNA間隔區(qū)序列沒有同源性區(qū)域。
四工程應(yīng)用特性本發(fā)明的自絮凝產(chǎn)氫細菌菌株YUAN-3可以利用大豆、玉米、土豆及糖蜜廢水和啤酒廢水等碳水化合物產(chǎn)氫。由于其具有自絮凝特性，因此不用添加填料或者載體，投加到連續(xù)流攪拌槽式反應(yīng)器和生物膨脹床反應(yīng)器后能夠連續(xù)流產(chǎn)氫。容積負荷60～70kgCOD/(m3·d)時，產(chǎn)氫數(shù)率平均為6～10L/(L反應(yīng)器·d)。按照本發(fā)明的方法篩選出的細菌不僅具有較高的產(chǎn)氫能力，在反應(yīng)器內(nèi)能形成良好的絮體顆粒，保持很大的生物量，達到其最佳產(chǎn)氫和生長條件，使其成為微生物群落中的優(yōu)勢種群。由于具有較強的自絮凝能力，因此發(fā)酵時不需要載體，降低了運行成本，具有現(xiàn)實意義和工程應(yīng)用價值。


圖1為本發(fā)明的自絮凝產(chǎn)氫細菌哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌YUAN-3自絮凝效果圖，圖2為自絮凝產(chǎn)氫細菌哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌YUAN-3的掃描電鏡圖，圖3是自絮凝產(chǎn)氫細菌哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌YUAN-3的透射電鏡圖。
具體實施例方式具體實施方式
一本實施方式的哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌YUAN-3(Ethanologenbacterium Harbin YUAN-3)按照下述步驟進行選育一、菌株的分離、純化和篩選采用改良的細菌分離培養(yǎng)基進行產(chǎn)氫細菌的分離，其具體步驟如下a、從連續(xù)流生物制氫反應(yīng)器CSTR中取出1～2mL產(chǎn)氫發(fā)酵活性污泥，放入充滿氮氣的三角瓶中，加入數(shù)顆玻璃珠，在搖床上振蕩1h，將污泥中菌膠團打碎，用無菌水稀釋至10-1～10-11ml；b、將0.2～0.5ml菌株接種于10ml固體培養(yǎng)基中，制成滾管，培養(yǎng)7～10d；c、挑取單菌落轉(zhuǎn)接入液體培養(yǎng)基中，觀測是否有絮體顆粒產(chǎn)生，有絮體形成的即為自絮凝細菌；d、重復(fù)以上操作3～10次，直至絮凝狀態(tài)良好，即絮凝顆粒直徑為0.5～1.5cm，培養(yǎng)基完全澄清，絮體在打碎后仍能重新絮凝，用電鏡確認是否為純菌株；e、將分離純化的絮凝發(fā)酵細菌轉(zhuǎn)接于液體培養(yǎng)基中，在36℃、120r/min的條件下振蕩培養(yǎng)3d，用1mL無菌注射器從其氣相中取樣，檢測其氣相成分中是否有氫氣存在，如果有即為自絮凝產(chǎn)氫細菌。所述培養(yǎng)基(固體培養(yǎng)基)由下述成分組成葡萄糖10～30g、胰蛋白胨2～6g、牛肉膏1～4g、酵母汁0.1～1.5g、NaCl 2～6g、K2HPO40.5～3g、L-半胱氨酸0.1～1g、FeSO4.7H2O 0.1～0.5g、MgCl20.1～0.5g、微量元素5～20ml、維生素5～15ml、刃天青0.01～0.1％(w/v)。所述液體培養(yǎng)基由下述成分組成葡萄糖10～30g、胰蛋白胨2～6g、牛肉膏1～4g、酵母汁0.1～1.5g、NaCl 2～6g、K2HPO40.5～3g、L-半胱氨酸0.1～1g、FeSO4.7H2O 0.1～0.5g、MgCl20.1～0.5g、微量元素5～20ml、維生素5～15ml、刃天青0.01～0.1％(w/v)、瓊脂1～2％(w/v)。所述培養(yǎng)基(固體培養(yǎng)基)優(yōu)選由下述成分組成葡萄糖20g、胰蛋白胨4g、牛肉膏2g、酵母汁1g、NaCl 4g、K2HPO41.5g、L-半胱氨酸0.5g、FeSO4.7H2O 0.1g、MgCl20.1g、微量元素10ml、維生素10ml、刃天青0.02％(w/v)。所述液體培養(yǎng)基優(yōu)選由下述成分組成葡萄糖20g、胰蛋白胨4g、牛肉膏2g、酵母汁1g、NaCl 4g、K2HPO41.5g、L-半胱氨酸0.5g、FeSO4.7H2O 0.1g、MgCl20.1g、微量元素10ml、維生素10ml、刃天青0.02％(w/v)、瓊脂1～2％(w/v)。所述微量元素由下述成分組成MnSO4.7H2O0.01～0.05g、ZnSO4.7H2O 0.05～0.1g、H3BO30.01～0.05、N(CH2COOH)34～5g、CaCl2.2H2O 0.01～0.05g、Na2MoO40.01～0.05g、CoCl2.6H2O 0.1～0.5g、AlK(SO4)20.01～0.05g，定容1000mL；所述維生素由下述成分組成鈷銨素0.01～0.05g、抗壞血酸0.01～0.05g、核黃素0.01～0.05g、檸檬酸0.01～0.05g、吡多醛0.03～0.1g、葉酸0.01～0.05g、對氨基苯甲酸0.01～0.05g、肌酸0.01～0.05g，定容1000mL。