專利名稱：乙型肝炎病毒顆粒的分離純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種病毒顆粒的分離純化方法，特別涉及乙型肝炎病毒(HBV)顆粒的分離純化方法。
背景技術(shù)：
乙型肝炎是全球重大的衛(wèi)生健康問題。研究乙型肝炎病毒的感染機制，對乙型肝 炎的防治和抗乙型肝炎藥物的研發(fā)具有重要意義。而乙型肝炎病毒感染機制的研究需要大 量的乙型肝炎病毒顆粒，雖然可以從HepG. 2. 2. 15培養(yǎng)體系中提取出乙型肝炎病毒顆粒， 但其病毒滴度低于105COpieS/ml，遠遠達不到研究需求。目前，乙型肝炎病毒顆粒主要是采 用不連續(xù)蔗糖密度梯度超速離心法從乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)陽性患者的血清中分離 純化得到，但現(xiàn)有方法存在時間長、病毒顆粒收獲率低、成本高等問題。與靈長類親緣關(guān)系 較接近的樹駒(Tupaia Belangeri)及其原代肝細胞是乙型肝炎研究中備受關(guān)注的體內(nèi)外 模型。最近的研究顯示，血清成分會降低樹駒肝細胞對乙型肝炎病毒的感染效率。因此，建 立短時、高效的乙型肝炎病毒顆粒分離純化方法，是建立乙型肝炎病毒感染模型，進行乙型 肝炎病毒感染機制研究和抗乙型肝炎藥物篩選的先決條件。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種乙型肝炎病毒顆粒的分離純化方法，可以 短時、高效地分離純化乙型肝炎病毒顆粒，病毒顆粒收獲率高，所得病毒顆粒具有典型的乙 型肝炎病毒特征和良好的感染活性。為達到上述目的，本發(fā)明的乙型肝炎病毒顆粒的分離純化方法，包括以下步驟a、取乙型肝炎病毒DNA陽性血清，離心去除血清中的血漿蛋白，取上清液，再離心 去除血清中的脂肪，取上清液，備用；b、在離心管中，自下而上依次加入質(zhì)量分數(shù)為60%、45%、35%、25%和15%的蔗 糖溶液以及步驟a所得乙型肝炎病毒DNA陽性血清上清液，在溫度為4 10°C的條件下， 70000g離心5小時，離心后，自離心管底部分段吸取離心液并分別收集到不同的容器內(nèi)；C、合并步驟b所得呈無色透明的各份收集液，用TNE緩沖液稀釋后，超濾離心去除 蔗糖，再用TNE緩沖液充分洗滌，收集超濾液，即得乙型肝炎病毒顆粒。進一步，所述步驟b中質(zhì)量分數(shù)為60%、45%、35%、25%和15%的蔗糖溶液以及 乙型肝炎病毒DNA陽性血清上清液的體積比為2 2 2 3 3 6。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明的乙型肝炎病毒顆粒分離純化方法，可以短時、高 效地分離純化乙型肝炎病毒顆粒，病毒顆粒收獲率高，所得病毒顆粒具有典型的乙型肝炎 病毒特征和良好的生物學感染活性，可以有效感染樹駒原代肝細胞，為建立乙型肝炎病毒 感染模型，進行乙型肝炎病毒感染機制研究和抗乙型肝炎藥物篩選提供了良好基礎(chǔ)。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進 一步的詳細描述，其中圖1為不連續(xù)蔗糖密度梯度超速離心法的示意圖；圖2為熒光定量PCR測定lOOOOOg離心的各溶液的乙型肝炎病毒DNA滴度；圖3為熒光定量PCR測定70000g離心的各溶液的乙型肝炎病毒DNA滴度；圖4為分別按兩種計算公式計算100000g離心和70000g離心的乙型肝炎病毒DNA 純化收獲率；圖5為100000g離心和70000g離心的乙型肝炎病毒DNA超濾收獲率比較；圖6為電子顯微鏡觀察乙型肝炎病毒顆粒；圖7為電化學發(fā)光免疫法測定感染乙型肝炎病毒顆粒的樹駒原代肝細胞的乙型 肝炎表面抗原(HBsAg)表達量；圖8為免疫組化法測定感染乙型肝炎病毒顆粒的樹駒原代肝細胞的乙型肝炎核 心抗原(HBcAg)表達量；其中，A為乙型肝炎病毒顆粒感染的樹駒原代肝細胞，B為陰性對照。
