專利名稱：豬ⅱ型圓環(huán)病毒抗體間接elisa診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及豬的一種病毒抗體的快速診斷方法和器具，具體是豬II型圓環(huán)病毒(PCV2)抗體間接ELISA診斷試劑盒。
背景技術(shù)：
豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus，PCV)是目前發(fā)現(xiàn)的最小的動(dòng)物病毒，病毒粒子直徑約17nm，為共價(jià)閉合，環(huán)狀，單股DNA病毒，PCV具有兩種基因型PCV1和PCV2。PCV1無(wú)致病性，但廣泛存在于豬體內(nèi)和豬源傳代細(xì)胞系，PCV2對(duì)豬有致病性，主要引起仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(Post-weaningmultisystemic wasting syndrome，PMWS)。PMWS為一種新的傳染病，1991年首次在加拿大發(fā)現(xiàn)，主要發(fā)生于5-12周齡斷奶仔豬，表現(xiàn)為進(jìn)行性消瘦、呼吸困難、皮膚蒼白、腹瀉、黃疸。隨后，美國(guó)，英國(guó)，德國(guó)，法國(guó)，愛(ài)爾蘭，捷克，西班牙，中國(guó)臺(tái)灣，荷蘭，瑞士，阿根廷，墨西哥，日本，丹麥，意大利，韓國(guó)，匈牙利，泰國(guó)等國(guó)相繼報(bào)道了該病，流行病學(xué)調(diào)查表明，該病在中國(guó)也廣泛流行，并造成相當(dāng)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。PCV2除了引起PMWS外，還可引起育肥豬皮炎與腎病綜合征(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS)，并與懷孕母豬的繁殖障礙，新生仔豬的先天性陣顫，新生仔豬腹瀉和增生性壞死性肺炎關(guān)系密切。根據(jù)PMWS的流行病學(xué)，臨床癥狀和剖檢病理變化可對(duì)PCV2感染作出初步診斷，但確診仍需要以實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)檢測(cè)PCV2抗原及其抗體。PCV2的衣殼蛋白是該病毒的主要免疫原，檢測(cè)PCV2衣殼蛋白抗體從而可反映PCV2的抗體水平。對(duì)豬群PCV2抗體水平，特別是母源抗體水平，進(jìn)行監(jiān)測(cè)，可確切了解豬體免疫水平，把握疫病最適免疫時(shí)機(jī)，確保獲得良好免疫效果，有效預(yù)防和控制PCV2的侵襲和傳播，避免因此而引起的重大經(jīng)濟(jì)損失。
目前，國(guó)內(nèi)外采用的PCV2檢測(cè)技術(shù)主要有病毒分離培養(yǎng)，間接免疫熒光(IFA)，免疫酶單層試驗(yàn)(IMPA)，原位雜交(ISH)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)等等。上述技術(shù)和方法雖然可以檢測(cè)PCV2及其抗體水平，在實(shí)踐中也取得一定的效果，但均存在試驗(yàn)操作復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，需要特定的專業(yè)技能和儀器設(shè)備等，常限于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，很難在基層普及和推廣。因此，研制開(kāi)發(fā)適用于養(yǎng)殖基層的快捷、簡(jiǎn)便的PCV2抗體檢測(cè)器具，對(duì)豬群PCV2免疫水平進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，建立科學(xué)的、靈活的豬群疫病免疫程序，對(duì)疫病的預(yù)防和控制有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種豬II型圓環(huán)病毒(PCV2)抗體間接ELISA診斷試劑盒。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的采用原核表達(dá)的豬II型圓環(huán)病毒重組去核定位信號(hào)衣殼蛋白(dCap)作為抗原包被可拆96孔酶標(biāo)板，以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗豬IgG制備酶結(jié)合物工作液，以間接ELISA法直接檢測(cè)標(biāo)本中的PCV2抗體。具體如下1.抗體檢測(cè)板的制備用pH8.5的0.05M Tris-HCl緩沖液作包被液，將豬II型圓環(huán)病毒重組去核定位信號(hào)衣殼蛋白稀釋為0.1-10μg/ml，按100μl/孔加入聚苯乙烯微孔板中，37℃2小時(shí)，再4℃包被過(guò)夜，甩干，按100μl/孔加入含1％牛血清白蛋白(BSA)，PH7.4的磷酸鹽緩沖液37℃封閉2小時(shí)，洗滌甩干，再加入20％蔗糖磷酸鹽緩沖液室溫保護(hù)3小時(shí)，置干燥室干燥后，裝入含干燥劑的包裝袋中保存。
