專利名稱：快速檢測(cè)病毒中和抗體的方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒抗體檢測(cè)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及通過(guò)酶聯(lián) 免疫斑點(diǎn)顯色和自動(dòng)掃描儀器，對(duì)人腸道病毒中和抗體進(jìn)行檢測(cè)的方 法和試劑盒。
背景技術(shù)：
人腸道病毒(Human Enterovirus, EV )包括脊髓灰質(zhì)炎病毒 (Poliovirus)、柯薩奇病毒(Coxsackievirus)、 ?？刹《?enteric cytopathogenic human orphan virus , ECHO)和新腸道病毒 (Enterovirus 68-71型及73-102型)，其引發(fā)的由呼吸系統(tǒng)疾病到 中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多種疾病給人類健康帶來(lái)極大威脅和嚴(yán)重危害，尤其 是新腸道病毒EV71引起的手足口病，發(fā)病率和死亡率近年呈逐年上升 趨勢(shì)。因此，開(kāi)發(fā)快速的診斷試劑與安全有效的預(yù)防或治療性疫苗具 有重大意義。人腸道病毒疫苗研究開(kāi)發(fā)的最重要的指標(biāo)是人腸道病毒 的中和抗體水平，因此建立準(zhǔn)確和簡(jiǎn)便的中和抗體檢測(cè)方法非常重要。
EV大多具有嚴(yán)格的宿主特異性，在體外對(duì)EV進(jìn)行快速高效的組織培 養(yǎng)比較困難，并且缺乏合適的動(dòng)物模型。因此亟待探索開(kāi)發(fā)可及時(shí)鑒 定或篩選中和抗體和評(píng)價(jià)疫苗有效性的方法。
到目前為止，已有多種EV中和抗體檢測(cè)方法，如基于補(bǔ)體結(jié)合試 驗(yàn)(CFT)的檢測(cè)方法(Kraft， LM等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，1950年，92巻 483-497頁(yè))、基于間接免疫熒光(IFA)的檢測(cè)方法(Macwi 11 iam， KM 等，臨床病理學(xué)雜志，1974年，27巻，825-827頁(yè))、基于傳統(tǒng)中和 實(shí)驗(yàn)(NT)的檢測(cè)方法(Melnick， JL等，美國(guó)公共衛(wèi)生協(xié)會(huì)，1979年， 5巻，471-534頁(yè))、基于酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)的檢測(cè)方法 (Bidwell，DE等,Bull.WHO, 1976年，54巻，129-139頁(yè))等。其中，CFT操作繁雜，影響結(jié)果判定的因素較多，且補(bǔ)體結(jié)合抗體的特
異性較低，因此現(xiàn)在很少使用；IFA雖然特異性較高，但敏感性較低
且結(jié)果判定受主觀因素影響，分析自動(dòng)化困難，難以滿足快速高效篩 選中和抗體的需求。
當(dāng)前檢測(cè)EV中和抗體的方法主要有兩種(一)NT:是將抗體樣 品與病毒作用后感染細(xì)胞，連續(xù)7至IO天觀察細(xì)胞病變情況，再通過(guò) 肉眼觀察并采用CCID50或TCID50方法計(jì)算病毒效價(jià)，進(jìn)而評(píng)估EV 中和抗體對(duì)病毒感染的阻斷能力；(二)ELISA: —般采用間接ELISA， 利用包被的病毒或重組抗原，與為中和抗體的抗體樣品結(jié)合，再結(jié)合 生物素標(biāo)記的第二抗體，然后用酶標(biāo)親和素與生物素結(jié)合，進(jìn)行化學(xué) 酶聯(lián)顯色，再用酶標(biāo)分析儀獲得結(jié)果，進(jìn)而評(píng)估EV中和抗體的中和效 果。但在實(shí)際應(yīng)用中，上述方法前者實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，工作量大，人工 判定也存在主觀誤差問(wèn)題，難于滿足快速、高通量的篩選需求；后者 敏感性較高，可用于自動(dòng)化分析，結(jié)果判斷比較客觀，但其特異性取 決于抗原制備，不能用于準(zhǔn)確檢測(cè)中和抗體。
因而，本領(lǐng)域迫切需要建立改進(jìn)的中和抗體檢測(cè)方法。本發(fā)明滿
足了這一需要和其它需要。
發(fā)明概述
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供改進(jìn)的病毒中和抗體檢測(cè)方法。優(yōu)選 地，本發(fā)明方法具有簡(jiǎn)單、有效、和/或快速的特點(diǎn)，更優(yōu)選本發(fā)明方 法適于進(jìn)行高通量的檢測(cè)病毒(特別是腸道病毒)中和抗體。在一個(gè) 優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合了酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)顯色和斑點(diǎn)掃描儀器，
號(hào)(如顏色信號(hào))，并應(yīng)用斑點(diǎn)掃描儀器掃描檢測(cè)斑點(diǎn)的數(shù)量來(lái)實(shí)現(xiàn) 對(duì)被人腸道病毒感染的細(xì)胞的檢測(cè)，從而構(gòu)建一種新型高效的用于檢 測(cè)人腸道病毒中和抗體的模式，并將這種模式應(yīng)用于檢測(cè)人腸道病毒 中和抗體的方法。
常規(guī)的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(ELISPOT) (Sedgwick JD，分子生物學(xué)方法雜志，2005年，302巻，3-14頁(yè))是通過(guò)顯微鏡或ELISP0T酶聯(lián)斑 點(diǎn)分析系統(tǒng)對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行分析獲得結(jié)果的一種方法。它是從單細(xì)胞水平 檢測(cè)分泌細(xì)胞因子(CK)的細(xì)胞或分泌抗體的細(xì)胞(ASC)，而本發(fā)明(即 新酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法)則是從單細(xì)胞水平檢測(cè)感染病毒的細(xì)胞，從而間 接反映單克隆抗體對(duì)病毒感染的阻斷能力，最終評(píng)判中和抗體的中和 效果。
優(yōu)選地，本發(fā)明的腸道病毒中和抗體檢測(cè)方法簡(jiǎn)便，快速，避免 了傳統(tǒng)的CCID5。方法實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)的問(wèn)題，因此更適于進(jìn)行高通量檢測(cè)。 在一個(gè)實(shí)施方案中，應(yīng)用本發(fā)明的方法和傳統(tǒng)的CCIDs。方法對(duì)同一樣 品進(jìn)行了對(duì)比檢測(cè)，結(jié)果顯示二者具有高度的相關(guān)性。本發(fā)明采用的 斑點(diǎn)檢測(cè)法，優(yōu)選是一種原位檢測(cè)的方式。在檢測(cè)中釆用自動(dòng)化連續(xù) 檢測(cè)的斑點(diǎn)檢測(cè)儀器，可減少傳統(tǒng)的CCIDs。方法檢測(cè)中肉眼判斷細(xì)胞 病變產(chǎn)生的主觀誤差，并且能夠提高檢測(cè)的效率。
具體地，本發(fā)明涉及了應(yīng)用酶聯(lián)免疫反應(yīng)使被病毒特別是腸道病 毒感染的細(xì)胞產(chǎn)生顏色標(biāo)記的方法，和將斑點(diǎn)檢測(cè)儀器應(yīng)用于被感染 細(xì)胞顏色信號(hào)標(biāo)記的識(shí)別和檢測(cè)的方法。本發(fā)明還涉及檢測(cè)病毒中和 抗體的方法，包括應(yīng)用酶聯(lián)免疫反應(yīng)使被病毒特別是腸道病毒感染 的細(xì)胞產(chǎn)生顏色標(biāo)記，和將斑點(diǎn)檢測(cè)儀器應(yīng)用于被感染細(xì)胞顏色信號(hào) 標(biāo)i己的識(shí)別和檢測(cè)。
一方面，本發(fā)明涉及了應(yīng)用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)反應(yīng)使被病毒特別是腸 道病毒感染的細(xì)胞帶有信號(hào)標(biāo)記(如顏色信號(hào))的方法。在一個(gè)具體 實(shí)施方案中，本發(fā)明方法包括通過(guò)標(biāo)記的(如HRP標(biāo)記的)抗人腸 道病毒單克隆抗體與人腸道病毒反應(yīng)，使被人腸道病毒感染的細(xì)胞結(jié)
合了標(biāo)記的抗體如酶標(biāo)抗體，而后者可直接作為信號(hào)產(chǎn)生體或間接(如
通過(guò)催化作用等)導(dǎo)致另外的信號(hào)產(chǎn)生體產(chǎn)生可被本發(fā)明所述的斑點(diǎn)
檢測(cè)儀器所識(shí)別、檢測(cè)的信號(hào)。本發(fā)明還提供了另一種可以使被人腸
道病毒感染的細(xì)胞產(chǎn)生顏色標(biāo)記的方法，該方法包括通過(guò)抗人腸道
病毒單克隆抗體與被人腸道病毒感染的細(xì)胞中的人腸道病毒結(jié)合，而 后再與標(biāo)記的(如HRP標(biāo)記的)第二抗體(如GAM-HRP)結(jié)合，后者可直接作為信號(hào)產(chǎn)生體或間接(如通過(guò)催化作用等)導(dǎo)致另外的信號(hào) 產(chǎn)生體產(chǎn)生可被本發(fā)明所述的斑點(diǎn)檢測(cè)儀器所識(shí)別、檢測(cè)的信號(hào)。
另一方面，本發(fā)明涉及了將斑點(diǎn)檢測(cè)儀器應(yīng)用于檢測(cè)病毒特別是 人腸道病毒中和抗體的方法。斑點(diǎn)檢測(cè)儀器能夠從細(xì)胞群體中分辨和 測(cè)算出具有與正常細(xì)胞不同的顏色信號(hào)的細(xì)胞，并且對(duì)該信號(hào)進(jìn)行快 速自動(dòng)的檢測(cè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明以目前廣泛應(yīng)用于細(xì)胞免
疫檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的儀器Elispot為示例。Elispot具備本發(fā)明提出的斑點(diǎn) 檢測(cè)儀器的性能，能夠有效地滿足本發(fā)明的檢測(cè)方法的需要。目前， 還尚未有EHspot用于人腸道病毒中和實(shí)驗(yàn)的報(bào)道。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的人腸道病毒中和抗體檢測(cè)方法在篩選人腸 道病毒中和性單克隆抗體中的用途。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的人腸道病毒中和抗體檢測(cè)方法在檢測(cè)人腸 道病毒中和抗體效價(jià)中的用途。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的人腸道病毒中和抗體檢測(cè)方法在制備人腸 道病毒中和抗體診斷試劑盒中的用途。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的人腸道病毒中和抗體檢測(cè)方法在人腸道病 毒疫苗開(kāi)發(fā)和質(zhì)控中的用途。 本發(fā)明還涉及本發(fā)明的人腸道病毒中和抗體檢測(cè)方法在篩選或制 備抗人腸道病毒或其相關(guān)疾病藥物中的用途。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的人腸道病毒中和抗體檢測(cè)方法在治療人腸 道病毒感染中的用途。
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說(shuō)明。從下文的詳細(xì)描述中， 本發(fā)明的上述方面和本發(fā)明的其他方面將是明顯的。


圖1顯示了對(duì)EV71病毒感染后的RD細(xì)胞進(jìn)行酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè) 后的顯微鏡觀察結(jié)果，被病毒感染的細(xì)胞可顯示出區(qū)別于未被病毒感 染的細(xì)胞的顏色，未被感染細(xì)胞則沒(méi)有顏色顯示出來(lái)。
圖2顯示了應(yīng)用斑點(diǎn)檢測(cè)儀器El ispot對(duì)被EV71病毒感染并進(jìn)行酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)反應(yīng)的細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果，被病毒感染的細(xì)胞可顯示出區(qū)
別于未被感染的細(xì)胞的可被E1 i spot儀器識(shí)別和檢測(cè)的藍(lán)色斑點(diǎn)，孔 中的藍(lán)色細(xì)胞數(shù)即被感染細(xì)胞數(shù)量可顯示于圖像的左上方。
圖3顯示了分別應(yīng)用本發(fā)明的方法與傳統(tǒng)的TCIDs。方法對(duì)同樣的 EV71病毒滴度的檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性比較。
圖4顯示了本發(fā)明的腸道病毒中和抗體檢測(cè)方法的示例簡(jiǎn)圖。 圖5顯示了分別應(yīng)用本發(fā)明的EV71中和抗體檢測(cè)方法與傳統(tǒng)的 CCIDs。中和抗體檢測(cè)方法對(duì)同一經(jīng)梯度稀釋的EV71中和性單克隆抗體 12C3的中和效價(jià)的檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性比較。圖6顯示了分別應(yīng)用本發(fā) 明的EV71中和抗體檢測(cè)方法與傳統(tǒng)的CCID5。中和抗體檢測(cè)方法對(duì)同樣 的腸道病毒患者的急性期血清進(jìn)行EV71中和抗體效價(jià)檢測(cè)的對(duì)比結(jié) 果。
具體實(shí)施例方式
除非另外定義，這里所用的所有技術(shù)和科學(xué)名詞都表達(dá)的是在本 發(fā)明涉及領(lǐng)域里的熟練技術(shù)人員所理解的通常含義。這里所用的命名 和在細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)操作步驟均為相 應(yīng)領(lǐng)域內(nèi)廣泛使用的常規(guī)命名和步驟。
一方面，本發(fā)明提供檢測(cè)被病毒(例如人腸道病毒，特別是EV71 病毒)感染的細(xì)胞(優(yōu)選培養(yǎng)細(xì)胞或細(xì)胞系)的方法，該方法包括 (l)使得被病毒感染的細(xì)胞帶有可檢測(cè)的信號(hào)，而未被病毒感染的細(xì) 胞不帶有該信號(hào)；和(2)優(yōu)選通過(guò)應(yīng)用斑點(diǎn)檢測(cè)儀器或通過(guò)以斑點(diǎn)檢 測(cè)法，檢測(cè)細(xì)胞是否帶有該信號(hào)。