具體實施例方式以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。在優(yōu)選實施例中，采用的實驗材料如下乙型肝炎病毒DNA陽性血清將乙型肝 炎病毒DNA陽性患者血液(DNA拷貝數(shù)彡107，重慶醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院)以1700g離心 15分鐘，分離血清，溫度-20°C保存；TNE緩沖液由濃度為20mM的三羥甲基氨基甲烷鹽酸 鹽(Tris-HCl)、濃度為140mM的氯化鈉和濃度為ImM的乙二胺四乙酸(EDTA)組成，pH為 7. 4 ；蔗糖溶液以TNE緩沖液為溶劑，分別制成質(zhì)量分數(shù)為60%、45%、35%、25%和15% 的溶液；體重135g的成年雄性樹駒(中國科學院昆明動物所)；樹駒肝細胞培養(yǎng)板和培養(yǎng) 基 H印ato-STIM Hepatocyte Defined Medium(美國 BD Biosciences 公司)；乙型肝炎病 毒DNA熒光定量PCR試劑盒(上?？寺∩锔呒夹g(shù)有限公司)；乙型肝炎核心抗原ELISA試 劑盒(RAB-009，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)，濃縮型DAB試劑盒(北京中杉金橋生物 技術(shù)有限公司)；Vivaspin 20ml超濾濃縮離心管(德國Sartorius公司)J-30I型高速低 溫離心機(德國Beckman公司)；Rotor-Gene 6000型熒光定量PCR儀(澳大利亞Corbett Research公司)JeollOlOXC型電子顯微鏡(日本Tokyo公司)；Elec_sys2010型電化學 發(fā)光免疫分析儀(德國羅氏公司)。1、乙型肝炎病毒顆粒的分離純化方法(1)不連續(xù)蔗糖密度梯度超速離心分離純化(示意圖見圖1)取乙型肝炎病毒 DNA陽性血清，5000g離心15分鐘去除血清中的血漿蛋白，取上清液，再15000rpm離心30 分鐘去除血清中的脂肪，取上清液，備用；取8支50ml離心管，在每支離心管中自下而上依 次加入質(zhì)量分數(shù)為60%、45%、35%、25%和15%的蔗糖溶液以及上述制好的血清上清液 (各溶液加入體積見表1)，在溫度8°C條件下100000g或70000g離心5小時，離心完畢后， 自離心管底部分段吸取離心液并分別收集到不同的試管內(nèi)。在本實施例中，每支離心管共 分段吸取6次第1次取1ml，第2次至第6次各取2ml ；從而獲得6份收集液第1份至第 5份均呈無色透明，第6份呈淡黃色，說明其中已含有血清，故不再分段吸取剩余離心液；分別合并自8支離心管中吸取的第1份至第6份收集液以及剩余離心液，則第1份收集液合 并后的體積為8ml，第2份至第6份收集液合并后的體積各為16ml，剩余離心液合并后的體 積為200ml。
(2)超濾離心濃縮合并IOOOOOg離心和70000g離心各自的第1份至第5份收集 液，用TNE緩沖液稀釋5倍后，超濾離心去除蔗糖，再用TNE緩沖液洗滌3次，收集超濾液， 即得乙型肝炎病毒顆粒。在本實施例中，獲得IOOOOOg離心的超濾液5. 4ml，70000g離心的 超濾液5. 6ml。表1不連續(xù)蔗糖密度梯度超速離心 2、乙型肝炎病毒顆粒分離純化方法的評價(1)乙型肝炎病毒DNA滴度測定采用乙型肝炎病毒DNA熒光定量PCR試劑盒，分別測定IOOOOOg離心和70000g離 心各自的乙型肝炎病毒DNA陽性血清上清液、各份收集液、剩余離心液以及超濾液的病毒 DNA滴度，按照試劑盒說明書操作。結(jié)果見表2 3和圖2 3。表2 IOOOOOg離心所得各溶液的乙型肝炎病毒DNA滴度測定 表3 70000g離心所得各溶液的乙型肝炎病毒DNA滴度測定 (2)乙型肝炎病毒DNA超速離心損失率計算按照計算公式離心損失率=(1-第1 6份收集液及剩余離心液的乙型肝炎病
毒DNA量之和/乙型肝炎病毒DNA陽性血清上清液的乙型肝炎病毒DNA量)X 100%,分別