2.酶結(jié)合物工作液的制備用超純水配制辣根過(guò)氧化物酶(HRP，RZ≥3.0)溶液，加入0.06M過(guò)碘酸鈉溶液4℃避光1小時(shí)，加入160mM乙二醇，室溫反應(yīng)30分鐘，加入PH4.4的醋酸緩沖液1小時(shí)2-8℃透析過(guò)夜，換液兩次。將純化的山羊抗豬IgG加入上述活化的酶中，轉(zhuǎn)移至透析袋，于0.05mM PH9.6的碳酸緩沖液中透析，4℃攪拌過(guò)夜(換液兩次)。透析液吸至離心管中，加新配的NaBH4液，4℃反應(yīng)2小時(shí)。加入等量的飽和硫酸銨溶液，4℃30分鐘，4℃離心20分鐘，棄上清，瀝干。將沉淀溶于少量PBS，裝入透析袋中，對(duì)0.02M PBS(PH7.4)透析，4℃過(guò)夜。將透析液中液體吸至離心管中，離心，將上清液吸出，加等量甘油，混勻，-20℃保存。再以含0.1％BSA，0.05％吐溫-20，0.01％硫柳汞鈉，pH7.4的磷酸緩沖液按1∶200-5000稀釋凍存的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗豬IgG多克隆抗體作為酶結(jié)合物工作液。
3.其它試劑的配制樣品稀釋液為含0.05％吐溫-20的0.01M磷酸鹽緩沖液(pH7.4)；10×濃縮洗滌液為含0.5％吐溫-20的0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.4)；顯色液A為0.2mg/ml的四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液，顯色液B為含0.5‰過(guò)氧化氫尿素的檸檬酸—磷酸鹽緩沖液；終止液為2M硫酸溶液。
4.陽(yáng)性、陰性對(duì)照的制備將篩選獲得的豬II型圓環(huán)病毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清(OD450nm≥1.00)加入少量紅色顏料并按1000U/ml加入青霉素和鏈霉素，無(wú)菌過(guò)濾，作為陽(yáng)性對(duì)照；將篩選獲得的豬標(biāo)準(zhǔn)陰性血清(OD450nm≤0.150)，按1000U/ml加入青霉素和鏈霉素，無(wú)菌過(guò)濾，作為陰性對(duì)照。
5.其檢測(cè)程序?yàn)?)將10×濃縮洗滌液稀釋10倍即為洗滌液；2)將待檢血清用樣品稀釋液作1∶100稀釋，按100μl/孔加入抗體檢測(cè)板中，同時(shí)設(shè)空白(只加100μl樣品稀釋液)、陰性對(duì)照(PCV2陰性血清)、陽(yáng)性對(duì)照(PCV2標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清)，37℃孵育20-45分鐘，甩干；3)每孔加洗滌液200μl，洗滌6次，每次間隔1分鐘，拍干；4)每孔加100μl酶結(jié)合物工作液(空白不加)，37℃孵育20-45分鐘，甩干；5)每孔加洗滌液200μl，洗滌6次，每次間隔1分鐘，拍干；6)依次加50μl顯色液A和50μl顯色液B，37℃避光孵育5-15分鐘；7)加50μl終止液，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下讀取每孔光吸收值(OD450nm值)。
6.檢測(cè)樣本的判定標(biāo)準(zhǔn)為以待檢樣本OD450nm值與標(biāo)準(zhǔn)陰性O(shè)D450nm值的比值(P/N)，大于等于2.2判為陽(yáng)性，小于等于1.7為陰性。介于1.7-2.2之間為可疑，須重檢，重測(cè)時(shí)P/N值大于等于2.0判為陽(yáng)性，小于2.0為陰性。