所述信號(hào)優(yōu)選是能被斑點(diǎn)檢測(cè)儀器檢測(cè)到的信號(hào)或者適合于斑 點(diǎn)檢測(cè)法檢測(cè)的信號(hào)，例如正常細(xì)胞不具有的顏色、熒光、或發(fā)光等。 所述信號(hào)由信號(hào)產(chǎn)生體或者標(biāo)記產(chǎn)生，所述信號(hào)產(chǎn)生體或者標(biāo)記可以 是例如酶、蛋白質(zhì)、熒光物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、同位素、或稀土元素。
使被病毒感染的細(xì)胞帶有可檢測(cè)的信號(hào)可以采用多種方法來(lái)進(jìn)
12行。在一個(gè)優(yōu)選方案中，通過(guò)如下方法實(shí)現(xiàn)使檢測(cè)用病毒抗體(優(yōu) 選標(biāo)記的如酶標(biāo)記的檢測(cè)用病毒抗體)與被感染細(xì)胞中的病毒或病毒 蛋白特異結(jié)合，檢測(cè)用病毒抗體能夠直接產(chǎn)生或間接產(chǎn)生(例如通過(guò) 顯色反應(yīng))能夠被斑點(diǎn)檢測(cè)儀器檢測(cè)的信號(hào)。優(yōu)選采用酶聯(lián)免疫方法。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明所述檢測(cè)被病毒感染的細(xì)胞的方 法用于檢測(cè)被病毒感染的細(xì)胞的數(shù)量，或者用于病毒滴度的確定。
優(yōu)選地，本發(fā)明方法還進(jìn)一步包括通過(guò)測(cè)算帶有所述信號(hào)的細(xì) 胞的數(shù)量來(lái)確定被病毒感染的細(xì)胞的數(shù)量。
另一方面，本發(fā)明還提供檢測(cè)被病毒(例如人腸道病毒)感染的 細(xì)胞(優(yōu)選培養(yǎng)細(xì)胞或細(xì)胞系)的方法，包括
(i )使病毒和靶細(xì)胞在適合病毒感染靶細(xì)胞的條件下接觸，之 后任選地進(jìn)行洗滌，之后使所得產(chǎn)物和檢測(cè)用病毒抗體在適合檢測(cè)用 病毒抗體與病毒或病毒蛋白結(jié)合的條件下接觸，或者
(U H吏病毒和檢測(cè)用病毒抗體在適合檢測(cè)用病毒抗體與病毒或 病毒蛋白結(jié)合的條件下接觸，之后任選地進(jìn)行洗滌，之后使所得產(chǎn)物 和耙細(xì)胞在適合病毒感染靶細(xì)胞的條件下接觸，或者
(iii)使病毒、檢測(cè)用病毒抗體和靶細(xì)胞同時(shí)在適合病毒感染 耙細(xì)胞且適合檢測(cè)用病毒抗體與病毒或病毒蛋白結(jié)合的條件下接觸；
所述方法優(yōu)選還進(jìn)一步包括檢測(cè)靶細(xì)胞中特異性結(jié)合的檢測(cè)用 病毒抗體，或者檢測(cè)靶細(xì)胞中包含特異性結(jié)合的檢測(cè)用病毒抗體的細(xì) 胞或其數(shù)量。
本發(fā)明所迷檢測(cè)用病毒抗體優(yōu)選是特異結(jié)合病毒或者病毒蛋白 (特別是病毒表面蛋白)的抗體，優(yōu)選是單克隆抗體，也優(yōu)選是在病 毒感染靶細(xì)胞后在靶細(xì)胞中表達(dá)的病毒蛋白的特異性抗體。所述檢測(cè) 用病毒抗體可以帶有標(biāo)記的或者未帶有標(biāo)記的，優(yōu)逸是酶標(biāo)記的。所 述檢測(cè)用病毒抗體可以直接產(chǎn)生或間接產(chǎn)生(例如通過(guò)顯色反應(yīng))能 夠被斑點(diǎn)檢測(cè)儀器檢測(cè)的信號(hào)。優(yōu)選地，本發(fā)明方法還進(jìn)一步包括 通過(guò)測(cè)算帶有所述信號(hào)的細(xì)胞的數(shù)量來(lái)確定被病毒感染的細(xì)胞的數(shù) 量。
13在本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，斑點(diǎn)檢測(cè)法獲得的檢測(cè)數(shù)據(jù)通 過(guò)斑點(diǎn)檢測(cè)儀器獲得。所用斑點(diǎn)檢測(cè)儀器優(yōu)選能夠用于分辨和測(cè)算細(xì)
胞群中產(chǎn)生特定信號(hào)(例如顏色)的細(xì)胞的數(shù)量，優(yōu)選是Elispot。 在本發(fā)明中，優(yōu)選地，所述檢測(cè)用病毒抗體是酶標(biāo)抗體，此時(shí)，
本發(fā)明方法還包括通過(guò)檢測(cè)酶的存在來(lái)檢測(cè)被感染細(xì)胞或其數(shù)量。 在另 一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述檢測(cè)用病毒抗體是未標(biāo)記的，
本發(fā)明方法還包括使第二抗體和靶細(xì)胞中可能存在的、特異結(jié)合的
檢測(cè)用病毒抗體結(jié)合，第二抗體是標(biāo)記的(優(yōu)選酶標(biāo)記的)，并檢測(cè)
包含特異性結(jié)合的第二抗體的細(xì)胞或其數(shù)量。
優(yōu)選地，作為標(biāo)記的酶是可以直接或間接產(chǎn)生能夠被斑點(diǎn)檢測(cè)儀
器檢測(cè)的信號(hào)的酶。
另一方面，本發(fā)明還提供一種檢測(cè)樣品中的病毒(例如人腸道病 毒)中和抗體的方法，包括使樣品中可能存在的病毒中和抗體與病 毒結(jié)合以阻斷病毒對(duì)乾細(xì)胞的感染，并應(yīng)用本發(fā)明檢測(cè)被病毒感染的 細(xì)胞的方法檢測(cè)被病毒感染的細(xì)胞，由此檢測(cè)樣品中的病毒中和抗體。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，檢測(cè)樣品中的病毒中和抗體的方法用于
檢測(cè)樣品中病毒中和抗體的存在與否和/或其效價(jià)。
在本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，斑點(diǎn)檢測(cè)法獲得的檢測(cè)數(shù)據(jù)通 過(guò)斑點(diǎn)檢測(cè)儀器獲得。所用斑點(diǎn)檢測(cè)儀器優(yōu)選能夠用于分辨和測(cè)算細(xì) 胞群中產(chǎn)生特定信號(hào)(例如顏色)的細(xì)胞的數(shù)量，優(yōu)選是Elispot。
在本發(fā)明中，優(yōu)選地，所述檢測(cè)用病毒抗體是酶標(biāo)抗體，此時(shí)， 本發(fā)明方法還包括通過(guò)檢測(cè)酶的存在來(lái)檢測(cè)被感染細(xì)胞或其數(shù)量。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述檢測(cè)用病毒抗體是未標(biāo)記的， 本發(fā)明方法還包括使第二抗體和靶細(xì)胞中可能存在的、特異結(jié)合的 檢測(cè)用病毒抗體結(jié)合，第二抗體是標(biāo)記的(優(yōu)選酶標(biāo)記的)，并檢測(cè) 包含特異性結(jié)合的第二抗體的細(xì)胞或其數(shù)量。
優(yōu)選地，作為標(biāo)記的酶是可以直接或間接產(chǎn)生能夠被斑點(diǎn)檢測(cè)儀 器檢測(cè)的信號(hào)的酶。
14另 一方面，本發(fā)明提供一種通過(guò)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)反應(yīng)高通量檢測(cè)被 病毒特別是腸道病毒感染的細(xì)胞或其數(shù)量的方法。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過(guò)應(yīng)用斑點(diǎn)檢測(cè)儀器檢測(cè)被病毒如
EV71病毒感染的細(xì)胞所具有，而未被感染的細(xì)胞不具有的信號(hào)來(lái)檢測(cè) 被病毒如EV71病毒感染的細(xì)胞或其數(shù)量。
本發(fā)明還提供一種高通量檢測(cè)被腸道病毒例如EV71病毒或其他 腸道病毒感染的細(xì)胞及其數(shù)量的方法，包括(1)使被EV71病毒或 其他腸道病毒感染的細(xì)胞帶有可被斑點(diǎn)檢測(cè)儀器檢測(cè)的信號(hào)，而未被 感染的細(xì)胞不具有此信號(hào)；和(2 )通過(guò)應(yīng)用斑點(diǎn)檢測(cè)儀器檢測(cè)此信號(hào) (或帶有此信號(hào)的細(xì)胞)來(lái)檢測(cè)被EV71病毒或其他腸道病毒感染的細(xì) 胞及其數(shù)量。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，使被EV71病毒或其他腸道病毒感染的細(xì)
胞帶有可被斑點(diǎn)檢測(cè)儀器檢測(cè)的信號(hào)是通過(guò)如下方法獲得的通過(guò)酶 標(biāo)抗體與病毒蛋白結(jié)合，該酶標(biāo)抗體可以直接或間接產(chǎn)生(例如通過(guò)
顯色反應(yīng))能夠被斑點(diǎn)檢測(cè)儀器檢測(cè)的信號(hào)。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，其中可用于間接產(chǎn)生信號(hào)的酶標(biāo)抗體可
以是標(biāo)記的(如HRP標(biāo)記的)的第一抗體(腸道病毒單克隆抗體)或 與第一抗體特異結(jié)合的標(biāo)記的第二抗體(例如GAM-HRP)，優(yōu)選酶標(biāo) 記的第 一抗腸道病毒抗體。其中所述的酶包括可以直接或間接產(chǎn)生能 夠被斑點(diǎn)檢測(cè)儀器檢測(cè)的信號(hào)的酶(如HRP)。
優(yōu)選地，本發(fā)明檢測(cè)被感染細(xì)胞的方法用于被EV71病毒或其他腸
道病毒感染的細(xì)胞的計(jì)數(shù)。因此，本發(fā)明還提供一種高通量檢測(cè)被 EV71病毒或其他腸道病毒感染的細(xì)胞的數(shù)量的方法。 所迷細(xì)胞通常是培養(yǎng)細(xì)胞。
本發(fā)明還提供一種采用斑點(diǎn)檢測(cè)法檢測(cè)樣品中的腸道病毒中和抗 體的方法。
本發(fā)明還提供一種通過(guò)使樣品中可能存在的腸道病毒中和抗體與腸道病毒接觸以阻止腸道病毒感染細(xì)胞(通常是培養(yǎng)細(xì)胞)，并通過(guò) 檢測(cè)被腸道病毒感染的細(xì)胞，來(lái)檢測(cè)樣品中的腸道病毒中和抗體的方
法，其特征在于應(yīng)用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法結(jié)合斑點(diǎn)檢測(cè)法高通量檢測(cè)被 腸道病毒感染的細(xì)胞或其數(shù)量，或者應(yīng)用本發(fā)明檢測(cè)被病毒感染的細(xì) 胞的方法來(lái)檢測(cè)被腸道病毒感染的細(xì)胞或其數(shù)量。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過(guò)應(yīng)用斑點(diǎn)檢測(cè)4義器檢測(cè)被感染的細(xì) 胞所具有(未被感染的細(xì)胞不具有)的顏色信號(hào)來(lái)檢測(cè)被腸道病毒(如 EV71)感染的細(xì)胞及其數(shù)量。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述的高通量檢測(cè)被腸道病毒感染的細(xì)
胞及其數(shù)量應(yīng)用如下方法來(lái)進(jìn)行，所述方法包括(l)使被腸道病毒 (如EV71)感染的細(xì)胞帶有適于斑點(diǎn)檢測(cè)儀器檢測(cè)的信號(hào)，但未被感 染的細(xì)胞不帶有該信號(hào)；和(2 )通過(guò)使用斑點(diǎn)檢測(cè)儀器檢測(cè)該信號(hào)(或 帶有該信號(hào)的細(xì)胞)來(lái)檢測(cè)被腸道病毒(如EV71)感染的細(xì)胞。
另一方面，本發(fā)明涉及一種快速、高效、更適用于進(jìn)行高通量檢 測(cè)的腸道病毒中和抗體檢測(cè)方法，可用于檢測(cè)樣品中是否存在腸道病 毒中和抗體，也可用于評(píng)價(jià)樣品中腸道病毒中和抗體的效價(jià)。在本發(fā) 明的具體實(shí)施方案中，作為示例，本發(fā)明的腸道病毒中和抗體檢測(cè)方 法被應(yīng)用于檢測(cè)EV71中和抗體，也可以應(yīng)用于檢測(cè)其他腸道病毒的中 和抗體，所述腸道病毒的例子是如CA16， CB3， CA6，或CA4等。
在本發(fā)明所述方法中，所述樣品為來(lái)自待檢個(gè)體的分離的生物學(xué) 樣品，優(yōu)選所述樣品為血清；或來(lái)自組織培養(yǎng)的生物學(xué)樣品。
所述腸道病毒中和抗體檢測(cè)方法可用于檢測(cè)樣品中腸道病毒中和 抗體的存在與否和/或其效價(jià)。
在本發(fā)明中，所述的斑點(diǎn)檢測(cè)法中的檢測(cè)數(shù)據(jù)優(yōu)選是通過(guò)使用斑 點(diǎn)檢測(cè)儀器獲得的。斑點(diǎn)檢測(cè)儀器能夠從細(xì)胞群體中分辨和測(cè)算產(chǎn)生 特定信號(hào)(例如顏色)的細(xì)胞的數(shù)量，優(yōu)選.Elispot。斑點(diǎn)檢測(cè)儀器 (如Elispot)可以通過(guò)檢測(cè)帶有由信號(hào)產(chǎn)生體直接或間接產(chǎn)生的信 號(hào)的細(xì)胞來(lái)檢測(cè)被病毒感染的細(xì)胞的數(shù)量。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，使被病毒感染的細(xì)胞產(chǎn)生能夠被斑點(diǎn)檢測(cè)儀器檢測(cè)的信號(hào)是通過(guò)如下方法獲得的通過(guò)酶標(biāo)抗體與病毒蛋白 結(jié)合，該酶標(biāo)抗體可以直接產(chǎn)生或間接產(chǎn)生(例如顯色反應(yīng))能夠被 斑點(diǎn)檢測(cè)儀器檢測(cè)的信號(hào)。
另一方面，本發(fā)明還涉及檢測(cè)樣品中的病毒(例如人腸道病毒) 中和抗體的方法，其包括以下步驟
(a )提供病毒和作為病毒感染靶細(xì)胞的培養(yǎng)于固相培養(yǎng)載體(例 如細(xì)胞培養(yǎng)皿、細(xì)胞培養(yǎng)板等，優(yōu)選多孔細(xì)胞培養(yǎng)板，更優(yōu)選96孔細(xì) 胞培養(yǎng)板)上的細(xì)胞；所述細(xì)胞一般為動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞， 其能在病毒感染后表達(dá)病毒的蛋白；所述病毒根據(jù)待檢測(cè)的病毒中和 抗體所屬的病毒型別來(lái)選擇， 一般是待檢病毒中和抗體所針對(duì)的病毒；