所述微量元素優(yōu)選由下述成分組成MnSO4.7H2O 0.01g、ZnSO4.7H2O 0.05g、H3BO30.01、N(CH2COOH)34.5g、CaCl2.2H2O 0.01g、Na2MoO40.01g、CoCl2.6H2O 0.2g、AlK(SO4)20.01g，定容1000mL；所述維生素優(yōu)選由下述成分組成鈷銨素0.01g、抗壞血酸0.025g、核黃素0.025g、檸檬酸0.02g、吡多醛0.05g、葉酸0.01g、對氨基苯甲酸0.01g、肌酸0.025g，定容1000mL。
二、自絮凝高效產(chǎn)氫菌株的優(yōu)選將篩選出的自絮凝產(chǎn)氫菌株，重復(fù)分離、純化操作，待其產(chǎn)氣穩(wěn)定后，測其產(chǎn)氫能力，并將產(chǎn)氫能力高的菌株，重復(fù)分離操作，取在固體培養(yǎng)基中產(chǎn)生氣泡較大的細菌菌落進行純化，反復(fù)上述步驟，直至滾管中細菌穩(wěn)定產(chǎn)生大而多的氣泡為止；富集后，再測其產(chǎn)氫能力，反復(fù)多次，直至優(yōu)選出強自絮凝和產(chǎn)氫能力最高的菌株為止。
三、細菌的生理生化分析細菌的生長用紫外分光光度計，在600nm處測定樣品的吸光度值，作為菌濁。不同菌濁的細菌干重測定是將樣品在5000r/min下離心，棄上清液，用無菌純水洗細菌沉淀2次，80℃干燥12h，用精密電子天平稱其重量。形態(tài)學(xué)鑒定參照文獻方法(東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊.北京科學(xué)出版社，2001.)。
四、菌株分類鑒定提取細菌基因組DNA，用于16S rDNA擴增的PCR反應(yīng)引物為通用引物正向引物BSF8/205′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物BSR1541/15225′-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3′，分別對應(yīng)于大腸埃希氏菌(E.coli)16S rRNA的8～27和16S rRNA的1522～1541堿基。16S-23S rRNAITS的擴增引物為PSA1486/15055′-GGGGTGAAGTCGTAACAAGG-3′；PLA209/1895′-GGTACTTAGATGT TTCAGTTC-3′，分別對應(yīng)于E.coli16S rRNA的1486～1505和23S rRNA的189～209堿基。所述PCR反應(yīng)體系(50μL)如下10×buffer(mg2+)5μL、2.5mmol/L dNTP 5μL、20pmol/L引物各1μL、ExTaq DNA酶0.25μL。所述PCR擴增條件如下95℃ 5min；94℃ 1min；60℃ 30S；72℃ 1min，30個循環(huán)；72℃ 8min，用pMD18-T載體克隆，進行序列測定。
五、產(chǎn)氫細菌發(fā)酵產(chǎn)物和最佳發(fā)酵產(chǎn)氫條件分析發(fā)酵產(chǎn)物的分析揮發(fā)酸和醇類測定，使用GC122型氣相色譜儀，取1mL培養(yǎng)液，離心5000r/min，取上清液進樣，柱長2m，擔體GDX103，60～80目，氫火焰檢測器，氮氣作載氣，流速60mL/min，氫氣流速為50mL/min，空氣流速為490mL/min，汽化室210℃，柱和檢測室190℃。氫氣和二氧化碳測定，使用SC-II型氣相色譜儀，柱長2m，擔體為TDS-01，60～80目，熱導(dǎo)池檢測器，氮氣作載氣，流速為70mL/min，柱和檢測室150℃。通過靜態(tài)試驗優(yōu)化發(fā)酵工藝，確定影響發(fā)酵工藝的最適底物、最佳生長和產(chǎn)氫溫度、pH值。本實施方式篩選出的菌株YUAN-3具有如下特征一、形態(tài)特征細菌為革蘭氏陽性桿菌，有莢膜，無內(nèi)生芽孢，專性厭養(yǎng)生長，細菌長短多變(寬0.4μm～0.5μm×長2μm～8μm)。透射電鏡觀測，發(fā)現(xiàn)菌體周生鞭毛，掃描電鏡觀測菌體有表面呈現(xiàn)凹凸不平。在固體培養(yǎng)基上生長時，為乳白色圓形菌落，表面光滑，邊緣整齊。該菌株在液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)時具有很強的自絮凝效果，可形成大的絮體顆粒，直徑0.5～1.5cm，培養(yǎng)基完全澄清，絮體顆粒在打碎后仍然能夠重新絮凝(見圖1～圖3)。