本發(fā)明有益的積極效果是操作簡(jiǎn)單，人人都可操作，能較好滿足不同層次人員的需要，如疫病監(jiān)測(cè)、海關(guān)檢疫、衛(wèi)生防疫、集約化養(yǎng)殖到個(gè)體養(yǎng)殖等，易于大范圍推廣應(yīng)用，具有廣闊的市場(chǎng)前景和較大的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益。本發(fā)明具有下列優(yōu)點(diǎn)(1)特異性強(qiáng)，敏感性高。PCV2抗體間接ELISA診斷試劑盒以基因工程表達(dá)的重組dCap蛋白為基礎(chǔ)制備而成；重組dCap蛋白為非全病毒抗原、安全性好，不含無(wú)關(guān)雜蛋白，只與豬II型圓環(huán)病毒陽(yáng)性血清特異結(jié)合，不與PCV1陽(yáng)性血清等豬其它疫病陽(yáng)性血清發(fā)生交叉反應(yīng)。具有良好抗原性，因此具有很高的特異性和敏感性。
(2)操作簡(jiǎn)便快速。使用PCV2抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)PCV2抗體時(shí)，無(wú)需另配其它試劑，樣品無(wú)需無(wú)菌處理，按試劑盒說(shuō)明在1-2小時(shí)內(nèi)即可判定檢測(cè)結(jié)果。
(3)結(jié)果判定形象、準(zhǔn)確、可靠。PCV2抗體間接ELISA診斷試劑盒以顯色的深淺顯示檢測(cè)結(jié)果，即檢測(cè)孔出現(xiàn)藍(lán)色顯色為陽(yáng)性，中止后呈黃色，無(wú)色為陰性，結(jié)果判定形象。采用酶標(biāo)儀機(jī)讀數(shù)，減少主觀性，準(zhǔn)確可靠。
(4)成本低，投資少。PCV2抗體間接ELISA診斷試劑盒可批量檢測(cè)，一步到位，成本低廉，投資少，見(jiàn)效快。


圖1是PCV2抗體間接ELISA診斷試劑盒檢測(cè)原理示意圖，圖中；1為酶標(biāo)板，2為PCV2 dCap抗原，3為豬PCV2抗體或待檢血清，4為HRP標(biāo)記山羊抗豬IgG多克隆抗體。
圖2是重組PCV2 dCap蛋白的抗原活性鑒定結(jié)果，圖中為重組蛋白的SDS-PAGE分析，B為重組蛋白的Western Blot鑒定，1為大腸桿菌BL21菌體蛋白，2為空載體pGEX-4T-1的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物，3為重組質(zhì)粒未誘導(dǎo)菌體蛋白，4為重組質(zhì)粒誘導(dǎo)4h表達(dá)產(chǎn)物，5為純化的重組GST-dCap融合蛋白，6為經(jīng)凝血酶切割后的重組dCap蛋白，M.為蛋白質(zhì)Marker。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的技術(shù)方案是一種PCV2抗體間接ELISA診斷試劑盒，試劑盒設(shè)有抗體檢測(cè)板，酶結(jié)合物工作液，陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照，樣品稀釋液，10×濃縮洗滌液，顯色液A，顯色液B和終止液。PCV2抗體間接ELISA診斷試劑盒的檢測(cè)板為包被PCV2重組dCap蛋白的可拆96孔酶標(biāo)板，酶結(jié)合物工作液為HRP標(biāo)記山羊抗豬IgG多克隆抗體，陽(yáng)性對(duì)照為豬PCV2標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，陰性對(duì)照為豬標(biāo)準(zhǔn)陰性血清。具體制備如下(1)PCV2重組dCap蛋白的制備根據(jù)PCV2 Cap基因序列設(shè)計(jì)特異性引物(上游引物5’-GCGGATCCAATGGCATCT TCAACAC-3’；下游引物5’-CCGCTCGA GTTAAGGGTTAAGTGGG-3’)，利用PCR技術(shù)從豬PCV2基因組中擴(kuò)增去核定位信號(hào)的衣殼蛋白基因序列(Cap基因3’端579bp的片段)(見(jiàn)圖3)，將其插入到原核表達(dá)載體pGEX-4T-1的谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因(GST)下游構(gòu)建pGEX-PCV2-dCap表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)0.1mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)5小時(shí)后，用超聲波裂解細(xì)菌，利用商用的GST親和層析柱純化表達(dá)的融合蛋白(GST-dCap)，再以凝血酶酶解去除GST標(biāo)簽，獲得豬II型圓環(huán)病毒重組去核定位信號(hào)衣殼蛋白(圖2)，該蛋白保留了完整衣殼蛋白的抗原性，可與豬II型圓環(huán)病毒陽(yáng)性血清特異結(jié)合(圖2)。分別測(cè)定GST-dCap融合蛋白和重組dCap蛋白的蛋白濃度，用于間接ELISA診斷試劑盒抗體檢測(cè)板的制備。