(b) 將待檢樣品與步驟(a)中所述的病毒接觸，使得樣品中可 能存在的病毒中和抗體與病毒結(jié)合，以致能夠阻止病毒對(duì)步驟(a)中 所述的靶細(xì)胞的感染；其中該接觸在允許樣品中的中和抗體與病毒結(jié)
合的條件下進(jìn)行，
(c) 使步驟(b)的產(chǎn)物(樣品與病毒的混合液)與步驟(a) 中所述的培養(yǎng)于固相培養(yǎng)載體上的靶細(xì)胞接觸，該接觸在允許細(xì)胞正 常生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行；之后任選地進(jìn)行洗滌；
(d) 用固定液固定步驟(c)所獲得的細(xì)胞，固定條件應(yīng)使細(xì)胞 保持原有的形態(tài)；固定液可為多聚甲醛和/或戊二醛等，優(yōu)選0.2%戊 二醛；之后任選地進(jìn)行洗滌；
(e) 用通透液透化處理步驟(d)所獲得的細(xì)胞，以便加強(qiáng)細(xì)胞 膜的通透性，使得以下操作中所加入的抗體能夠進(jìn)入細(xì)胞；所述通透 液優(yōu)選1% Triton X-100;之后優(yōu)選地(使用例如PBST)進(jìn)行洗滌；
(f )使步驟(e)所獲得的細(xì)胞和能與病毒或病毒蛋白特異性結(jié) 合的檢測(cè)用病毒抗體接觸，使得可能存在的被病毒吸附和/或感染的細(xì) 胞中的病毒顆?；蛘卟《镜鞍着c檢測(cè)用病毒抗體結(jié)合；檢測(cè)用病毒抗 體可以帶有標(biāo)記(優(yōu)選酶)或者不帶有標(biāo)記；之后優(yōu)選地(使用例如
17PBST )進(jìn)行洗滌；
(g)檢測(cè)步驟(f )獲得的細(xì)胞中可能存在的、特異性結(jié)合的檢 測(cè)用病毒抗體，或者檢測(cè)步驟(f )獲得的細(xì)胞中可能存在的、包含特 異性結(jié)合的檢測(cè)用病毒抗體的細(xì)胞或其數(shù)量。所述檢測(cè)優(yōu)選通過(guò)斑點(diǎn) 檢測(cè)儀器(如Elispot)來(lái)進(jìn)行。更優(yōu)選的是，所述檢測(cè)包括通過(guò) 應(yīng)用斑點(diǎn)檢測(cè)儀器，檢測(cè)步驟(f )獲得的細(xì)胞中帶有由特異性結(jié)合的 檢測(cè)用病毒抗體直接或者間接產(chǎn)生的信號(hào)的細(xì)胞，來(lái)檢測(cè)被感染細(xì)胞 的數(shù)量。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述檢測(cè)用病毒抗體是酶標(biāo)記的。在該 實(shí)施方案中，優(yōu)選地，步驟(g)中所述的檢測(cè)包括將步驟(f)獲 得的細(xì)胞和酶的底物接觸，由此直接或者間接產(chǎn)生可被優(yōu)選斑點(diǎn)檢測(cè) 儀器檢測(cè)的信號(hào)，并優(yōu)選通過(guò)斑點(diǎn)檢測(cè)儀器檢測(cè)存在該信號(hào)的細(xì)胞或 其數(shù)量。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述檢測(cè)用病毒抗體是未標(biāo)記的。在 該實(shí)施方案中，優(yōu)選地，步驟(g)中所述的檢測(cè)包括將步驟(f) 獲得的細(xì)胞和帶有標(biāo)記(優(yōu)選酶標(biāo)記的)的第二抗體在允許第二抗體 和檢測(cè)用病毒抗體特異結(jié)合的條件下接觸，并檢測(cè)獲得的細(xì)胞中可能 存在的、特異性結(jié)合的第二抗體，或者可能存在的、包含特異性結(jié)合 的第二抗體的細(xì)胞或其數(shù)量。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述第二抗體是酶標(biāo)記的。在該實(shí)施方 案中，優(yōu)選地，特異性結(jié)合的第二抗體或者包含特異性結(jié)合的第二抗 體的細(xì)胞的檢測(cè)包括將獲得的細(xì)胞和酶的底物接觸，由此直接或者 間接產(chǎn)生可被優(yōu)選斑點(diǎn)檢測(cè)儀器檢測(cè)的信號(hào)，并優(yōu)選通過(guò)斑點(diǎn)檢測(cè)儀 器檢測(cè)存在該信號(hào)的細(xì)胞或其數(shù)量。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明方法所用的檢測(cè)用病毒抗體或者 第二抗體是酶標(biāo)記的。在該實(shí)施方案中，優(yōu)選地，與靶細(xì)胞中病毒或
者病毒蛋白特異性結(jié)合的檢測(cè)用病毒抗體或者包含特異性結(jié)合的檢測(cè) 用病毒抗體的細(xì)胞，或者與檢測(cè)用病毒抗體特異性結(jié)合的第二抗體或
者包含特異性結(jié)合的第二抗體的細(xì)胞，通過(guò)如下方法來(lái)檢測(cè)使所述酶與該酶的底物接觸，發(fā)生酶促顏色反應(yīng)，由此產(chǎn)生顏色，并優(yōu)選應(yīng) 用斑點(diǎn)檢測(cè)儀器確定帶有該顏色的細(xì)胞的數(shù)量。細(xì)胞是否被病毒感染 的判斷標(biāo)準(zhǔn)是細(xì)胞是否帶有該顏色。而且，優(yōu)選地，本發(fā)明方法還進(jìn)
一步包括通過(guò)測(cè)算帶有顏色的細(xì)胞的數(shù)量來(lái)確定被病毒感染的細(xì)胞 的數(shù)量。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述檢測(cè)用病毒抗體或者第二抗體所帶 的標(biāo)記是酶、熒光物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、同位素、或稀土元素。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種病毒如腸道病毒中和抗
體檢測(cè)方法，該方法包括以下步驟
a) 將細(xì)胞培養(yǎng)于固相培養(yǎng)載體(例如細(xì)胞培養(yǎng)皿、細(xì)胞培養(yǎng) 板等，優(yōu)選細(xì)胞培養(yǎng)板，更優(yōu)選96孔細(xì)胞培養(yǎng)板)上，作 為腸道病毒感染的靶細(xì)胞，所述細(xì)胞為動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選哺 乳動(dòng)物細(xì)胞，其可在腸道病毒感染后表達(dá)腸道病毒的蛋白；
b) 根據(jù)所需要檢測(cè)的腸道病毒中和抗體的腸道病毒型別，準(zhǔn) 備需要的腸道病毒；
c) 將待檢測(cè)樣品與步驟b)中所述的腸道病毒接觸，使得其中 的腸道病毒中和抗體，如果存在的話，與腸道病毒結(jié)合， 從而阻止腸道病毒對(duì)步驟a)中所述的靶細(xì)胞的感染。該接 觸在允許中和抗體與腸道病毒結(jié)合的條件下進(jìn)行，如37X: 放置1小時(shí)；
d) 使步驟c)的產(chǎn)物(樣品與腸道病毒的混合液)與步驟a) 中所述的乾細(xì)胞接觸，該接觸條件在允許細(xì)胞的正常生長(zhǎng) 的條件下進(jìn)行，如37X:, C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14小時(shí)；
e) 應(yīng)用斑點(diǎn)檢測(cè)儀器(如Elispot)檢測(cè)帶有特定信號(hào)(例如 顏色)的細(xì)胞，來(lái)檢測(cè)被感染細(xì)胞的數(shù)量，其包括以下步
i.固定液處理步驟d)的待檢測(cè)細(xì)胞，固定液可為多聚曱醛， 和/或戊二醛等，固定條件應(yīng)使細(xì)胞在以下操作中保持原 有的形態(tài)，并保護(hù)病毒顆粒的蛋白構(gòu)象不被破壞，優(yōu)選0. 2%戊二醛;
通透液處理步驟i)中的待檢測(cè)細(xì)胞，通透條件應(yīng)加強(qiáng)細(xì) 胞膜的通透性，使得以下操作中的所加入的抗體可以進(jìn) 入細(xì)胞，優(yōu)選iy。Triton X-100;
提供帶有標(biāo)記(優(yōu)選酶)的可以與腸道病毒特異性結(jié)合的 第一抗體；或者可以與腸道病毒特異性結(jié)合的第一抗體 和可以與第一抗體結(jié)合的帶有標(biāo)記(優(yōu)選酶)的第二抗 體(例如GAM-HRP)。優(yōu)選帶有標(biāo)記優(yōu)選酶的腸道病毒 特異性抗體；
使步驟ii)的待檢測(cè)細(xì)胞與帶有標(biāo)記的腸道病毒特異性 抗體/腸道病毒特異性抗體接觸，使得被病毒吸附、感染 的細(xì)胞上的病毒顆粒捕獲帶有標(biāo)記的腸道病毒特異性抗 體/腸道病毒特異性抗體，形成腸道病毒-帶有標(biāo)記的第 一抗體/腸道病毒-第一抗體結(jié)合物。待檢測(cè)細(xì)胞與帶有 標(biāo)記的第一抗體/第一抗體的接觸在允許其形成結(jié)合物 的條件下進(jìn)行，如37X:放置1小時(shí)；
若被結(jié)合的為腸道病毒特異性抗體(未標(biāo)記的)，則將步 驟iv)中的腸道病毒-第一抗體結(jié)合物與帶有標(biāo)記的第 二抗體接觸，使形成腸道病毒-第一抗體-帶有標(biāo)記的第 二抗體結(jié)合物，該接觸在允許腸道病毒-笫一抗體和帶有 標(biāo)記的第二抗體形成結(jié)合物的條件下進(jìn)行，如37C放置 0. 5小時(shí);
檢測(cè)被結(jié)合的帶有標(biāo)記的腸道病毒特異性抗體或者帶有 標(biāo)記的第二抗體或其量，優(yōu)選包括如下步驟通過(guò)顯色 液(如TMB顯色液)使標(biāo)記(優(yōu)選酶例如HRP)(直接 或間接)產(chǎn)生能夠被斑點(diǎn)檢測(cè)儀器識(shí)別及檢測(cè)的信號(hào)例 如顏色信號(hào)。細(xì)胞是否被病毒感染的判斷標(biāo)準(zhǔn)是細(xì)胞是 否有由標(biāo)記產(chǎn)生的信號(hào)。通過(guò)測(cè)算產(chǎn)生信號(hào)的細(xì)胞的數(shù) 量來(lái)判斷被病毒感染的細(xì)胞的數(shù)量；
V
V
V
20vii.應(yīng)用斑點(diǎn)檢測(cè)儀器(如Elispot)，通過(guò)檢測(cè)帶有由標(biāo)記 (優(yōu)選酶例如HRP)直接或間接產(chǎn)生的信號(hào)優(yōu)選顏色信 號(hào)的細(xì)胞，檢測(cè)被感染細(xì)胞的數(shù)量。細(xì)胞是否被病毒感 染的判斷標(biāo)準(zhǔn)是細(xì)胞是否有由標(biāo)記產(chǎn)生的信號(hào)。通過(guò)測(cè) 算產(chǎn)生信號(hào)的細(xì)胞的數(shù)量來(lái)判斷被病毒感染的細(xì)胞的數(shù) 量。
f)根據(jù)步驟e)所得的結(jié)果測(cè)算樣品中是否含有腸道病毒中和 抗體和/或其效價(jià)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，a)中所述的細(xì)胞在被b)中所述的腸道 病毒感染后，通過(guò)酶聯(lián)免疫反應(yīng)可以使酶直接產(chǎn)生或間接(例如通過(guò) 顯色反應(yīng))產(chǎn)生能夠被斑點(diǎn)檢測(cè)儀器檢測(cè)的信號(hào)。
步驟a)中所述的細(xì)胞為動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞。該細(xì)胞 可以被腸道病毒感染，并表達(dá)腸道病毒蛋白。
步驟e)應(yīng)用斑點(diǎn)檢測(cè)儀器(如Elispot )檢測(cè)被病毒感染的細(xì)胞 的數(shù)量通過(guò)如下方法進(jìn)行細(xì)胞被如腸道病毒感染后，通過(guò)酶聯(lián)免疫 斑點(diǎn)法使腸道病毒與標(biāo)記(如帶有標(biāo)記的抗體)結(jié)合，標(biāo)記通過(guò)直接 反應(yīng)或間接反應(yīng)(如顯色反應(yīng))產(chǎn)生可以被斑點(diǎn)檢測(cè)儀器所識(shí)別并檢 測(cè)的信號(hào)。細(xì)胞是否被感染的判定標(biāo)準(zhǔn)是細(xì)胞是否具有由標(biāo)記產(chǎn)生的 信號(hào)；檢測(cè)具有由標(biāo)記產(chǎn)生的信號(hào)的細(xì)胞的數(shù)量。
本發(fā)明的方法中，標(biāo)記產(chǎn)生的信號(hào)可為顏色信號(hào)，可使細(xì)胞產(chǎn)生 與正常細(xì)胞不同的顏色，該顏色信號(hào)可被斑點(diǎn)檢測(cè)儀器(如Elispot) 所檢測(cè)。
本發(fā)明的方法中，標(biāo)記可以是任何能夠使細(xì)胞產(chǎn)生可被斑點(diǎn)檢測(cè) 儀器(如Elispot)檢測(cè)的信號(hào)的物質(zhì)，例如可以是酶、蛋白質(zhì)、化 學(xué)發(fā)光物質(zhì)、同位素、或稀土元素。
在本發(fā)明所述的方法的一個(gè)具體實(shí)施方案中，涉及了對(duì)病毒例如 腸道病毒的效價(jià)進(jìn)行鑒定的方法。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明還 涉及應(yīng)用本發(fā)明的腸道病毒中和抗體檢測(cè)方法篩選腸道病毒中和性 單克隆抗體的方法。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及應(yīng)用本發(fā)明的腸道病毒中和抗體檢測(cè)方法檢測(cè)腸道病毒中和抗體效價(jià)的方法。本發(fā)明的腸道病毒中和抗體檢測(cè)方法可用于制備腸道病毒中和抗體診斷試劑盒。
本發(fā)明還提供篩選病毒例如人腸道病毒中和性單克隆抗體的方
法，該方法包括根據(jù)本發(fā)明檢測(cè)病毒中和抗體的方法，檢測(cè)候選抗體是否是病毒中和抗體。
本發(fā)明還提供檢測(cè)病毒中和抗體效價(jià)的方法，包括根據(jù)本發(fā)明的病毒中和抗體檢測(cè)方法，確定病毒中和抗體效價(jià)。
本發(fā)明還提供確定病毒疫苗的有效性或效價(jià)的方法，包括根據(jù)本發(fā)明檢測(cè)病毒中和抗體的方法，確定所述疫苗免疫動(dòng)物后獲得的抗血清或者抗體中病毒中和抗體存在與否或其效價(jià)。
本發(fā)明還提供診斷患者是否感染病毒的方法，包括根據(jù)本發(fā)明的病毒中和抗體檢測(cè)方法，確定來(lái)自患者的樣品例如血清中病毒中和
抗體存在與否或其效價(jià)。
本發(fā)明還提供診斷患者是否患有所述病毒感染引起的疾病(例如手足口病)的方法，包括根據(jù)本發(fā)明的病毒中和抗體檢測(cè)方法，測(cè)
定來(lái)自患者的樣品例如血清中病毒中和抗體存在與否或其效價(jià)。
另一方面，本發(fā)明提供試劑盒，所述試劑盒優(yōu)選可以用于以下任
何一種或者多種用途可以用于檢測(cè)被病毒感染的細(xì)胞，或者可以用于檢測(cè)樣品中的病毒(例如人腸道病毒，例如腸道病毒EVn)中和抗體或其效價(jià)，可以用于篩選病毒例如人腸道病毒中和性單克隆抗體，可以用于確定病毒疫苗的有效性或效價(jià)，或者可以用于診斷患者是否感染病毒，或者可以用于診斷患者是否患有病毒感染引起的疾病(例如手足口病)，例如可以用于實(shí)施任何本發(fā)明檢測(cè)被病毒感染的細(xì)胞的方法或者檢測(cè)病毒中和抗體的方法，或者實(shí)施任何本發(fā)明的其它方法。所述試劑盒包含下列項(xiàng)目中的任何一種或多種