計算IOOOOOg離心和70000g離心的病毒DNA超速離心損失率。結(jié)果IOOOOOg離心和70000g離心的病毒DNA超速離心損失率分別為79 %
和-61%。70000g離心的病毒DNA超速離心損失率為負數(shù)，其原因可能在于乙型肝炎病
毒DNA在血清中不穩(wěn)定，而在蔗糖溶液和TNE緩沖液中較穩(wěn)定，乙型肝炎病毒DNA陽性血清
上清液中的乙型肝炎病毒DNA在測定前發(fā)生了降解，從而導致各份收集液的乙型肝炎病毒
DNA量之和大于乙型肝炎病毒DNA陽性血清上清液的乙型肝炎病毒DNA量。(3)乙型肝炎病毒DNA純化收獲率計算由于IOOOOOg離心和70000g離心的病毒DNA超速離心損失率差別較大，因此，分別按照下述兩種計算公式計算病毒DNA純化收獲率公式1，收獲率=(第1 5份收集 液的乙型肝炎病毒DNA量之和/乙型肝炎病毒DNA陽性血清上清液的乙型肝炎病毒DNA 量)X 100% ；公式2，收獲率=(第1 5份收集液的乙型肝炎病毒DNA量之和/第1 6 份收集液及剩余離心液的乙型肝炎病毒DNA量之和)X 100%。結(jié)果見圖4，按公式1計算，lOOOOOg離心和70000g離心的病毒DNA純化收獲率分 別為20%和84%，70000g離心的病毒DNA純化收獲率是100000g離心的4倍多；按公式2 計算，100000g離心和70000g離心的病毒DNA純化收獲率分別為95%和52%，100000g離心 的病毒DNA純化收獲率比70000g離心高43%，但是100000g離心的病毒DNA超速離心損失 率為79%;因此，按照公式1計算病毒DNA純化收獲率較為合理。按照公式1計算，100000g 離心重復實驗兩次的病毒DNA純化收獲率平均值為21%，而70000g離心重復實驗三次的病 毒DNA純化收獲率為78士7. 4% (平均值士標準差)。(4)乙型肝炎病毒DNA超濾收獲率計算按照計算公式收獲率=(超濾液的乙型肝炎病毒DNA量/第1 5份收集液的 乙型肝炎病毒DNA量之和)X 100 %，分別計算100000g離心和70000g離心的病毒DNA超濾
收獲率。結(jié)果見圖5，100000g離心和70000g離心的病毒DNA超濾收獲率分別為88%和 91%，二者無明顯差別。(5)電子顯微鏡觀察乙型肝炎病毒顆粒將70000g離心的超濾液加于鍍碳的銅網(wǎng)上，用質(zhì)量分數(shù)為2%的醋酸鈾溶液進行 負染，置電子顯微鏡下觀察。結(jié)果見圖6，在70000g離心的超濾液中，有大量的病毒樣顆粒存在。(6)乙型肝炎病毒顆粒感染活性測定采用兩步灌注法獲取樹駒原代肝細胞，接種于膠原包被的培養(yǎng)板上，用培養(yǎng)基 Hepato-STIM Hepatocyte Defined Medium培養(yǎng)，取培養(yǎng)3天狀態(tài)良好的樹駒原代肝細胞， 用70000g離心的超濾液進行感染，感染復數(shù)(M0I)分別為6. 25、12.5、25、50、100，同時設對 照組(正常樹駒肝細胞)，收集感染后第12天的細胞上清，采用電化學發(fā)光免疫法測定樹鼠句 原代肝細胞中乙型肝炎表面抗原的表達量，并采用免疫組化法測定樹駒原代肝細胞中乙型 肝炎核心抗原的表達量。電化學發(fā)光免疫法測定結(jié)果見圖7，對照組的乙型肝炎病毒表面抗原表達量為 1. 58C0I，感染復數(shù)分別為6. 25、12. 5、25、50、100的感染孔的乙型肝炎病毒表面抗原表達 量分別為1. 65、1. 77,2. 09,2. 21,4. 54C0I，可見隨著感染復數(shù)增加，乙型肝炎病毒表面抗原 的表達量也逐漸增加，二者之間存在明顯的劑量依賴關(guān)系。免疫組化法測定結(jié)果見圖8，乙型肝炎病毒顆粒感染樹駒原代肝細胞12天后，乙 型肝炎核心抗原(圖中圓圈部分)彌漫性地位于肝細胞胞漿內(nèi)，說明乙型肝炎病毒在肝細 胞胞漿內(nèi)大量復制。在本實施例的不連續(xù)蔗糖密度梯度超速離心分離純化步驟中，質(zhì)量分數(shù)為60%、 45 %、35 %、25 %和15 %的蔗糖溶液以及乙型肝炎病毒DNA陽性血清上清液的體積比為 2:2:2:3:3: 6，采用該體積比，可以在離心過程中使乙型肝炎病毒顆粒和血清成 分盡量分離開。因乙型肝炎病毒顆粒離心后大部分匯集在質(zhì)量分數(shù)為60 %的蔗糖溶液和質(zhì)