1 AATGGCATCT TCAACACCCG CCTCTCCCGC ACCTTCGGAT ATACTATCAA GCGAACCACA61GTCAAAACGC CCTCCTGGGC GGTGGACATG ATGAGATTCA ATATTAATGA CTTTCTTCCC121 CCAGGAGGGG GCTCAAACCC CCGCTCTGTG CCCTTTGAAT ACTACAGAAT AAGAAAGGTT181 AAGGTTGAAT TCTGGCCCTG CTCCCCGATC ACCCAGGGTG ACAGGGGAGT GGGCTCCAGT241 GCTGTTATTC TAGATGATAA CTTTGTAACA AAGGCCACAG CCCTCACCTA TGACCCCTAT301 GTAAACTACT CCTCCCGCCA TACCATAACC CAGCCCTTCT CCTACCACTC CCGCTACTTT361 ACCCCCAAAC CTGTCCTAGA TTCCACTATT GATTACTTCC AACCAAACAA CAAAAGAAAT421 CAGCTGTGGC TGAGACTACA AACTGCTGGA AATGTGGACC ACGTAGGCCT CGGCACTGCG481 TTCGAAAACA GTATATACGA CCAGGAATAC AATATCCGTG TAACCATGTA TGTACAATTC541 AGAGAATTTA ATCTTAAAGA CCCCCCACTT AACCCTTAA
(2)PCV2抗體檢測(cè)板的制備用pH8.5的0.05M Tris-HCl緩沖液作包被液，將豬II型圓環(huán)病毒重組去核定位信號(hào)衣殼蛋白稀釋為0.1-10μg/ml，按100μl/孔加入可拆96孔酶標(biāo)板，37℃2小時(shí)，再4℃包被過(guò)夜，用1％BSA 37℃封閉2小時(shí)，以含0.05％吐溫-20的PBS(pH7.4)洗滌液充分洗滌，甩干。再加入20％蔗糖磷酸鹽緩沖液室溫保護(hù)3小時(shí)，置干燥室干燥后，用于PCV2抗體間接ELISA診斷試劑盒裝配。
(3)山羊抗豬IgG多克隆抗體的制備采取豬全血，分離血清，以飽和硫酸銨沉淀法粗提豬IgG。再經(jīng)DEAE纖維素離子交換層析純化獲得豬IgG純品。將純化的豬IgG蛋白按50～100μg/kg體重皮下和肌肉注射免疫健康山羊3～4次，末次免疫10天后，靜脈采血，以ELISA測(cè)定其血清抗體效價(jià)在1∶2000以上時(shí)，心臟采血或頸動(dòng)脈放血，收集高免血清；以飽和硫酸銨法純化山羊抗豬IgG抗體，不重述，再經(jīng)DEAE纖維素離子交換層析純化，收集濃縮羊抗豬多克隆抗體，用于制備PCV2抗體檢測(cè)試劑盒酶結(jié)合物工作液。
(4)酶結(jié)合物工作液的制備用改良過(guò)碘酸鈉法將辣根過(guò)氧化物(HRP)酶偶聯(lián)于山羊抗豬IgG多克隆抗體。用超純水1ml溶解辣根過(guò)氧化物酶(HRP，RZ≥3.0)5mg溶液，加入1ml 0.06M過(guò)碘酸鈉溶液4℃避光1小時(shí)，加入1ml 160mM乙二醇，室溫反應(yīng)30分鐘，加入PH4.4的醋酸緩沖液2-8℃透析過(guò)夜，換液兩次。將10mg純化的羊抗豬IgG加入上述活化的酶中，轉(zhuǎn)移至透析袋，于0.05mM PH9.6的碳酸緩沖液中透析，4℃攪拌過(guò)夜(換液兩次)。透析液吸至離心管中，加入5mg/ml的NaBH4液0.4ml，4℃反應(yīng)2小時(shí)。加入等量的飽和硫酸銨溶液，4℃30分鐘，4℃4000轉(zhuǎn)離心20分鐘，棄上清，瀝干。將沉淀溶于少量PBS，裝入透析袋中，對(duì)0.02M PBS(PH7.4)透析，4℃過(guò)夜。將透析液中液體吸至離心管中，離心，將上清液吸出，加等量甘油，混勻，-20℃保存。再以含0.1％BSA，0.05％吐溫-20，0.01％硫柳汞鈉的磷酸緩沖液(pH7.4)按1∶200-5000稀釋凍存的標(biāo)記酶作為酶結(jié)合物工作液。
(5)樣品稀釋液、洗滌液、終止液的配制樣品稀釋液為含0.05％吐溫-20的0.01M磷酸鹽緩沖液(KH2PO40.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，NaCl8g，定容至1000ml，pH7.4，再加0.5ml吐溫-20)；10×濃縮洗滌液為含0.5％吐溫-20的0.1M磷酸鹽緩沖液(KH2PO42g，Na2HPO4·12H2O 29g，NaCl80g，定容至1000ml，pH7.4，再加5ml吐溫-20)；終止液為2M硫酸溶液，即量取111.2ml濃硫酸(18M)稀釋定容至1000ml。