(1) 能與病毒或病毒蛋白特異性結(jié)合的檢測(cè)用病毒抗體，其可以是標(biāo)記的或者未標(biāo)記的，例如酶標(biāo)記的，
(2) 第二抗體，是能夠與抗體如檢測(cè)用病毒抗體特異結(jié)合的抗
22體，可以是標(biāo)記的或者未標(biāo)記的，例如是酶標(biāo)記的，
(3) 病毒，所述病毒一般根據(jù)待檢測(cè)的病毒中和抗體所屬的病毒型別來(lái)選擇，優(yōu)選是待檢病毒中和抗體所針對(duì)的病毒；
(4) 病毒中和抗體標(biāo)準(zhǔn)品，和/或
(5) 細(xì)胞，作為病毒感染靶細(xì)胞。所述細(xì)胞優(yōu)選培養(yǎng)于固相培養(yǎng)栽體(例如細(xì)胞培養(yǎng)皿、細(xì)胞培養(yǎng)板等，優(yōu)選多孔細(xì)胞培養(yǎng)板，更優(yōu)選96孔細(xì)胞培養(yǎng)板)上。所述細(xì)胞一般為動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞。所述細(xì)胞優(yōu)選能在病毒感染后表達(dá)病毒的蛋白。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒包含項(xiàng)目(1) ， (2) ， (3) ， (4)和(5);或者，項(xiàng)目(l), (3), (4)和(5)和任選的(2);或者，項(xiàng)目(l), (4)和(5)和任選的(2 );或者，項(xiàng)目(l)， (3)和(5)和任選的(2);或者，項(xiàng)目(l)， (3)和(4)和任選的(2);或者，項(xiàng)目(3)， (4)和(5)和任選的(2);或者，項(xiàng)目(1)和(3 )和任選的(2 );項(xiàng)目(1)和(4 )和任選的(2 );項(xiàng)目(1 )和(5 )和任選的(2 );項(xiàng)目(3 )和(4 )和任選的(2 );項(xiàng)目(3 )和(5 )和任選的(2 );項(xiàng)目(4 )和(5 )和任選的(2 )，項(xiàng)目(l)， (2)， (3)， (4)和(5)定義同上文在試劑盒中的定義。
上述試劑盒任選地還可以包含用于固定細(xì)胞的固定液；和/或，用于使細(xì)胞通透性增加的通透液。
優(yōu)選地，檢測(cè)用病毒抗體或者第二抗體是標(biāo)記的，所述試劑盒優(yōu)選還包含^吏標(biāo)記顯色的試劑。
優(yōu)選地，檢測(cè)用病毒抗體或者第二抗體是酶標(biāo)記的，所述試劑盒優(yōu)選還包含酶的底物，或者酶的顯色試劑，如顯色液。
者者者者者在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述試劑盒包含
(1) 能與病毒或病毒蛋白特異性結(jié)合的檢測(cè)用病毒抗體。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述檢測(cè)用病毒抗體是標(biāo)記的，例如酶
標(biāo)記的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述檢測(cè)用病毒抗體是未標(biāo)記的，所述試劑盒優(yōu)選還包含
(2) 第二抗體，其是能夠與抗體如檢測(cè)用病毒抗體特異結(jié)合的抗體，該抗體是標(biāo)記的，例如是酶標(biāo)記的。
本發(fā)明還提供斑點(diǎn)檢測(cè)儀器或斑點(diǎn)檢測(cè)法或本發(fā)明感染細(xì)胞或抗體檢測(cè)方法在檢測(cè)腸道病毒中和抗體中的用途、在篩選腸道病毒中和性單克隆抗體中的用途、在檢測(cè)腸道病毒中和抗體效價(jià)中的用途、在制備腸道病毒中和抗體診斷試劑盒中的用途、在腸道病毒疫苗開(kāi)發(fā)和質(zhì)控中的用途、在篩選或制備抗腸道病毒或其相關(guān)疾病藥物中的用途、或在治療腸道病毒感染中的用途。
在本發(fā)明任何方面，本發(fā)明所述病毒中和抗體的檢測(cè)包括檢測(cè)所述抗體的存在和/或效價(jià)。
在本發(fā)明任何方面，本發(fā)明所述的檢測(cè)用病毒抗體優(yōu)選是特異結(jié)合病毒或者病毒蛋白(特別是病毒表面蛋白)的抗體，優(yōu)選是單克隆抗體，也優(yōu)選是在病毒感染靶細(xì)胞后在靶細(xì)胞中表達(dá)的病毒蛋白的特異性抗體。所述檢測(cè)用病毒抗體可以帶有標(biāo)記的或者未帶有標(biāo)記的，優(yōu)選是酶標(biāo)記的。所述檢測(cè)用病毒抗體可以通過(guò)所帶有的標(biāo)記或者通過(guò)與它特異結(jié)合的第二抗體所帶有的標(biāo)記來(lái)檢測(cè)。該標(biāo)記可以是例如
酶、熒光物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、同位素、或稀土元素。所迷檢測(cè)用病毒抗體或者第二抗體所帶有的標(biāo)記能夠直接產(chǎn)生或間接產(chǎn)生能夠被斑點(diǎn)檢測(cè)儀器檢測(cè)的信號(hào)。優(yōu)選地，本發(fā)明方法還進(jìn)一步包括通過(guò)測(cè)算帶有所述信號(hào)的細(xì)胞的數(shù)量來(lái)確定被病毒感染的細(xì)胞的數(shù)量。
在本發(fā)明任何方面，所述的第二抗體是能夠與抗體例如檢測(cè)用病毒抗體特異結(jié)合的抗體，該抗體是未標(biāo)記的或者標(biāo)記的，例如是酶標(biāo)記的。第二抗體可以采用本領(lǐng)域的任何技術(shù)制備，也可以使用市售的
24產(chǎn)品o
在本發(fā)明任何方面，待檢病毒中和抗體可以是針對(duì)任何病毒的中
和抗體。優(yōu)選的，待檢病毒中和抗體是腸道病毒中和抗體，特別是EV71中和抗體，也可以是其他腸道病毒的中和抗體，所述腸道病毒的例子是CA16，CB3，CA6，或CA4等。
在本發(fā)明任何方面，本發(fā)明所用的病毒一般根據(jù)待檢測(cè)的病毒中和抗體所屬的病毒型別來(lái)選擇，優(yōu)選地是待檢病毒中和抗體所針對(duì)的
病毒。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述病毒是腸道病毒，特別是EV71
病毒，也可以是其他腸道病毒，例如CA16，CB3，CA6，或CA4等。
在本發(fā)明任何方面，用作病毒感染的靶細(xì)胞的細(xì)胞一般為動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞。所述優(yōu)選能在病毒感染后表達(dá)病毒的蛋白。通常是培養(yǎng)細(xì)胞或者是細(xì)胞系。
在本發(fā)明任何方面，本發(fā)明待檢的樣品可以是但不限于任何如下一種或者多種的組合疫苗或者候選疫苗免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或者人之后獲得的抗血清、體外培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體樣品、或者從待檢個(gè)體分離的生物學(xué)樣品(如血清)，如懷疑攜帶病毒的患者的血清，候選的病毒中和抗體，或者是來(lái)自組織培養(yǎng)的生物學(xué)樣品，或者，所述樣品不是從有生命的人體或者動(dòng)物體獲得的樣品。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的任何方法都不是專利法意義上的診斷方法。
下面結(jié)合具體實(shí)施例與所附圖表，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步加以描述。所述實(shí)施例旨在以舉例方式具體闡明本發(fā)明。試劑、試劑的濃度、溫度和其他變量的值以及載體和細(xì)胞的選擇只是舉例說(shuō)明本發(fā)明的應(yīng)用，而不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例
一.本發(fā)明涉及的腸道病毒的培養(yǎng)和鑒定實(shí)施例1.腸道病毒的培養(yǎng)
本實(shí)施例中作為示例的腸道病毒林為JS06-52-3 (國(guó)家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心保存)，通過(guò)RT-PCR得到接近全長(zhǎng)的7312bp的序列(Genbank No: FJ600325 )，屬EV71 C4亞型，與EU703814病毒林的核苷酸序列同源性為97.7%，氨基酸序列同源性為97. 6%。也可以使用其它腸道病毒。
本發(fā)明通過(guò)感染細(xì)胞的方式在RD細(xì)胞(ATCC， CCL-136 ) ( ATCC即是供應(yīng)商)中生產(chǎn)EV71病毒。
實(shí)驗(yàn)方法
將RD細(xì)胞培養(yǎng)于10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基為MEM培養(yǎng)基(添加100/oFBS， 2mML-glutamine， 0. lmM MEM Non-Essential Amino Acids及1% penicillin-streptomycin),匯合率約為80%。
10小時(shí)后每皿細(xì)胞進(jìn)行換液，換成無(wú)血清MEM培養(yǎng)基(添加2mML-gluUmine ， 0. lniM MBM Non-Essential Amino Acids 及 1%penicillin-streptomycin ) 。 EV71病毒感染RD細(xì)胞，每皿感染的病毒用量為1000TCID5。。
感染48小時(shí)后，收集細(xì)胞及上清，液氮反復(fù)凍融三次裂解細(xì)胞，后4"C， 5000rpm， 30min離心去除細(xì)胞碎片。上清分裝成200 ja L—份，-801C保存。
實(shí)施例2.腸道病毒感染細(xì)胞
將收獲的腸道病毒感染RD細(xì)胞，檢測(cè)其對(duì)RD細(xì)胞的感染。本實(shí)施例中以EV71病毒的感染作為示例，也可以包括檢測(cè)其他腸道病毒的感染。
實(shí)驗(yàn)方法
RD細(xì)胞培養(yǎng)于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，約2 x 10V孔，培養(yǎng)基為MEM培養(yǎng)基(添力口 10%FBS， 2mML-glutamine, 0. lmM MEM Non-Essent ialAmino Acids及1% penici 11 in-streptomycin )，匯合率約為80%。培養(yǎng)10h后每孔分別加入50 jiL梯度稀釋的EVn病毒(分別稀釋0，10， 100, 1000, 10000倍)。繼續(xù)培養(yǎng)14小時(shí)后，吸去各孔中的培養(yǎng)基，每孔中加入100 p L固定液(含有0. 2%戊二醛的PBS溶液)，室溫避光靜置lh; lh后吸去固定液，每孔中加入lOOyL l°/。Triton X-100溶液通透細(xì)胞，室溫靜置O. 5h; 0.5h后吸去通透液，每孔中 加入 PBST 溶液(PBST :8g/L NaCl，0. 2g/L KC1，1. 44g/L Na2HP04， 0, 24g/L KH2P04， 2ml/L Tween-20，調(diào)pH至7. 2)洗細(xì)胞三次， 再將PBST溶液吸棄；在每個(gè)孔中加入100 ja L酶標(biāo)記的EV71單克隆 抗體H5D6-HRP，酶標(biāo)抗體H5D6-HRP ( 1. 9mg/mL )用酶稀(1 xPB， 0. l%casein， 5°/。蔗糖，0. 1°/。氨基比林，0. 5%Tween-20， 1°/。BSA， 0. 15M 氯化鈉，10°/。甘露醇)稀釋10000倍使用，放置于37C中反應(yīng)lh; lh后吸去反應(yīng)液，每孔中加入PBST溶液洗細(xì)胞三次，再將PBST溶 液吸棄；在每個(gè)孔中加入100 ja L顯色液(3， 3 ' ，5,5' 一Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for Membranes, sigma， T0565 )，放置在中顯色15min， 15min后吸 棄板中的顯色液終止顯色。實(shí)驗(yàn)對(duì)照為未進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)的RD細(xì)胞。
將顯色反應(yīng)后的細(xì)胞置于倒置顯微鏡在可見(jiàn)光條件下進(jìn)行觀察， 結(jié)果如圖1所示，EV71病毒感染后的RD細(xì)胞可顯示出明顯區(qū)別于未 凈皮病毒感染的細(xì)胞的顏色。
本實(shí)施例中EV71單克隆抗體H5D6制備方法將滅活的EV71病 毒免疫Balb/c小鼠，初免(劑量為100pg/只)與等量福氏完全佐 劑混合，加強(qiáng)免疫(劑量為50pg/只)則與等量福氏不完全佐劑混 合，進(jìn)行肌肉注射，初免后分別于4、 8周各加強(qiáng)一次。加強(qiáng)免疫3 次后進(jìn)行單克隆抗體的篩選和制備，細(xì)胞融合、克隆化、腹水制備及 純化參見(jiàn)單克隆抗體的常規(guī)方法(Harlow E等，抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)， 1998年，139-312頁(yè))；HRP標(biāo)記的H5D6-HRP制備方法HRP 40mg 加入0. 2M pH5. 6醋酸鹽緩沖液2ml，溶解后加入0. 06M化104溶液 2ml，室溫反應(yīng)20分鐘；加入0. 16M乙二醇-10。/4NaCl溶液2ml，室 溫反應(yīng)20分鐘，將酶液裝入透析袋中，對(duì)0. 001M pH4. 0醋酸鹽緩 沖液透析過(guò)夜；加入2MpH9. 6碳酸鹽緩沖溶液0. 8ml，加入H5D6單 抗20mg， 41C攪拌反應(yīng)2小時(shí)；加入新配制的NaBH4溶液(5mg/ml ) 0.4ml, 4"C攪拌反應(yīng)2小時(shí)；滴加飽和(NlU2304溶液9. 2mL; 4匸攪拌反應(yīng)30分鐘，4*0 3500rpm離心20分鐘；棄上清，將沉淀溶于 2ml 0. 02M pH7. 4的磷酸鹽緩沖液中，用0. 02M pH7. 4的磷酸鹽緩沖 液透析24小時(shí)，加2ml甘油，混勻后-20X:保存。
實(shí)施例3.應(yīng)用斑點(diǎn)檢測(cè)儀器Elispot檢測(cè)腸道病毒對(duì)細(xì)胞的感染