二、生理生化特征菌株YUAN-3的生長以O(shè)D600的吸光度值表示，通過細菌對數(shù)時期單位內(nèi)數(shù)量的增長計算生長代時為4.0h。可以利用檸檬酸生長，牛乳石蕊試驗、M.R.、V.P.、明膠試驗均為陽性，硝酸鹽試驗和H2S試驗均呈陰性。以糖蜜和葡萄糖為底物，最適發(fā)酵產(chǎn)氫和自絮凝溫度為36℃，最適生長pH為4.5，最適產(chǎn)氫pH為4.0。菌株YUAN-3在以葡萄糖為碳源時主要發(fā)酵產(chǎn)物為乙醇、乙酸、H2、CO2和少量的乳酸，乙醇和乙酸的百分含量占揮發(fā)酸和醇總量的90％以上，乙醇含量不低于揮發(fā)酸和醇總量的45％。該菌株的發(fā)酵氣體主要為氫氣和二氧化碳，氫氣百分含量45％～55％，最大比產(chǎn)氫速率為22.6mmolH2/g drycell·h，最大累積產(chǎn)氫量為1568mL/L培養(yǎng)液。
三、菌株的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果菌株YUAN-3的16S rRNA基因序列在GenBank的注冊號為AY675965，與其最相近種屬纖維素梭菌(ClostridiumCellulosi)的相似性為94％，為一新屬細菌。16S-23S rRNA間隔區(qū)序列注冊號為AY556390，序列比對結(jié)果顯示保守區(qū)域僅為tRNAAAla和tRNAIle序列，變異區(qū)域與其它種屬細菌16S-23S rRNA間隔區(qū)序列沒有同源性區(qū)域。
序列表一、自絮凝產(chǎn)氫細菌哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌YUAN-3(Ethanologenbacterium HarbinYUAN-3)的16S rRNA序列(GenBank注冊號為AY675965)AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGCGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGAGTCCTTCGGGACTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGAGCAACCTGGCCTTCAGAGGGGGATAACGTCTGGAAACGGACGCTAATACCGCATGACATGGCGGAGTCGCATGGCTCTGCCATCAAAGGAGTAATCCGCTGAGGGATGGGCTCGCGTCCGATTAGGTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGCCCGCGATCGGTAGCCGGACTGAGAGGTTGGCCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGGATATTGCACAATGGAGGAAACTCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAACCTCTGTCTTTGGGGACGAATCAATGACGGTACCCAAGGAGGAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGTGTAAAGGGTGCGCAGGCGGGGCGGCAAGTTGGATGTGAAAACTCCGGGCTCAACCCGGAGCCTGCATTCAAAACTGTCGCTCTTGAGTGAAGTAGAGGCAGGCGGAATTCCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCGGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCCTGCTGGGCTTTTACTGACGCTGAGGCACGAAAGCATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGATTGCTAGGTGTGGGGGGTCTGACCCCTTCCGTGCCGGAGTTAACACAATAAGCAATCCACCTGGGGAGTACGGGTCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCTCGCACAAGCAGTGGAGTATGTGGTTTGATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCACCGAATCCCCCAGAGATTGGGGAGTGCCCTTCGGGGAGCGGTGAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTGAATAGTTGCTACGAAAGAGCACTCTATTCAGACCGCCGTTGACAAAACGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTACTACAATGGCCATCAACAGAGGGAAGCAAGGCCGCGAGGTGGAGCGAACCCCTAAAAATGGTCTCAGCTCAGATTGCAGGCTGAAACCCGCCTGCATGAAGATGGAATTGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGCCGGGGACACCCGAAGTCGGTTGGGTAACCGTAAGGAGCCCGCCGCCGAAGGTGGAATCGGTAATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTA二、自絮凝產(chǎn)氫細菌哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌YUAN-3(Ethanologenbacterium