(6)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照的制備將篩選獲得的豬II型圓環(huán)病毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清用樣品稀釋液1∶100稀釋(OD450nm≥1.00)加入少量紅色顏料并按1000U/ml加入青霉素和鏈霉素，無(wú)菌過(guò)濾，作為PCV2抗體間接ELISA診斷試劑盒陽(yáng)性對(duì)照；將篩選獲得的豬標(biāo)準(zhǔn)陰性血清用樣品稀釋液1∶100稀釋(OD450nm≤0.150)，按1000U/ml加入青霉素和鏈霉素，無(wú)菌過(guò)濾，作為PCV2抗體間接ELISA診斷試劑盒陰性對(duì)照。
(7)顯色液的配制稱取200mg四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，用100ml無(wú)水乙醇或DMSO溶解后，以雙蒸水定容至1000ml，配制顯色液A；稱取21g一水檸檬酸，28.2g無(wú)水磷酸氫二鈉(Na2HPO4)，6.4ml 0.75％過(guò)氧化氫尿素，雙蒸水定容至1000ml，調(diào)pH值到4.5-5.0，配制顯色液B。
(8)試劑盒檢測(cè)操作程序其檢測(cè)程序?yàn)?)將10×濃縮洗滌液稀釋10倍即為洗滌液；2)將待檢血清用樣品稀釋液作1∶100稀釋，按100μl/孔加入抗體檢測(cè)板中，同時(shí)設(shè)空白(只加100μl樣品稀釋液)、陰性對(duì)照(PCV2陰性血清)、陽(yáng)性對(duì)照(PCV2標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清)，37℃孵育20-45分鐘，甩干；3)每孔加洗滌液200μl，洗滌6次，每次間隔1分鐘，拍干；4)每孔加100μl酶結(jié)合物工作液(空白不加)，37℃孵育20-45分鐘，甩干；5)每孔加洗滌液200μl，洗滌6次，每次間隔1分鐘，拍干；6)依次加50μl顯色液A和50μl顯色液B，混勻，37℃避光孵育5-15分鐘；7)加50μl終止液，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下讀取每孔光吸收值(OD450nm值)。
(9)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)判定標(biāo)準(zhǔn)以待檢樣本OD450nm值與標(biāo)準(zhǔn)陰性O(shè)D450nm值比值(P/N)，大于等于2.2判為陽(yáng)性，小于等于1.7為陰性。介于1.7-2.2之間為可疑，須重檢，重測(cè)時(shí)P/N值大于等于2.0判為陽(yáng)性，小于2.0為陰性。如果陽(yáng)性對(duì)照無(wú)明顯顯色反應(yīng)，或陰性對(duì)照出現(xiàn)顯色，表明試劑盒失效或檢測(cè)操作有誤，需重新檢測(cè)。
實(shí)施實(shí)例 PCV2抗體間接ELISA診斷試劑盒原理參見(jiàn)圖1，按實(shí)施例中(1)方法步驟制備重組PCV2 dCap蛋白，按實(shí)施例中(2)方法步驟制備PCV2抗體檢測(cè)板，按實(shí)施例中(3)(4)方法步驟制備PCV2抗體檢測(cè)試劑盒酶結(jié)合物工作液，按實(shí)施例中(5)方法步驟制備樣品稀釋液、洗滌液、終止液，按實(shí)施例中(6)方法步驟制備抗體檢測(cè)試劑盒陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，按實(shí)施例中(7)方法步驟制備顯色液A、顯色液B，最后，將各種組成成份裝配成PCV2抗體檢測(cè)試劑盒。
使用PCV2抗體間接ELISA診斷試劑盒檢測(cè)豬PCV2抗體或抗體水平時(shí)，將采集分離的豬血清，用樣品稀釋液作1∶100或梯度稀釋，制備待檢樣品溶液或梯度稀釋樣品溶液，將待檢樣品、陽(yáng)性和陰性對(duì)照分別加入抗原檢測(cè)板，按實(shí)施例中(8)中操作程序，室溫作用30分鐘，洗滌液洗滌，加酶結(jié)合物工作液，室溫作用30分鐘，同上洗滌，加入顯色液A，顯色液B各50μl，室溫避光顯色5min，滴加終止液50μl終止顯色反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測(cè)OD450nm值。按實(shí)施例中(9)中的判定標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。檢測(cè)孔OD450nm值與標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照OD450nm值比值(P/N)大于等于2.2判為陽(yáng)性。對(duì)于梯度稀釋樣品則檢測(cè)孔為陽(yáng)性的樣品最高稀釋度為該待檢血清的PCV2抗體滴度。如果PCV2陽(yáng)性對(duì)照無(wú)明顯顯色反應(yīng)，或陰性對(duì)照出現(xiàn)顯色，表明試劑盒失效或檢測(cè)操作有誤，需重新檢測(cè)。