本發(fā)明中以EV71病毒為示例，將EV71病毒感染RD細(xì)胞，感染 后通過(guò)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法檢測(cè)可以使被病毒感染的細(xì)胞產(chǎn)生區(qū)別于未 被感染的細(xì)胞的信號(hào)。這種信號(hào)在可見(jiàn)光下即可被觀察，可以不需要 特殊光源(如激光、限定波長(zhǎng)范圍的汞燈光源等)的激發(fā)，適合于用 斑點(diǎn)檢測(cè)儀器Elispot進(jìn)行檢測(cè)。目前，傳統(tǒng)的TCIDs。方法是對(duì)病變 的細(xì)胞主要是進(jìn)行肉眼觀察，費(fèi)力耗時(shí)，不適于進(jìn)行高通量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)； 且缺乏客觀性，存在一定的主觀誤差，容易影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性。 應(yīng)用斑點(diǎn)檢測(cè)儀器Elispot進(jìn)行檢測(cè)，具有靈酶度高、特別是能夠 進(jìn)行連續(xù)自動(dòng)的快速掃描檢測(cè)，短時(shí)間內(nèi)即可獲得大量樣品的檢測(cè)結(jié) 果，可滿足高通量檢測(cè)的要求。
斑點(diǎn)檢測(cè)儀器(如Elispot)是目前細(xì)胞免疫研究最常用的檢測(cè) 儀器之一，其檢測(cè)原理是通過(guò)高靈敏度的攝像頭采集樣品板(可以是 細(xì)胞培養(yǎng)板、專用顯色板、顯色用膜等)上的細(xì)胞顯色圖像，通過(guò)軟 件分析測(cè)算顯色細(xì)胞的數(shù)量或空斑數(shù)量，具有很好的精確度和靈敏 度，其靈敏度可以分辨出顯色的單細(xì)胞。Elispot的檢測(cè)自動(dòng)化水平 高，可適用于包括96孔細(xì)胞培養(yǎng)板在內(nèi)的多種常用的細(xì)胞培養(yǎng)容器， 可進(jìn)行全板范圍的快速連續(xù)自動(dòng)掃描檢測(cè)。目前，尚未有將Elispot 應(yīng)用于腸道病毒中和抗體檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的報(bào)道。
本發(fā)明應(yīng)用斑點(diǎn)檢測(cè)儀器El ispot對(duì)EV71病毒感染并進(jìn)行顯色 后的RD細(xì)胞進(jìn)行了檢測(cè)。
實(shí)驗(yàn)方法
RD細(xì)胞培養(yǎng)于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，約2 x IOV孔，培養(yǎng)基為MEM 培養(yǎng)基(添加10%FBS, 2mM L-glutamine, 0. ImM MEM Non-Essential Amino Acids及1% penicillin—streptomycin )，匯合率約為80%。培養(yǎng)10h后每孔分別加入50jaL梯度稀釋的EV71病毒(分別稀釋0， 10， 100， 1000， IOOOO倍)。繼續(xù)培養(yǎng)14小時(shí)后，吸去各孔中的培 養(yǎng)基，每孔中加入100iLiL固定液(含有O. 2。/。戊二醛的PBS溶液)， 室溫避光靜置lh; lh后吸去固定液，每孔中加入lOOyL l%Triton X-100溶液通透細(xì)胞，室溫靜置O. 5h; 0. 5h后吸去通透液，每孔中 加入PBST溶液洗細(xì)胞三次，再將PBST溶液吸棄；在每個(gè)孔中加入 100 juL酶標(biāo)記的EV71單克隆抗體H5D6-HRP，酶標(biāo)抗體H5D6-HRP (1.9mg/mL)用酶稀(lxPB， 0. l%casein， 5%蔗糖,0. 1°/。氨基比林， 0. 5%Tween-20， 1%BSA， 0. 15M氯化鈉，10°/。甘露醇)稀釋10000倍 使用，放置于37C中反應(yīng)lh; lh后吸去反應(yīng)液，每孔中加入PBST 溶液洗細(xì)胞三次，再將PBST溶液吸棄；在每個(gè)孔中加入100jiL顯 色液(3，3' ，5,5' -Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for Membranes, sigma, T0565 )，放置在中顯色15min， 15min后吸棄板中的顯色液終止顯色。實(shí)驗(yàn)對(duì)照為未進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)的 RD細(xì)胞。啟動(dòng)斑點(diǎn)檢測(cè)儀器Elispot (型號(hào)Series3B),將進(jìn)行 顯色反應(yīng)后的細(xì)胞培養(yǎng)板放在儀器的取樣板上，用儀器檢測(cè)每個(gè)孔中 的顯色細(xì)胞數(shù)即被感染細(xì)胞數(shù)。Elispot的詳細(xì)操作步驟見(jiàn)該儀器的 操作說(shuō)明書(shū)。實(shí)驗(yàn)對(duì)照為未進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)的RD細(xì)胞。
通過(guò)自動(dòng)連續(xù)掃描檢測(cè)，可迅速獲得所檢測(cè)細(xì)胞板上各個(gè)孔的顯 色細(xì)胞數(shù)量即被感染細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果如圖2所示。各個(gè)孔中顯色細(xì)胞 數(shù)量即被EV71病毒感染的細(xì)胞數(shù)量標(biāo)于各孔圖像的左上方，未進(jìn)行 感染實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞孔未檢測(cè)到顯色細(xì)胞。這說(shuō)明了本發(fā)明的設(shè)計(jì)思路的 可行性，被EV71病毒感染后的細(xì)胞可產(chǎn)生能夠被斑點(diǎn)檢測(cè)儀器 Elispot識(shí)別的標(biāo)記信號(hào)，同時(shí)使整個(gè)檢測(cè)過(guò)程十分的迅速。
實(shí)施例4.腸道病毒感染效價(jià)的測(cè)定
根據(jù)病毒效價(jià)空斑測(cè)定法的原理，在稀釋度足夠的情況下，腸道 病毒感染細(xì)胞后通過(guò)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法可以使被感染細(xì)胞帶有能夠被 Elispot檢測(cè)的信號(hào)，帶有信號(hào)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)即被感染細(xì)胞數(shù)可以認(rèn)
29為是在該次感染實(shí)驗(yàn)中使用了多少感染單位的腸道病毒。我們以梯度 稀釋斑點(diǎn)計(jì)數(shù)方法檢測(cè)所構(gòu)建的腸道病毒的效價(jià)。本實(shí)施例中我們以
EV71病毒的效價(jià)作為示例，也可以包括檢測(cè)其他腸道病毒的效價(jià)。
效價(jià)測(cè)定方法將RD細(xì)胞鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，2xl(r個(gè)/ 孔，培養(yǎng)基為MEM培養(yǎng)基，37"C培養(yǎng)10小時(shí)。取EV71病毒原液一 份，用無(wú)血清MEM培養(yǎng)基10倍連續(xù)稀釋4個(gè)梯度，最終使每100jLiL 培養(yǎng)基中分別含有100|iL、 10jiL、 1jjL、 0. lpL、 0. 01pL5個(gè)濃 度梯度的病毒稀釋液。將各梯度的病毒稀釋液取50 pL加入預(yù)鋪于 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的RD細(xì)胞中，每個(gè)梯度采取4孔重復(fù)。將96孑L 板放入37X:培養(yǎng)。培養(yǎng)14小時(shí)后，吸去各孔中的培養(yǎng)基，每孔中加 入100 pL固定液(含有0. 2%戊二醛的PBS溶液)，室溫避光靜置 lh; lh后吸去固定液，每孔中加入IOO(JL 1。/。Triton X-100溶液通透 細(xì)胞，室溫靜置0. 5h; 0. 5h后吸去通透液，每孔中加入PBST溶液 洗細(xì)胞三次，再將PBST溶液吸棄；在每個(gè)孔中加入100nL酶標(biāo)記的 EV71單克隆抗體H5D6-HRP,酶標(biāo)抗體H5D6-HRP ( 1. 9mg/mL )用酶稀 (1 x PB， 0. 1。/。casein， 5%蔗糖，0. 1°/。氨基比林，0. 5%Tween-20, 1%BSA, 0. 15M氯化鈉，10%甘露醇)稀釋10000倍使用，放置于37"C中反應(yīng) lh; lh后吸去反應(yīng)液，每孔中加入PBST溶液洗細(xì)胞三次，再將PBST 溶液吸棄；在每個(gè)孔中加入100 juL顯色液(3， 3' ，5， 5' -Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for Membranes, sigma， T0565 )，放置在37匸中顯色15min, 15min后 吸棄板中的顯色液終止顯色。實(shí)驗(yàn)對(duì)照為未進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)的RD細(xì)胞。 啟動(dòng)斑點(diǎn)檢測(cè)儀器Elispot,將進(jìn)行顯色反應(yīng)后的細(xì)胞培養(yǎng)板放在儀 器的取樣板上，用儀器檢測(cè)每個(gè)孔中的藍(lán)色細(xì)胞數(shù)即被感染細(xì)胞數(shù)。 Elispot的詳細(xì)操作步驟見(jiàn)該儀器的操作說(shuō)明書(shū)。實(shí)驗(yàn)對(duì)照為未進(jìn)行 感染實(shí)驗(yàn)的RD細(xì)胞(陰性孔)。結(jié)果如表1所示，與不同的EV71 病毒原液用量對(duì)應(yīng)的為被感染細(xì)胞的數(shù)量(為4孔平均值)。 EV71病毒效價(jià)計(jì)算方法
感染效價(jià)(IU/mL)-檢測(cè)孔被感染細(xì)胞數(shù)/檢測(cè)孔病毒原液用
30量(mL)。
其中，檢測(cè)孔被感染細(xì)胞數(shù)-檢測(cè)孔平均顯色細(xì)胞數(shù)-陰性孔平均 顯色細(xì)胞數(shù)。其中，上述公式中"檢測(cè)孔被感染細(xì)胞數(shù)"和"檢測(cè)孔 病毒原液用量，，選擇被感染細(xì)胞數(shù)最接近于50且不低于50的檢測(cè)孔 的被感染細(xì)胞數(shù)與其對(duì)應(yīng)的EV71病毒原液的用量。
例如，本實(shí)施例中，EV71病毒效價(jià)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，被感染細(xì)胞數(shù) 最接近于50且不低于50的檢測(cè)孔的被感染細(xì)胞數(shù)為188 (表1 )， 與其對(duì)應(yīng)的EV71病毒原液用量為0. 005mL，代入上述公式即可計(jì)算 獲得該EV71病毒效價(jià)為3. 76 x 104 ( IU/mL )。
表l EV71病毒的感染用量與對(duì)應(yīng)孔被感染細(xì)胞數(shù)的關(guān)系
EV71病毒原液用 量(l(TmL)500. 50. 050. 005
被感染細(xì)胞數(shù)9851882596
實(shí)施例5.與傳統(tǒng)的TCIDs。病毒效價(jià)檢測(cè)方法的對(duì)比
本實(shí)施例中，我們將本發(fā)明的腸道病毒效價(jià)檢測(cè)方法與傳統(tǒng)的腸
道病毒效價(jià)檢測(cè)方法進(jìn)行了對(duì)比實(shí)驗(yàn)。本實(shí)施例中，我們應(yīng)用兩種方
法同時(shí)對(duì)不同的EV71病毒林的效價(jià)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)兩種方法的應(yīng)用效果
進(jìn)行對(duì)比。
實(shí)驗(yàn)方法
(1) 應(yīng)用本發(fā)明的腸道病毒效價(jià)檢測(cè)方法將RD細(xì)胞鋪于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(2xl0V孑L) 。 10小時(shí)后將不同的EV71病毒林用無(wú) 血清MEM進(jìn)行連續(xù)稀釋(以原倍病毒為起點(diǎn)，進(jìn)行10倍比稀釋，稀釋 5個(gè)梯度)，然后各取50 |u L EV71病毒加入預(yù)鋪有RD細(xì)胞的96孔細(xì) 胞培養(yǎng)板中，每個(gè)梯度4孔重復(fù)。培養(yǎng)l4小時(shí)后進(jìn)行酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)反 應(yīng)，吸去各孔中的培養(yǎng)基，每孔中加入100 pL固定液(含有0. 2%戊 二醛的PBS溶液)，室溫避光靜置lh; lh后吸去固定液，每孔中加入 100yL l%Triton X-100溶液通透細(xì)胞，室溫靜置0. 5h; 0. 5h后吸去通透液，每孔中加入PBST溶液洗細(xì)胞三次，再將PBST溶液吸棄；在 每個(gè)孔中加入100 n L酶標(biāo)記的EV71單克隆抗體H5D6-HRP，酶標(biāo)抗體 H5D6-HRP ( 1. 9mg/mL)用酶稀(1 x PB， 0. l%casein， 5%蔗糖，0.1% 氨基比林，0. 5°/。Tween-20， 1%BSA， 0. 15M氯化鈉，10%甘露醇)稀釋 10000倍使用，放置于37t:中反應(yīng)lh; lh后吸去反應(yīng)液，每孔中加入 PBST溶液洗細(xì)胞三次，再將PBST溶液吸棄；在每個(gè)孔中加入100 p L 顯色液(3, 3 ' ，5,5' -Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for Membranes, sigma， T0565 )，放置在37C中 顯色15min， 15min后吸棄板中的顯色液終止顯色。實(shí)驗(yàn)對(duì)照為未進(jìn)行 感染實(shí)驗(yàn)的RD細(xì)胞(稱為陰性孔，4個(gè)孔)。啟動(dòng)斑點(diǎn)檢測(cè)儀器El ispot ， 將進(jìn)行顯色反應(yīng)后的細(xì)胞培養(yǎng)板放在儀器的取樣板上，用儀器檢測(cè)每 個(gè)孔中的藍(lán)色細(xì)胞數(shù)即被感染細(xì)胞數(shù)。EHspot的詳細(xì)操作步驟見(jiàn)該 儀器的操作說(shuō)明書(shū)。實(shí)驗(yàn)對(duì)照為未進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)的RD細(xì)胞(陰性孔)。
啟動(dòng)斑點(diǎn)檢測(cè)儀器Eli spot,將進(jìn)行顯色反應(yīng)后的細(xì)胞培養(yǎng)板放 在取樣板上，檢測(cè)每個(gè)孔中的藍(lán)色細(xì)胞數(shù)即被感染細(xì)胞數(shù)。Elispot 的詳細(xì)操作步驟見(jiàn)該儀器的操作說(shuō)明書(shū)。