HarbinYUAN-3)的16S-23S rRNA間隔區(qū)序列(GenBank注冊號為AY556390)GGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTTTCTAAGGAGACTCGTTTCTTTAGAAACAGTGTCAGCGCAGGGATTTGTGGAAAGATGTTGTTTAATTTTGAGGGTCCGGGCGGACGCGGTTCGCTTTTAAGCCGCCGGCCATGCAGATCGGATTGGGAGCGAACAGCCCCGATGCAGGAAGCATGACGGCAGTTTGAAGACGGGCGGCGTCCCAAAGAACCTTCAAACGGTGGAAAAGAGAATAGGACGACCGATTCCCAGGCAAAGCGTGGGGTATAGCTTTCAGGCTGAGCAGTCCGAGAACAGGAGATTTTCCTGAACTTGCGCCGCGCAGCGGTGAACTTGCCGCTACGGTGAGTAGGGGGCGTAGCTCAGCTGGGAGAGCACCTGCTTTGCACGCAGGGGGTCAGGAGTTCGATTCTCCTCATCTCCACCACGCCTGCGGCGGATATGACGCGCCAAGGCAGCCGAAAACGAAAATGCAAAGCCGCGAGGCCAAGCGTCGACGTTGAGGAAGCCAAAGCATGCATGCCGGTTGCAGGCAAACCAAATGGCCCGGGCGGGAACGGACGACCGAGATGCTCGGATTGCATGGGCTCATAGCTCAGGTGGTTAGAGCGTGCGCCTGATAAGCGCAAGGTCGGTGGTTCGAGTCCACTTGAGCCCACCAGCGGGCAGTGCCCGCACACAATTCGCGGGAAGTTTGTTCAAAGCAGAGGTCGGCCGCCGCGAAAGCGAGACGGATCGAAGCAAGAACAGATGGATCGCAAAACCGCTTGCAAAAGAGGTAAGATTTCAGGCTGAGCAGCCGCGTAAGCAACGACTTTCCTGAACTTGCCTCCGCCGCAGGCGGGGGGACCTTGAAAACTGAATAATGTTCTAATCTGCAATTTTTTTAATGAACGAAGCGAGTAGCGGCGGAAGTTTCAGGTTGAGCAGCTGTGTAAGCAGTGGGCTTGCTTGAACATACGTCTTGCGAAGCAAGTTCGTTGGGTAAAATTCCGATTGACACATAAGGTCAAGCTACAAAGAGCGCAAGGGGAATGCCTTGGCACCAGGAGCCGATGAAGGACGCAGCGATCTGCGAAAAGCCACGGGGAGTCGAAAGCAGGCATTGATCCGTGGATATCCGAATGGGGCAACCCGGCGGAGCCATACTCCGTCAGCGTGCAGTGAATCCATAGCTGCACGTGGGGAACCGCCTGAACTGAAACATCTAAGTACC
權(quán)利要求
1.自絮凝產(chǎn)氫細菌，命名為哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌(EthanologenbacteriumHarbin YUAN-3)，保藏編號為CGMCC No.1152。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的自絮凝產(chǎn)氫細菌，其特征在于所述哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌YUAN-3的16S rRNA序列的GenBank注冊號為AY675965，16S