權(quán)利要求
1.一種豬II型圓環(huán)病毒抗體間接ELISA診斷試劑盒，其特征在于試劑盒內(nèi)設(shè)有抗體檢測(cè)板，酶結(jié)合物工作液，陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照，樣品稀釋液，10×濃縮洗滌液，顯色液A，顯色液B和終止液，抗體檢測(cè)板為包被豬II型圓環(huán)病毒重組去核定位信號(hào)衣殼蛋白的可拆96孔酶標(biāo)板，酶結(jié)合物工作液為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗豬IgG多克隆抗體，陽(yáng)性對(duì)照為豬II型圓環(huán)病毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，陰性對(duì)照為豬標(biāo)準(zhǔn)陰性血清。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬II型圓環(huán)病毒抗體間接ELISA診斷試劑盒，其特征在于所說(shuō)的豬II型圓環(huán)病毒重組去核定位信號(hào)衣殼蛋白的制備為利用PCR技術(shù)擴(kuò)增豬II型圓環(huán)病毒去核定位信號(hào)的衣殼蛋白基因序列(衣殼蛋白基因3’端579bp的片段)，將其插入到原核表達(dá)載體pGEX-4T-1的谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因(GST)下游構(gòu)建pGEX-PCV2-dCap表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)0.1mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)并經(jīng)商用GST親和層析柱純化獲得豬II型圓環(huán)病毒重組去核定位信號(hào)衣殼蛋白，該蛋白保留了完整衣殼蛋白的抗原性，可與豬II型圓環(huán)病毒陽(yáng)性血清特異結(jié)合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬II型圓環(huán)病毒抗體間接ELISA診斷試劑盒，其特征在于所說(shuō)的抗體檢測(cè)板的最佳制備條件為，用pH8.5的0.05M Tris-HCl緩沖液作包被液，將豬II型圓環(huán)病毒重組去核定位信號(hào)衣殼蛋白稀釋為0.1-10μg/ml，按100μl/孔加入聚苯乙烯微孔板中，37℃2小時(shí)，再4℃包被過(guò)夜，甩干，按100μl/孔加入含1％牛血清白蛋白(BSA)，PH7.4的磷酸鹽緩沖液37℃封閉2小時(shí)，洗滌甩干，再加入20％蔗糖磷酸鹽緩沖液室溫保護(hù)3小時(shí)，置干燥室干燥后，裝入含干燥劑的包裝袋中保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬II型圓環(huán)病毒抗體間接ELISA診斷試劑盒，其特征在于所說(shuō)的酶結(jié)合物工作液的制備為用超純水配制辣根過(guò)氧化物酶(HRP，RZ≥3.0)溶液，加入0.06M過(guò)碘酸鈉溶液4℃避光1小時(shí)，加入160mM乙二醇，室溫反應(yīng)30分鐘，加入PH4.4的醋酸緩沖液1小時(shí)2-8℃透析過(guò)夜，換液兩次。將純化的羊抗豬IgG加入上述活化的酶中，轉(zhuǎn)移至透析袋，于0.05mMPH9.6的碳酸緩沖液中透析，4℃攪拌過(guò)夜(換液兩次)。透析液吸至離心管中，加新配的NaBH4液，4℃反應(yīng)2小時(shí)。加入等量的飽和硫酸銨溶液4℃30分鐘，4℃離心20分鐘，棄上清，瀝干。將沉淀溶于少量PBS，裝入透析袋中，對(duì)0.02MPBS(PH7.4)透析，4℃過(guò)夜。將透析液中液體吸至離心管中，離心，將上清液吸出，加等量甘油，混勻，-20℃保存。