病毒效價(jià)判定方法
病毒效價(jià)(IU/mL)-檢測(cè)孔被感染細(xì)胞數(shù)/檢測(cè)孔病毒原液用 量(mL)。
其中，檢測(cè)孔被感染細(xì)胞數(shù)-檢測(cè)孔平均顯色細(xì)胞數(shù)-陰性孔平均 顯色細(xì)胞數(shù)。
其中，上述公式中"檢測(cè)孔被感染細(xì)胞數(shù)"和"檢測(cè)孔病毒原液 用量"選擇被感染細(xì)胞數(shù)最接近于50且不低于50的檢測(cè)孔的被感染 細(xì)胞數(shù)與其對(duì)應(yīng)的EV71病毒原液的用量。
(2) 應(yīng)用傳統(tǒng)的TCIDs。病毒效價(jià)檢測(cè)方法將RD細(xì)胞鋪于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(2xl0V孔)。10小時(shí)后將不同的EV71病毒林用無(wú) 血清MEM進(jìn)行連續(xù)稀釋(以原倍病毒為起點(diǎn)，進(jìn)行10倍比稀釋，稀釋 5個(gè)梯度)，然后各取50|iL EV71病毒加入預(yù)鋪有RD細(xì)胞的96孔細(xì) 胞培養(yǎng)板中，每個(gè)梯度4孔重復(fù)。培養(yǎng)6天，連續(xù)觀察細(xì)胞病變，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞完全病變的孔數(shù)。
病毒效價(jià)判定方法
按Behrens—Kdrber /〉式計(jì)算出分離病毒抹的TCID5。； log TCID5。 - L一d (S -0. 5 )，其中 L =實(shí)驗(yàn)中使用的最低稀釋度的log值； d =稀釋梯度的log值；
S =終判時(shí)陽(yáng)性部分的總和(即出現(xiàn)CPE的細(xì)胞孔所占
的比例之和)。 檢測(cè)結(jié)果
在本實(shí)施例中，我們分別應(yīng)用上述兩種方法分別對(duì)不同的EV71 病毒林的效價(jià)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果如圖3顯示，應(yīng)用本發(fā)明的腸道病毒 效價(jià)檢測(cè)方法獲得的檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)的TCID5。檢測(cè)病毒效價(jià)檢測(cè)方法 的檢測(cè)結(jié)果，具有高度的相關(guān)性。
二.本發(fā)明的腸道病毒中和抗體檢測(cè)方法的建立 實(shí)施例6. —種新的腸道病毒中和抗體檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明應(yīng)用前面所述的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法和斑點(diǎn)檢測(cè)儀器(如 Elispot)建立了一種新的腸道病毒中和抗體檢測(cè)方法。該方法既具
有高效、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)更有利于提高工作效率，更適于進(jìn)行高通 量檢測(cè)。該方法的流程示意簡(jiǎn)圖可見(jiàn)圖4。
方法流程描述
(1) RD鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，2xl(T個(gè)/孔，培養(yǎng)基為DMEM 培養(yǎng)基(添加10%FBS， 2mM L-glutamine， 0. ImM MEM Non-Essential Amino Acids及1% penici 11 in-streptomycin ) ， 37^C培養(yǎng)10h;
(2) 取EV71病毒原液，用無(wú)血清MEM培養(yǎng)基(也可以根據(jù)需要 選擇其它合適的細(xì)胞培養(yǎng)基或緩沖液)進(jìn)行稀釋，稀釋比例根據(jù)如下 方法計(jì)算稀釋后EV71病毒的用量為96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每個(gè)孔加50ji LEV71病毒稀釋液，每孔EV71病毒的用量為100TCID5。，以此用量計(jì) 算EV71病毒原液的稀釋比例；(3 )將待檢測(cè)的樣品(如單克隆抗體樣品、血清樣品、腹水樣品、 細(xì)胞培養(yǎng)上清液樣品、細(xì)胞裂解液樣品等)用無(wú)血清MEM培養(yǎng)基(也 可以根據(jù)需要選擇其它合適的細(xì)胞培養(yǎng)基或緩沖液)進(jìn)行稀釋(可以 根據(jù)需要選擇合適的稀釋倍數(shù))；
注實(shí)驗(yàn)對(duì)照設(shè)置為未進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)的RD細(xì)胞(稱為陰性孔，每 個(gè)96孔板設(shè)置5孔)和只進(jìn)行EV71病毒感染的RD細(xì)胞(稱為陽(yáng)性孔， 每個(gè)96孔板設(shè)置5孔)。
(4) 稀釋后的待檢測(cè)的樣品各取50 yL分別與50jiL稀釋后的 EV71病毒(100 TCID5。)混合，37匸孵育2h;
(5) 將孵育后的樣品-病毒混合液分別加入上述(1)預(yù)鋪有RD 細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37C培養(yǎng)14小時(shí)；
(6) 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)反應(yīng)吸去各孔中的培養(yǎng)基，每孔中加入100 pL固定液(含有0. 2%戊二醛的PBS溶液)，室溫避光靜置lh; lh 后吸去固定液，每孔中加入100pL r/。Triton X-100溶液通透細(xì)胞， 室溫靜置0.5h; 0.5h后吸去通透液，每孔中加入PBST溶液洗細(xì)胞三 次，再將PBST溶液吸棄；在每個(gè)孔中加入100juL酶標(biāo)記的EV71單克 隆抗體H5D6-HRP，酶標(biāo)抗體H5D6-HRP (1. 9mg/mL )用酶稀(1 x PB， 0. l%casein， 5%蔗糖，0. 1%氨基比林，0. 5%Tween-20， 1°/。BSA， 0. 15M 氯化鈉，10%甘露醇)稀釋10000倍使用，放置于"r中反應(yīng)lh; lh 后吸去反應(yīng)液，每孔中加入PBST溶液洗細(xì)胞三次，再將PBST溶液吸 棄；在每個(gè)孔中加入100 ja L顯色液(3， 3 ' ， 5， 5 ' -Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for Membranes, sigma， T0565 ),放置在37t!中顯色15min， 15min后吸 棄板中的顯色液終止顯色。實(shí)驗(yàn)對(duì)照為未進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)的RD細(xì)胞。
(7) 結(jié)果檢測(cè)啟動(dòng)斑點(diǎn)檢測(cè)儀器Elispot，將顯色反應(yīng)后的細(xì) 胞培養(yǎng)板放在取樣板上，掃描檢測(cè)每個(gè)孔中的藍(lán)色細(xì)胞數(shù)即被感染細(xì) 胞數(shù)。Elispot的詳細(xì)操作步驟可見(jiàn)該儀器的操作說(shuō)明書(shū)。
(8) 結(jié)果判定
中和抗體效價(jià)的定義為以達(dá)到50%感染抑制率以上的最大稀釋
34倍數(shù)作為該樣品的中和效價(jià)。
感染抑制率的計(jì)算方法各樣品的感染抑制率- (1-樣品孔被感 染細(xì)胞數(shù)/ (陽(yáng)性孔顯色細(xì)胞數(shù)總和/5 -陰性孔顯色細(xì)胞數(shù)總和/5 )) x畫(huà)。
其中，樣品孔被感染細(xì)胞數(shù)-樣品孔平均顯色細(xì)胞數(shù)-陰性孔顯色 細(xì)胞數(shù)總和/5。
實(shí)施例7.與傳統(tǒng)的TCIDs。中和抗體檢測(cè)方法的對(duì)比
本實(shí)施例中，我們將本發(fā)明的腸道病毒中和抗體檢測(cè)方法與傳統(tǒng) 的TCID5。中和抗體檢測(cè)方法進(jìn)行了對(duì)比實(shí)驗(yàn)。本實(shí)施例中，我們應(yīng)用 兩種方法同時(shí)對(duì)中和性EV71單克隆抗體12C3(也可以采用其它抗體， 例如市售抗體)的中和效價(jià)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)兩種方法的應(yīng)用效果進(jìn)行對(duì) 比。
實(shí)驗(yàn)方法
(1)應(yīng)用本發(fā)明的腸道病毒中和抗體檢測(cè)方法將RD細(xì)胞鋪于 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(2xl07孔)。10小時(shí)后將單克隆抗體樣品12C3 (lmg/mL)用無(wú)血清MEM進(jìn)行連續(xù)稀釋(以病毒原液為起點(diǎn)，進(jìn)行10 倍比稀釋，稀釋5個(gè)梯度)，然后各取50jiL分別與50pL稀釋于無(wú) 血清MEM的EV71病毒(100TCID5。)混合。37X:混合孵育2小時(shí)后分 別加入預(yù)鋪有RD細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。培養(yǎng)14小時(shí)后進(jìn)行酶聯(lián) 免疫斑點(diǎn)反應(yīng)，吸去各孔中的培養(yǎng)基，每孔中加入100pL固定液(含 有0. 2%戊二醛的PBS溶液)，室溫避光靜置lh; lh后吸去固定液， 每孔中加入IOOjjL l%Triton X-100溶液通透細(xì)胞，室溫靜置0. 5h; 0. 5h后吸去通透液，每孔中加入PBST溶液洗細(xì)胞三次，再將PBST溶 液吸棄；在每個(gè)孔中加入100uL酶標(biāo)記的EV71單克隆抗體H5D6-HRP， 酶標(biāo)抗體H5D6-HRP (1.9mg/mL)用酶稀(1 x PB， 0. 1。/。casein， 5%蔗 糖，0. 1%氨基比林，0. 5%Tween-20， 1%BSA， 0. 15M氯化鈉，10%甘露 醇)稀釋10000倍使用，放置于37X:中反應(yīng)lh; lh后吸去反應(yīng)液， 每孔中加入PBST溶液洗細(xì)胞三次，再將PBST溶液吸棄；在每個(gè)孔中加入100 jaL顯色液(3， 3' ，5,5' -Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for Membranes, sigma, T0565 ), 放置 在371C中顯色15min， 15min后吸棄板中的顯色液終止顯色。實(shí)驗(yàn)對(duì)照 為未進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)的RD細(xì)胞。
啟動(dòng)斑點(diǎn)檢測(cè)儀器Elispot，將進(jìn)行顯色反應(yīng)后的細(xì)胞培養(yǎng)板放 在取樣板上，檢測(cè)每個(gè)孔中的藍(lán)色細(xì)胞數(shù)即被感染細(xì)胞數(shù)。Elispot 的詳細(xì)操作步驟見(jiàn)該儀器的操作說(shuō)明書(shū)。實(shí)驗(yàn)對(duì)照設(shè)置為未進(jìn)行感染 實(shí)驗(yàn)的RD細(xì)胞(稱為陰性孔，每個(gè)96孔板"^殳置5個(gè)孔)和只進(jìn)行EV71 病毒感染的RD細(xì)胞(稱為陽(yáng)性孔，每個(gè)96孔板設(shè)置5個(gè)孔)。
中和效價(jià)的判定方法
抗體中和效價(jià)的定義為以達(dá)到50%感染抑制率以上的最大稀釋 倍數(shù)作為該單克隆抗體樣品的中和效價(jià)。
感染抑制率的計(jì)算方法各樣品的感染抑制率- (1-樣品孔被感 染細(xì)胞數(shù)/(陽(yáng)性孔顯色細(xì)胞數(shù)總和/5-陰性孔顯色細(xì)胞數(shù)總和/5)) x畫(huà)。
其中，樣品孔被感染細(xì)胞數(shù)-樣品孔平均顯色細(xì)胞數(shù)-陰性孔顯色 細(xì)胞數(shù)總和/5。
(2)應(yīng)用傳統(tǒng)的TCIDs。中和抗體檢測(cè)方法將RD細(xì)胞鋪于96孔 細(xì)胞培養(yǎng)板中(2 x 104/孔)。10小時(shí)后將單克隆抗體樣品12C3( lmg/mL ) 用無(wú)血清MEM進(jìn)行連續(xù)倍比稀釋(以病毒原野為起點(diǎn)，進(jìn)行IO倍比稀 釋，稀釋5個(gè)梯度)，然后各取50jnL分別與50pL稀釋于無(wú)血清MEM 的EV71病毒(100TCID5。)混合。37C混合孵育2小時(shí)后分別加入預(yù)鋪 有RD細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。37C培養(yǎng)6天，連續(xù)觀察并記錄細(xì) 胞病變。實(shí)驗(yàn)對(duì)照設(shè)置為未進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)的RD細(xì)胞(稱為陰性孔，每 個(gè)96孔板設(shè)置5個(gè)孔)和只進(jìn)行EV71病毒感染的RD細(xì)胞(稱為陽(yáng)性 孔，每個(gè)96孔板設(shè)置5個(gè)孔)。
中和效價(jià)的判定方法
抗體中和效價(jià)的定義為以細(xì)胞達(dá)到50%完全病變的最大稀釋倍數(shù)作為該單克隆抗體樣品的中和效價(jià)。
檢測(cè)結(jié)果
在本實(shí)施例中，我們分別應(yīng)用上述兩種方法分別對(duì)同樣的中和性 EV71單克隆抗體12C3的中和效價(jià)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示，應(yīng)
用本發(fā)明的腸道病毒中和抗體檢測(cè)方法獲得的檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)的 TCIDs。中和抗體檢測(cè)方法的結(jié)果，具有高度的相關(guān)性。
三.本發(fā)明的腸道病毒中和抗體檢測(cè)方法的應(yīng)用 實(shí)施例8.在篩選中和性腸道病毒單克隆抗體中的應(yīng)用
本發(fā)明建立的腸道病毒中和抗體檢測(cè)方法可應(yīng)用于篩選中和性腸 道病毒單克隆抗體。本實(shí)施例中我們以篩選中和性EV71單克隆抗體作 為示例，也可以包括篩選其他腸道病毒中和性單克隆抗體。