rRNA序列為AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGCGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGAGTCCTTCGGGACTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGAGCAACCTGGCCTTCAGAGGGGGATAACGTCTGGAAACGGACGCTAATACCGCATGACATGGCGGAGTCGCATGGCTCTGCCATCAAAGGAGTAATCCGCTGAGGGATGGGCTCGCGTCCGATTAGGTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGCCCGCGATCGGTAGCCGGACTGAGAGGTTGGCCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGGATATTGCACAATGGAGGAAACTCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAACCTCTGTCTTTGGGGACGAATCAATGACGGTACCCAAGGAGGAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGTGTAAAGGGTGCGCAGGCGGGGCGGCAAGTTGGATGTGAAAACTCCGGGCTCAACCCGGAGCCTGCATTCAAAACTGTCGCTCTTGAGTGAAGTAGAGGCAGGCGGAATTCCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCGGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCCTGCTGGGCTTTTACTGACGCTGAGGCACGAAAGCATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGATTGCTAGGTGTGGGGGGTCTGACCCCTTCCGTGCCGGAGTTAACACAATAAGCAATCCACCTGGGGAGTACGGGTCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCTCGCACAAGCAGTGGAGTATGTGGTTTGATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCACCGAATCCCCCAGAGATTGGGGAGTGCCCTTCGGGGAGCGGTGAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTGAATAGTTGCTACGAAAGAGCACTCTATTCAGACCGCCGTTGACAAAACGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTACTACAATGGCCATCAACAGAGGGAAGCAAGGCCGCGAGGTGGAGCGAACCCCTAAAAATGGTCTCAGCTCAGATTGCAGGCTGAAACCCGCCTGCATGAAGATGGAATTGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGCCGGGGACACCCGAAGTCGGTTGGGTAACCGTAAGGAGCCCGCCGCCGAAGGTGGAATCGGTAATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的自絮凝產(chǎn)氫細菌，其特征在于所述哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌YUAN-3(Ethanologenbacterium Harbin YUAN-3)的16S-23S rRNA間隔區(qū)序列的GenBank注冊號為AY556390，16S-23S rRNA間隔區(qū)序列為GGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTTTCTAAGGAGACTCGTTTCTTTAGAAACAGTGTCAGCGCAGGGATTTGTGGAAAGATGTTGTTTAATTTTGAGGGTCCGGGCGGACGCGGTTCGCTTTTAAGCCGCCGGCCATGCAGATCGGATTGGGAGCGAACAGCCCCGATGCAGGAAGCATGACGGCAGTTTGAAGACGGGCGGCGTCCCAAAGAACCTTCAAACGGTGGAAAAGAGAATAGGACGACCGATTCCCAGGCAAAGCGTGGGGTATAGCTTTCAGGCTGAGCAGTCCGAGAACAGGAGATTTTCCTGAACTTGCGCCGCGCAGCGGTGAACTTGCCGCTACGGTGAGTAGGGGGCGTAGCTCAGCTGGGAGAGCACCTGCTTTGCACGCAGGGGGTCAGGAGTTCGATTCTCCTCATCTCCACCACGCCTGCGGCGGATATGACGCGCCAAGGCAGCCGAAAACGAAAATGCAAAGCCGCGAGGCCAAGCGTCGACGTTGAGGAAGCCAAAGCATGCATGCCGGTTGCAGGCAAACCAAATGGCCCGGGCGGGAACGGACGACCGAGATGCTCGGATTGCATGGGCTCATAGCTCAGGTGGTTAGAGCGTGCGCCTGATAAGCGCAAGGTCGGTGGTTCGAGTCCACTTGAGCCCACCAGCGGGCAGTGCCCGCACACAATTCGCGGGAAGTTTGTTCAAAGCAGAGGTCGGCCGCCGCGAAAGCGAGACGGATCGAAGCAAGAACAGATGGATCGCAAAACCGCTTGCAAAAGAGGTAAGATTTCAGGCTGAGCAGCCGCGTAAGCAACGACTTTCCTGAACTTGCCTCCGCCGCAGGCGGGGGGACCTTGAAAACTGAATAATGTTCTAATCTGCAATTTTTTTAATGAACGAAGCGAGTAGCGGCGGAAGTTTCAGGTTGAGCAGCTGTGTAAGCAGTGGGCTTGCTTGAACATACGTCTTGCGAAGCAAGTTCGTTGGGTAAAATTCCGATTGACACATAAGGTCAAGCTACAAAGAGCGCAAGGGGAATGCCTTGGCACCAGGAGCCGATGAAGGACGCAGCGATCTGCGAAAAGCCACGGGGAGTCGAAAGCAGGCATTGATCCGTGGATATCCGAATGGGGCAACCCGGCGGAGCCATACTCCGTCAGCGTGCAGTGAATCCATAGCTGCACGTGGGGAACCGCCTGAACTGAAACATCTAAGTACC。
4.自絮凝產(chǎn)氫細菌的篩選方法，其特征在于它是這樣實現(xiàn)的一、采用細菌分離培養(yǎng)基對菌株進行產(chǎn)氫細菌的分離、純化和篩選；二、將篩選出的自絮凝產(chǎn)氫菌株重復(fù)分離、純化，進行自絮凝高效產(chǎn)氫菌株的優(yōu)選。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的自絮凝產(chǎn)氫細菌的篩選方法，其特征在于所述培養(yǎng)基包括下述成分葡萄糖、胰蛋白胨、牛肉膏、酵母汁、NaCl、K2HPO4、L-半胱氨酸、FeSO4.7H2O、MgCl2、微量元素、維生素和刃天青。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的自絮凝產(chǎn)氫細菌的篩選方法，其特征在于所述培養(yǎng)基(固體培養(yǎng)基)由下述成分組成葡萄糖10～30g、胰蛋白胨2～6g、牛肉膏1～4g、酵母汁0.1～1.5g、NaCl 2～6g、K2HPO40.5～3g、L-半胱氨酸0.1～1g、FeSO4.7H2O 0.1～0.5g、MgCl20.1～0.5g、微量元素5～20ml、維生素5～15ml、刃天青0.01～0.1％(w/v)。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的自絮凝產(chǎn)氫細菌的篩選方法，其特征在于所述培養(yǎng)基中各成分的含量為葡萄糖20g、胰蛋白胨4g、牛肉膏2g、酵母汁1g、NaCl 4g、K2HPO41.5g、L-半胱氨酸0.5g、FeSO4.7H2O 0.1g、MgCl20.1g、微量元素10ml、維生素10ml、刃天青0.2％(w/v)。
8.根據(jù)權(quán)利要求5、6或7所述的自絮凝產(chǎn)氫細菌的篩選方法，其特征在于所述微量元素由下述成分組成MnSO4.7H2O 0.01g、ZnSO4.7H2O 0.05g、H3BO30.01、N(CH2COOH)34.5g、CaCl2.2H2O 0.01g、Na2MoO40.01g、CoCl2.6H2O0.2g、AlK(SO4)20.01g，定容1000mL。
9.根據(jù)權(quán)利要求5、6或7所述的自絮凝產(chǎn)氫細菌的篩選方法，其特征在于所述維生素由下述成分組成鈷銨素0.01g、抗壞血酸0.025g、核黃素0.025g、檸檬酸0.02g、吡多醛0.05g、葉酸0.01g、對氨基苯甲酸0.01g、肌酸0.025g，定容1000mL。
全文摘要
自絮凝產(chǎn)氫細菌及其篩選方法，它涉及一株自絮凝發(fā)酵產(chǎn)氫細菌新種及其篩選方法。本發(fā)明的哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌YUAN－3已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC No.1152。該菌株的16S rRNA基因序列GenBank注冊號為AY675965，16S－23S rRNA間隔區(qū)序列注冊號為AY556390。菌株YUAN－3為專性厭氧桿菌，代謝特征為乙醇發(fā)酵，最大比產(chǎn)氫速率為22.6mmolH
文檔編號C12N15/31GK1624109SQ20041004383
公開日2005年6月8日 申請日期2004年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月27日
發(fā)明者邢德峰, 任南琪, 李秋波 申請人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)