再以含0.1％BSA，0.05％吐溫-20，0.01％硫柳汞鈉，pH7.4的磷酸緩沖液按1∶200-5000稀釋凍存的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗豬IgG多克隆抗體作為酶結(jié)合物工作液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬II型圓環(huán)病毒抗體間接ELISA診斷試劑盒，其特征在于所說(shuō)的樣品稀釋液為含0.05％吐溫-20的0.01M磷酸鹽緩沖液(pH7.4)；10×濃縮洗滌液為含0.5％吐溫-20的0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.4)；顯色液A為0.2mg/ml的四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液，顯色液B為含0.5‰過(guò)氧化氫尿素的檸檬酸—磷酸鹽緩沖液；終止液為2M硫酸溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬II型圓環(huán)病毒抗體間接ELISA診斷試劑盒，其特征在于所說(shuō)的陽(yáng)性對(duì)照為經(jīng)篩選獲得的豬II型圓環(huán)病毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清(OD450nm≥1.00)加入少量紅色顏料并按1000U/ml加入青霉素和鏈霉素，無(wú)菌過(guò)濾；陰性對(duì)照為經(jīng)篩選獲得的豬標(biāo)準(zhǔn)陰性血清(OD450nm≤0.150)，按1000U/ml加入青霉素和鏈霉素，無(wú)菌過(guò)濾。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬II型圓環(huán)病毒抗體間接ELISA診斷試劑盒，其檢測(cè)程序?yàn)?)將10×濃縮洗滌液稀釋10倍即為洗滌液；2)將待檢血清用樣品稀釋液作1∶100稀釋，按100μl/孔加入抗體檢測(cè)板中，同時(shí)設(shè)空白(只加100μl樣品稀釋液)、陰性對(duì)照(PCV2陰性血清)、陽(yáng)性對(duì)照(PCV2標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清)，37℃孵育20-45分鐘，甩干；3)每孔加洗滌液200μl，洗滌6次，每次間隔1分鐘，拍干；4)每孔加100μl的酶結(jié)合物工作液(空白不加)，37℃孵育20-45分鐘，甩干；5)每孔加洗滌液200μl，洗滌6次，每次間隔1分鐘，拍干；6)依次加50μl顯色液A和50μl顯色液B，37℃避光孵育5-15分鐘；7)加50μl終止液，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下讀取每孔光吸收值(OD450nm值)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬II型圓環(huán)病毒抗體間接ELISA診斷試劑盒，其檢測(cè)樣本的判定標(biāo)準(zhǔn)為以待檢樣本OD450nm值與標(biāo)準(zhǔn)陰性O(shè)D450nm值的比值(P/N)，大于等于2.2判為陽(yáng)性，小于等于1.7為陰性。介于1.7-2.2之間為可疑，須重檢，重測(cè)時(shí)P/N值大于等于2.0判為陽(yáng)性，小于2.0為陰性。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種豬II型圓環(huán)病毒(PCV2)抗體間接ELISA診斷試劑盒。試劑盒內(nèi)設(shè)有抗體檢測(cè)板，酶結(jié)合物工作液，陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照，樣品稀釋液，10×濃縮洗滌液，顯色液A，顯色液B和終止液，該試劑盒的檢測(cè)板為包被PCV2重組去核定位信號(hào)衣殼蛋白(dCap)的可拆96孔酶標(biāo)板，酶結(jié)合物工作液為HRP標(biāo)記山羊抗豬IgG多克隆抗體，陽(yáng)性對(duì)照為豬PCV2標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，陰性對(duì)照為豬標(biāo)準(zhǔn)陰性血清。本發(fā)明有益的積極效果是檢測(cè)試劑盒、特異性強(qiáng)、敏感性高、操作簡(jiǎn)單，易于大范圍推廣應(yīng)用，具有廣闊的市場(chǎng)前景。
文檔編號(hào)G01N33/547GK1588076SQ200410066998
公開(kāi)日2005年3月2日 申請(qǐng)日期2004年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月28日
發(fā)明者周繼勇, 商紹彬, 申會(huì)剛, 陳慶新 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)