實(shí)驗(yàn)方法將RD細(xì)胞鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(2 x 1()7孔)。10h 后取50 ja L雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清，與50 p L稀釋于無(wú)血清MEM的EV71 病毒(100TCIDs。)混合，37匸混合孵育2h后分別加入預(yù)鋪有RD細(xì)胞 的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。37l培養(yǎng)14小時(shí)后，吸去各孔中的培養(yǎng)基， 每孔中加入100 mL固定液(含有0. 2%戊二醛的pbs溶液)，室溫避 光靜置lh; lh后吸去固定液，每孔中加入100ijL l%Triton X-100溶 液通透細(xì)胞，室溫靜置G. 5h; 0. 5h后吸去通透液，每孔中加入PBST 溶液洗細(xì)胞三次，再將PBST溶液吸棄；在每個(gè)孔中加入100iuL酶標(biāo) 記的EV71單克隆抗體H5D6-HRP，酶標(biāo)抗體H5D6-HRP ( 1. 9mg/mL )用 酶稀(1 x PB， 0. l%casein， 5%蔗糖，0. 1%氨基比林，0. 5%Tween-20， 1%BSA， 0. 15M氯化鈉，10°/。甘露醇)稀釋10000倍使用，放置于37 E中反應(yīng)lh; lh后吸去反應(yīng)液，每孔中加入PBST溶液洗細(xì)胞三次， 再將PBST溶液吸棄；在每個(gè)孔中加入lOOjiiL顯色液(3， 3' ，5，5' -Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for Membranes, sigma， T0565 )，放置在37X:中顯色15min， 15min后吸 棄板中的顯色液終止顯色。
啟動(dòng)斑點(diǎn)檢測(cè)儀器Elispot，將進(jìn)行顯色反應(yīng)后的細(xì)胞培養(yǎng)板放
37在取樣板上，檢測(cè)每個(gè)孔中的藍(lán)色細(xì)胞數(shù)即被感染細(xì)胞數(shù)。Elispot 的詳細(xì)操作步驟見(jiàn)該儀器的操作說(shuō)明書(shū)。實(shí)驗(yàn)對(duì)照設(shè)置為未進(jìn)行感染 實(shí)驗(yàn)的RD細(xì)胞(稱為陰性孔，每個(gè)96孔板設(shè)置5個(gè)孔)和只進(jìn)行HPV 假病毒感染的RD細(xì)胞(稱為陽(yáng)性孔，每個(gè)96孔板"^殳置5個(gè)孔)。
樣品是否具有中和能力的判斷標(biāo)準(zhǔn)為對(duì)應(yīng)樣品孔樣品的感染抑 制率達(dá)到50%感染抑制率以上。
感染抑制率的計(jì)算方法各樣品的感染抑制率- (l-樣品孔被感 染細(xì)胞數(shù)/(陽(yáng)性孔顯色細(xì)胞數(shù)總和/5-陰性孔顯色細(xì)胞數(shù)總和/5)) x簡(jiǎn)"
其中，樣品孔被感染細(xì)胞數(shù)-樣品孔平均顯色細(xì)胞數(shù)-陰性孔顯色 細(xì)胞數(shù)總和/5。在本實(shí)施例中，我們應(yīng)用上述方法分別對(duì)雜交瘤細(xì)胞 上清進(jìn)行了中和單克隆抗體篩選，結(jié)果分別如表2所示。
本實(shí)施例中雜交瘤細(xì)胞的制備方法將滅活的EV71病毒免疫 Balb/c小鼠，初免(劑量為100jag/只)與等量福氏完全佐劑混合， 加強(qiáng)免疫(劑量為50)ig/只)則與等量福氏不完全佐劑混合，進(jìn)行肌 肉注射，初免后分別于4、 8周各加強(qiáng)一次。加強(qiáng)免疫3次后進(jìn)行單克 隆抗體的篩選和制備程序，取脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP20融合獲得 雜交瘤細(xì)胞，詳細(xì)過(guò)程可參見(jiàn)單克隆抗體的常規(guī)方法(Harlow E等， 抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，1998年，139-312頁(yè))。
表2 :篩選獲得的EV71中和性單克隆抗體
單抗名稱細(xì)胞上清感染 抑制率(％)是否具有中和 能力
12C3> 50是
H3B10> 50是
K3B11> 50是
M6F9> 50是
K17F8> 50是
P15H10> 50是
38實(shí)施例9.在檢測(cè)中和性腸道病毒單克隆抗體中和效價(jià)中的應(yīng)用
本發(fā)明建立的腸道病毒中和抗體檢測(cè)方法可應(yīng)用于檢測(cè)中和性腸 道病毒單克隆抗體的中和效價(jià)。本實(shí)施例中我們以檢測(cè)中和性EV71 單克隆抗體的中和效價(jià)作為示例，也可以包括檢測(cè)其他腸道病毒中和 性單克隆抗體的中和效價(jià)。
實(shí)驗(yàn)方法將RD細(xì)胞鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(2xioV孔)。10h 后將待檢測(cè)的單克隆抗體樣品用無(wú)血清MEM進(jìn)行連續(xù)稀釋(以病毒原 液為起點(diǎn)，進(jìn)行10倍比稀釋，稀釋5個(gè)梯度)，然后各取50jiL分別 與50|iL稀釋于無(wú)血清MEM的EV71病毒(100TCID5o)混合。37X2混 合孵育2小時(shí)后分別加入預(yù)鋪有RD細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。37匸 培養(yǎng)14小時(shí)后，吸去各孔中的培養(yǎng)基，每孔中加入IOOmL固定液(含 有0. 2%戊二醛的PBS溶液)，室溫避光靜置lh; lh后吸去固定液， 每孔中加入100|jL l訂riton X-100溶液通透細(xì)胞，室溫靜置0. 5h; 0，5h后吸去通透液，每孔中加入PBST溶液洗細(xì)胞三次，再將PBST溶 液吸棄；在每個(gè)孔中加入100 |i L酶標(biāo)記的EV71單克隆抗體H5D6-HRP, 酶標(biāo)抗體H5D6-HRP (1.9mg/mL)用酶稀(lxPB， 0. l%casein， 5%蔗 糖，0. 1%氨基比林，0. 5%Tween-20， 1%BSA， 0. 15M氯化鈉，10°/。甘露 醇)稀釋10000倍使用，放置于371c中反應(yīng)lh; lh后吸去反應(yīng)液， 每孔中加入PBST溶液洗細(xì)胞三次，再將PBST溶液吸棄；在每個(gè)孔中 加入lOOjnL顯色液(3， 3' ，5,5' -Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for Membranes, sigma， T0565 ), 放置 在37C中顯色15min， 15min后吸棄板中的顯色液終止顯色。
啟動(dòng)斑點(diǎn)檢測(cè)儀器Elispot,將進(jìn)行顯色反應(yīng)后的細(xì)胞培養(yǎng)板放 在取樣板上，檢測(cè)每個(gè)孔中的藍(lán)色細(xì)胞數(shù)即被感染細(xì)胞數(shù)。EHspot 的詳細(xì)操作步驟見(jiàn)該儀器的操作說(shuō)明書(shū)。實(shí)驗(yàn)對(duì)照設(shè)置為未進(jìn)行感染 實(shí)驗(yàn)的RD細(xì)胞(稱為陰性孔，每個(gè)96孔板設(shè)置5個(gè)孔)和只進(jìn)行EV71 病毒感染的RD細(xì)胞(稱為陽(yáng)性孔，每個(gè)96孔板設(shè)置5個(gè)孔)。
中和效價(jià)的判定方法
39抗體中和效價(jià)的定義為以達(dá)到50%感染抑制率以上的最大稀釋 倍數(shù)作為該單克隆抗體樣品的中和效價(jià)。
感染抑制率的計(jì)算方法各樣品的感染抑制率- (l-樣品孔被感 染細(xì)胞數(shù)/(陽(yáng)性孔顯色細(xì)胞數(shù)總和/5-陰性孔顯色細(xì)胞數(shù)總和/5)) x醒。
其中，樣品孔被感染細(xì)胞數(shù)=樣品孔平均顯色細(xì)胞數(shù)-陰性孔顯色 細(xì)胞數(shù)總和/5。在本實(shí)施例中，我們應(yīng)用上述方法分別檢測(cè)了多個(gè) EV71中和性單克隆抗體的中和效價(jià)，結(jié)果分別如表3所示。
同時(shí)，我們也應(yīng)用傳統(tǒng)的TCID5。中和抗體檢測(cè)方法對(duì)上述單克隆 抗體的中和效價(jià)進(jìn)行了檢測(cè)，TCID5。中和抗體檢測(cè)方法參見(jiàn)實(shí)施例7， 檢測(cè)結(jié)果如表3所示。結(jié)果顯示，應(yīng)用本發(fā)明的腸道病毒中和抗體檢 測(cè)方法獲得的檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)的TCID5。中和抗體檢測(cè)方法的結(jié)果，具 有4艮好的一致性。
表3 : EV71中和性單克隆抗體的中和效價(jià)
單抗名稱本發(fā)明方法檢測(cè) 的中和效價(jià)傳統(tǒng)TCIDs。方法 檢測(cè)的中和效價(jià)
12C3100005000
H3B10100005000
K3B1110000075000
M6F91000010000
K17F8100005000
P15H1010001000
實(shí)施例10.在檢測(cè)血清樣品的腸道病毒中和抗體效價(jià)中的應(yīng)用
本發(fā)明建立的腸道病毒中和抗體檢測(cè)方法可應(yīng)用于檢測(cè)血清樣品 中的腸道病毒中和抗體效價(jià)，中和實(shí)驗(yàn)即檢測(cè)患者急性期和恢復(fù)期血 清的中和抗體效價(jià)是腸道病毒感染的血清學(xué)診斷方法，該方法精確且
具有型特異性(李蘭娟等，手足口病，2008年，221頁(yè))。本實(shí)施例
中我們檢測(cè)血清樣品中Evn中和抗體作為示例，也可以包括檢測(cè)血清樣品中其他腸道病毒中和抗體。
待檢測(cè)血清樣品為腸道病毒患者的急性期血清。 中和實(shí)驗(yàn)方法將RD細(xì)胞鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(2 x 104/孔)。 10小時(shí)后將待檢測(cè)的血清樣品用無(wú)血清MEM進(jìn)行連續(xù)稀釋(以1: 8 稀釋為起點(diǎn)，進(jìn)行4倍比稀釋，稀釋5個(gè)梯度)，然后各取50jnL分 別與50juL稀釋于無(wú)血清MEM的EV1病毒(100TCID5。)混合。37T混 合孵育2h后分別加入預(yù)鋪有RD細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。37X:培養(yǎng) 14小時(shí)后，吸去各孔中的培養(yǎng)基，每孔中加入100nL固定液(含有 0. 2%戊二醛的PBS溶液)，室溫避光靜置lh; lh后吸去固定液，每孔 中加入100ijL l°/。Triton X-100溶液通透細(xì)胞，室溫靜置0. 5h; 0， 5h 后吸去通透液，每孔中加入PBST溶液洗細(xì)胞三次，再將PBST溶液吸 棄；在每個(gè)孔中加入100pL酶標(biāo)記的EV71單克隆抗體H5D6-HRP，酶 標(biāo)抗體H5D6-HRP (1.9mg/mL)用酶稀(lxPB， 0. l%casein， 5%蔗糖， 0. 1%氨基比林，0. 5%Tween-20， 1%BSA， 0. 15M氯化鈉，10°/。甘露醇) 稀釋10000倍使用，放置于37t:中反應(yīng)lh; lh后吸去反應(yīng)液，每孔 中加入PBST溶液洗細(xì)胞三次，再將PBST溶液吸棄；在每個(gè)孔中加入 100 jaL顯色液(3， 3' ，5,5' -Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for Membranes, sigma, T0565 ),放置在37C中 顯色15min， 15min后吸棄板中的顯色液終止顯色。
啟動(dòng)斑點(diǎn)檢測(cè)儀器Elispot，將進(jìn)行顯色反應(yīng)后的細(xì)胞培養(yǎng)板放 在取樣板上，檢測(cè)每個(gè)孔中的藍(lán)色細(xì)胞數(shù)即被感染細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)對(duì)照 設(shè)置為未進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)的RD細(xì)胞(稱為陰性孔，每個(gè)96孔板設(shè)置5 個(gè)孔)和只進(jìn)行EV71病毒感染的RD細(xì)胞(稱為陽(yáng)性孔，每個(gè)96孔板 設(shè)置5個(gè)孔)。
抗體中和效價(jià)的定義為以達(dá)到50%感染抑制率以上的最大稀釋 倍數(shù)作為該血清樣品的中和效價(jià)。
感染抑制率的計(jì)算方法各樣品的感染抑制率- (1-樣品孔被感 染細(xì)胞數(shù)/(陽(yáng)性孔顯色細(xì)胞數(shù)總和/5-陰性孔顯色細(xì)胞數(shù)中和/5)) x100%。
41其中，樣品孔被感染細(xì)胞數(shù)=樣品孔平均顯色細(xì)胞數(shù)_陰性孔顯色
細(xì)胞數(shù)總和/5。
在本實(shí)施例中，我們應(yīng)用上述方法分別檢測(cè)了不同腸道病毒患者 血清中的EV71中和抗體效價(jià)，結(jié)果分別如圖6所示。
同時(shí)，我們也應(yīng)用傳統(tǒng)的TCIDs。中和抗體檢測(cè)方法對(duì)上述血清樣 品進(jìn)行了 EV71中和抗體檢測(cè)，TCIDs。中和抗體檢測(cè)方法見(jiàn)實(shí)施例7， 檢測(cè)結(jié)果如圖6所示。結(jié)果顯示，應(yīng)用本發(fā)明的腸道病毒中和抗體檢 測(cè)方法獲得的檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)的TCIDs。中和抗體檢測(cè)方法的結(jié)果，具 有很好的一致性。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明了，盡管為了舉例說(shuō)明的目的本文描述 了本發(fā)明的具體實(shí)施方案，但可以對(duì)其進(jìn)行各種修改而不偏離本發(fā)明 的精神和范圍。因此，本發(fā)明的具體實(shí)施方案和實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)視為限
制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明僅受所附權(quán)利要求的限制。本申請(qǐng)中引用的 所有文獻(xiàn)均完整地并入本文作為參考。
權(quán)利要求