7量分數(shù)為45%的蔗糖溶液之間，分段吸取離心液時第1次取1ml，第2次和第3次各取2ml， 則第3次吸取時剛好收集到峰濃度的乙型肝炎病毒顆粒。乙型肝炎病毒顆粒在血清中呈膠體或半膠體狀態(tài)，分離乙型肝炎病毒顆粒與血清 成分時，需要強大的離心力迫使病毒顆?？朔U散而沉降，但離心力越大，病毒沉降速度越 大，所受到的阻力也越大，一旦超出病毒的承受力，就會引起病毒破裂。上述實驗結(jié)果顯 示，IOOOOOg離心造成大量乙型肝炎病毒顆粒在離心過程中損失，病毒DNA純化收獲率只有 20%，而70000g離心不僅降低了離心過程中的病毒顆粒損失，而且可以有效分離乙型肝炎 病毒顆粒和血清，病毒純化收獲率達到78%以上，較IOOOOOg離心明顯提高。文獻報道的乙 型肝炎病毒顆粒分離純化方法中，多采用不連續(xù)蔗糖密度梯度112000g離心15小時，存在 時間長、病毒顆粒收獲率低、成本高等問題，而采用本發(fā)明方法，70000g離心5小時，即可短 時、高效地分離純化乙型肝炎病毒顆粒，所得病毒顆粒不但具有典型的乙型肝炎病毒特征， 還具有良好的生物學感染活性。最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參照本發(fā)明的優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應當理解，可 以在形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明 的精神和范圍。
權(quán)利要求
乙型肝炎病毒顆粒的分離純化方法，其特征在于包括以下步驟a、取乙型肝炎病毒DNA陽性血清，離心去除血清中的血漿蛋白，取上清液，再離心去除血清中的脂肪，取上清液，備用；b、在離心管中，自下而上依次加入質(zhì)量分數(shù)為60％、45％、35％、25％和15％的蔗糖溶液以及步驟a所得乙型肝炎病毒DNA陽性血清上清液，在溫度為4～10℃的條件下，70000g離心5小時，離心后，自離心管底部分段吸取離心液并分別收集到不同的容器內(nèi)，至收集液呈淡黃色時停止吸取和收集；c、合并步驟b所得呈無色透明的各份收集液，用TNE緩沖液稀釋后，超濾離心去除蔗糖，再用TNE緩沖液充分洗滌，收集超濾液，即得乙型肝炎病毒顆粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎病毒顆粒的分離純化方法，其特征在于所述步驟 b中質(zhì)量分數(shù)為60 %、45 %、35 %、25 %和15 %的蔗糖溶液以及乙型肝炎病毒DNA陽性血清 上清液的體積比為2 2 2 3 3 6。
全文摘要
本發(fā)明公開了乙型肝炎病毒顆粒的分離純化方法，是將乙型肝炎病毒DNA陽性血清以70000g進行不連續(xù)蔗糖密度梯度(60％、45％、35％、25％、15％)離心5小時，再自離心管底部分段吸取離心液并分別收集到不同的容器內(nèi)，合并呈無色透明的各份收集液，超濾離心去除蔗糖，即得乙型肝炎病毒顆粒；本發(fā)明方法可以短時、高效地分離純化乙型肝炎病毒顆粒，病毒顆粒收獲率高，所得病毒顆粒具有典型的乙型肝炎病毒特征和良好的生物學感染活性，可以有效感染樹鼩原代肝細胞。
文檔編號C12N7/02GK101875921SQ20091025094
公開日2010年11月3日 申請日期2009年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月22日
發(fā)明者劉宏利, 吳玉章, 曾興光, 謝諄怡, 鄒麗云, 韓俊峰 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學