1、檢測(cè)被病毒(例如人腸道病毒)感染的細(xì)胞(優(yōu)選培養(yǎng)細(xì)胞或細(xì)胞系)的方法，包括(1)優(yōu)選應(yīng)用酶聯(lián)免疫方法，使得被病毒感染的細(xì)胞帶有可檢測(cè)的信號(hào)，優(yōu)選是能被斑點(diǎn)檢測(cè)儀器檢測(cè)到的信號(hào)或者適合于斑點(diǎn)檢測(cè)法檢測(cè)的信號(hào)，而未被病毒感染的細(xì)胞不帶有該信號(hào)；和(2)優(yōu)選通過(guò)應(yīng)用斑點(diǎn)檢測(cè)儀器或通過(guò)以斑點(diǎn)檢測(cè)法，檢測(cè)細(xì)胞是否帶有該信號(hào)；其中，使被病毒感染的細(xì)胞帶有可檢測(cè)的信號(hào)優(yōu)選通過(guò)如下方法實(shí)現(xiàn)使檢測(cè)用病毒抗體(優(yōu)選酶標(biāo)檢測(cè)用病毒抗體)與被感染細(xì)胞中的病毒或病毒蛋白特異結(jié)合，檢測(cè)用病毒抗體(優(yōu)選酶標(biāo)檢測(cè)用病毒抗體)能夠直接產(chǎn)生或間接產(chǎn)生(例如通過(guò)顯色反應(yīng))能夠被斑點(diǎn)檢測(cè)儀器檢測(cè)的信號(hào)。
2、 權(quán)利要求l所述的方法，用于檢測(cè)被病毒感染的細(xì)胞的數(shù)量， 或者用于病毒滴度的確定。
3、 檢測(cè)被病毒(例如人腸道病毒)感染的細(xì)胞(優(yōu)選培養(yǎng)細(xì)胞 或細(xì)胞系)的方法，包括(a)使病毒和靶細(xì)胞在適合病毒感染靶細(xì)胞的條件下接觸，之 后4吏所得產(chǎn)物和檢測(cè)用病毒抗體在適合檢測(cè)用病毒抗體與病毒或病毒 蛋白結(jié)合的條件下接觸，或者(b )使病毒和檢測(cè)用病毒抗體在適合檢測(cè)用病毒抗體與病毒或 病毒蛋白結(jié)合的條件下接觸，之后使所得產(chǎn)物和靶細(xì)胞在適合病毒感 染乾細(xì)胞的條件下接觸，或者(c)使病毒、檢測(cè)用病毒抗體和靶細(xì)胞同時(shí)在適合病毒感染靶 細(xì)胞且適合檢測(cè)用病毒抗體與病毒或病毒蛋白結(jié)合的條件下接觸；所述方法優(yōu)選還包括檢測(cè)靶細(xì)胞中特異性結(jié)合的檢測(cè)用病毒抗 體，或者檢測(cè)乾細(xì)胞中包含特異性結(jié)合的檢測(cè)用病毒抗體的細(xì)胞或其數(shù)量；其中，所述檢測(cè)用病毒抗體優(yōu)選是特異結(jié)合病毒或者病毒蛋白(特別是病毒表面蛋白)的抗體，優(yōu)選是單克隆抗體，也優(yōu)選是在病毒感染靶細(xì)胞后在靶細(xì)胞中表達(dá)的病毒蛋白的特異性抗體；所述檢測(cè) 用病毒抗體可以帶有標(biāo)記的(優(yōu)選酶標(biāo)記的)或者未帶有標(biāo)記的；或 者，所述檢測(cè)用病毒抗體可以直接產(chǎn)生或間接產(chǎn)生(例如通過(guò)顯色反 應(yīng))能夠被斑點(diǎn)檢測(cè)儀器檢測(cè)的信號(hào)。
4、 一種檢測(cè)樣品中的病毒(例如人腸道病毒)中和抗體的方法， 包括使樣品中可能存在的病毒中和抗體與病毒結(jié)合以阻斷病毒對(duì)把 細(xì)胞的感染，并應(yīng)用權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法檢測(cè)被病毒感染的細(xì) 胞，由此檢測(cè)樣品中的病毒中和抗體。
5、 權(quán)利要求4的方法，其中所述方法用于檢測(cè)樣品中病毒中和 抗體的存在與否和/或其效價(jià)。
6、 權(quán)利要求1-5之任一項(xiàng)所述的方法，其中所述的斑點(diǎn)檢測(cè)法 獲得的檢測(cè)數(shù)據(jù)通過(guò)斑點(diǎn)檢測(cè)儀器獲得，斑點(diǎn)檢測(cè)儀器優(yōu)選能夠用于 分辨和測(cè)算細(xì)胞群中產(chǎn)生特定信號(hào)(例如顏色)的細(xì)胞的數(shù)量，優(yōu)選 Elispot。
7、 權(quán)利要求1-6之任一項(xiàng)所述的方法，其中所述檢測(cè)用病毒抗 體是酶標(biāo)抗體；或者，所述檢測(cè)用病毒抗體是未標(biāo)記的，所述方法還 包括使第二抗體和靶細(xì)胞中可能存在的、特異結(jié)合的檢測(cè)用病毒抗 體結(jié)合，第二抗體是標(biāo)記的(優(yōu)選酶標(biāo)記的)，并檢測(cè)包含特異性結(jié) 合的第二抗體的細(xì)胞或其數(shù)量，其中優(yōu)選地，所述的酶是可以直接或 間接產(chǎn)生能夠被斑點(diǎn)檢測(cè)儀器檢測(cè)的信號(hào)的酶。
8、 檢測(cè)樣品中的病毒(例如人腸道病毒)中和抗體的方法，其 包括以下步驟(a )提供病毒和作為病毒感染靶細(xì)胞的培養(yǎng)于固相培養(yǎng)載體(例 如細(xì)胞培養(yǎng)皿、細(xì)胞培養(yǎng)板等，優(yōu)選多孔細(xì)胞培養(yǎng)板，更優(yōu)選96孔細(xì) 胞培養(yǎng)板)上的細(xì)胞；所述細(xì)胞一般為動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞， 其能在病毒感染后表達(dá)病毒的蛋白；所述病毒根據(jù)待檢測(cè)的病毒中和 抗體所屬的病毒型別來(lái)選擇， 一般是待檢病毒中和抗體所針對(duì)的病毒；(b)將待檢樣品與步驟(a)中所述的病毒接觸，使得樣品中可能存在的病毒中和抗體與病毒結(jié)合，以致能夠阻止病毒對(duì)步驟(a)中 所述的靶細(xì)胞的感染；(c) 使步驟(b)的產(chǎn)物(樣品與病毒的混合液)與步驟(a) 中所述的培養(yǎng)于固相培養(yǎng)栽體上的靶細(xì)胞接觸，該接觸在允許細(xì)胞正 常生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行；(d) 用固定液固定步驟(c)所獲得的細(xì)胞，固定條件應(yīng)使細(xì)胞 保持原有的形態(tài)；固定液可為多聚甲醛和/或戊二醛等，優(yōu)選0.2%戊 二醛；(e) 用通透液透化處理步驟(d)所獲得的細(xì)胞，以便加強(qiáng)細(xì)胞 膜的通透性，使得以下操作中所加入的抗體能夠進(jìn)入細(xì)胞；所述通透 液優(yōu)選1% Triton X-100;優(yōu)選(以例如但不限于PBST )進(jìn)行洗滌；(f )使步驟(e)所獲得的細(xì)胞和能與病毒或病毒蛋白特異性結(jié) 合的檢測(cè)用病毒抗體接觸，使得可能存在的被病毒吸附和/或感染的細(xì) 胞中的病毒顆粒或者病毒蛋白與檢測(cè)用病毒抗體結(jié)合；檢測(cè)用病毒抗 體可以帶有標(biāo)記(優(yōu)選酶)或者不帶有標(biāo)記；優(yōu)選(以例如但不限于 PBST )進(jìn)行洗滌；(g)檢測(cè)步驟(f )獲得的細(xì)胞中可能存在的、特異性結(jié)合的檢 測(cè)用病毒抗體，或者檢測(cè)步驟(f )獲得的細(xì)胞中可能存在的、包含特 異性結(jié)合的檢測(cè)用病毒抗體的細(xì)胞或其數(shù)量；所述檢測(cè)優(yōu)選通過(guò)斑點(diǎn) 檢測(cè)儀器(如Elispot)來(lái)進(jìn)行，更優(yōu)選的是，所述檢測(cè)包括通過(guò) 應(yīng)用斑點(diǎn)檢測(cè)儀器，檢測(cè)步驟(f )獲得的細(xì)胞中帶有由特異性結(jié)合的 檢測(cè)用病毒抗體直接或者間接產(chǎn)生的信號(hào)的細(xì)胞，來(lái)檢測(cè)被感染細(xì)胞 的數(shù)量。
9、 權(quán)利要求8的方法，其中所述檢測(cè)用病毒抗體是酶標(biāo)記的； 優(yōu)選地，步驟(g)中所述的檢測(cè)包括將步驟(f )獲得的細(xì)胞和酶 的底物接觸，由此直接或者間接產(chǎn)生可被優(yōu)選斑點(diǎn)檢測(cè)儀器檢測(cè)的信 號(hào)，并優(yōu)選通過(guò)斑點(diǎn)檢測(cè)儀器檢測(cè)存在該信號(hào)的細(xì)胞或其數(shù)量。
10、 權(quán)利要求8的方法，其中所述檢測(cè)用病毒抗體是未標(biāo)記的； 優(yōu)選地，步驟(g)中所述的檢測(cè)包括將步驟(f )獲得的細(xì)胞和帶有標(biāo)記(優(yōu)選酶標(biāo)記的)的第二抗體在允許笫二抗體和檢測(cè)用病毒抗 體特異結(jié)合的條件下接觸，并檢測(cè)獲得的細(xì)胞中可能存在的、特異性 結(jié)合的第二抗體，或者可能存在的、包含特異性結(jié)合的第二抗體的細(xì)胞或其數(shù)量。
11、 權(quán)利要求10的方法，其中所述第二抗體是酶標(biāo)記的；優(yōu)選 地，特異性結(jié)合的第二抗體或者包含特異性結(jié)合的第二抗體的細(xì)胞的 檢測(cè)包括將獲得的細(xì)胞和酶的底物接觸，由此直接或者間接產(chǎn)生可 被優(yōu)選斑點(diǎn)檢測(cè)儀器檢測(cè)的信號(hào)，并優(yōu)選通過(guò)斑點(diǎn)檢測(cè)儀器檢測(cè)存在 該信號(hào)的細(xì)胞或其數(shù)量。
12、 權(quán)利要求9或者11的方法，其中所述特異性結(jié)合的檢測(cè)用 病毒抗體或者包含特異性結(jié)合的檢測(cè)用病毒抗體的細(xì)胞，或者所述特 異性結(jié)合的第二抗體或者包含特異性結(jié)合的第二抗體的細(xì)胞，通過(guò)如 下方法來(lái)檢測(cè)使所述酶與該酶的底物接觸，發(fā)生酶促顏色反應(yīng)，由 此產(chǎn)生顏色，并優(yōu)選應(yīng)用斑點(diǎn)檢測(cè)儀器確定帶有該顏色的細(xì)胞的數(shù)量。
13、 權(quán)利要求11或者12的方法，其中所述檢測(cè)用病毒抗體或者 第二抗體所帶的標(biāo)記是酶、熒光物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、同位素、或稀 土元素。
14、 上述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述樣品是疫苗或者候選 疫苗免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之后獲得的抗血清、體外培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的 單克隆抗體樣品、或者從待檢個(gè)體分離的生物學(xué)樣品(如血清)，如 懷疑攜帶病毒的患者的血清，或者是來(lái)自組織培養(yǎng)的生物學(xué)樣品，或 者，所述樣品不是從有生命的人體或者動(dòng)物體獲得的樣品，或者，所 述方法不是專利法意義上的診斷方法。
15、 試劑盒，其包含下列項(xiàng)目中的一種或多種(1) 能與病毒或病毒蛋白特異性結(jié)合的檢測(cè)用病毒抗體，其可 以是標(biāo)記的或者未標(biāo)記的，例如酶標(biāo)記的，(2) 任選的第二抗體，是能夠與抗體如檢測(cè)用病毒抗體特異結(jié) 合的抗體，可以是標(biāo)記的或者未標(biāo)記的，例如是酶標(biāo)記的，(3) 任選的病毒，所述病毒一般根據(jù)待檢測(cè)的病毒中和抗體所屬的病毒型別來(lái)選擇，優(yōu)選是待檢病毒中和抗體所針對(duì)的病毒；(4) 任選的病毒中和抗體標(biāo)準(zhǔn)品，和(5) 任選的細(xì)胞，作為病毒感染靶細(xì)胞，培養(yǎng)于固相培養(yǎng)載體 (例如細(xì)胞培養(yǎng)皿、細(xì)胞培養(yǎng)板等，優(yōu)選多孔細(xì)胞培養(yǎng)板，更優(yōu)選96孔細(xì)胞培養(yǎng)板)上，所述細(xì)胞一般為動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞， 其能在病毒感染后表達(dá)病毒的蛋白；所述試劑盒任選地還包含用于固定細(xì)胞的固定液；和/或，用 于^f吏細(xì)胞通透性增加的通透液；優(yōu)選地，檢測(cè)用病毒抗體或者第二抗體是酶標(biāo)記的，所述試劑盒 優(yōu)選還包含酶的底物，或者酶的顯色試劑，如顯色液，所述試劑盒可以用于檢測(cè)樣品中的病毒(例如人腸道病毒，例如 腸道病毒EV71)中和抗體，或者可以用于診斷患者是否感染該病毒， 或者可以用于診斷患者是否患有所述病毒感染引起的疾病(例如手足 口病)，例如可以用于實(shí)施前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法。
16、 斑點(diǎn)檢測(cè)儀器或斑點(diǎn)檢測(cè)法或權(quán)利要求1 - 14任一項(xiàng)的方法 在檢測(cè)病毒中和抗體中的用途、在篩選病毒中和性單克隆抗體中的用 途、在檢測(cè)病毒中和抗體效價(jià)中的用途、在制備病毒中和抗體診斷試 劑盒中的用途、在病毒疫苗開(kāi)發(fā)和質(zhì)控中的用途、在篩選或制備抗病 毒或其相關(guān)疾病藥物中的用途、或在治療病毒感染中的用途。
17、 篩選病毒例如人腸道病毒中和性單克隆抗體的方法，該方法 包括根據(jù)權(quán)利要求1 — 14任一項(xiàng)的方法，檢測(cè)候選抗體是否是病毒 中和抗體。
18、 檢測(cè)病毒中和抗體效價(jià)的方法，包括根據(jù)權(quán)利要求1-14 任一項(xiàng)的方法，確定病毒中和抗體效價(jià)。
19、 確定病毒疫苗的有效性或效價(jià)的方法，包括根據(jù)權(quán)利要求 1-14任一項(xiàng)的方法，確定所述疫苗免疫動(dòng)物后獲得的抗血清或者抗 體中病毒中和抗體存在與否或其效價(jià)。
20、 診斷患者是否感染病毒的方法，包括根據(jù)權(quán)利要求1-14 任一項(xiàng)的方法，確定來(lái)自患者的樣品例如血清中病毒中和抗體存在與否或其效價(jià)。
21、前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法或者試劑盒，其中所迷病毒是人 腸道病毒，特別是EV71病毒，所述病毒中和抗體是人腸道病毒，特別 是EV71病毒的中和抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高效的腸道病毒中和抗體的檢測(cè)方法和試劑盒，該方法可適用于對(duì)腸道病毒中和抗體的高通量檢測(cè)。本發(fā)明方法的特征在于用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法結(jié)合斑點(diǎn)檢測(cè)儀器來(lái)檢測(cè)被腸道病毒感染的細(xì)胞。本發(fā)明同時(shí)還公開(kāi)了上述方法在中和性腸道病毒單克隆抗體、檢測(cè)腸道病毒單克隆抗體的中和效價(jià)等方面的用途。
文檔編號(hào)G01N33/569GK101644709SQ20091014348
公開(kāi)日2010年2月10日 申請(qǐng)日期2009年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月26日
發(fā)明者何德磊, 夏寧邵, 軍 張, 通 程, 蔡毅君, 陳毅歆 申請(qǐng)人:廈門(mén)大學(xué);北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司