專利名稱：：香蕉苞片花葉病毒實(shí)時(shí)熒光rt-pcr檢測(cè)試劑及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及檢測(cè)香蕉苞片花葉病毒的生物制劑，具體涉及香蕉苞片花葉病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑及制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：香蕉苞片花葉病毒(Ba"a""6ra"wora/cv/n^，BBrMV)屬于馬鈴薯Y病毒屬，病毒粒子線形，長(zhǎng)660760nm，直徑12nm，主要侵染芭蕉屬植物。病毒侵染香蕉后，病葉上沿著葉柄產(chǎn)生深綠色或褐色的梭條斑，而病株花序苞片上則出現(xiàn)黑色斑點(diǎn)，能夠引起香蕉的減產(chǎn)和品質(zhì)下降。在自然條件下，BBrMV的傳播主要依賴蚜蟲的非持久性傳播，長(zhǎng)距離擴(kuò)散則隨感病植株的無(wú)性繁殖材料傳播。目前，BBrMV主要分布于菲律賓和印度等國(guó)，在國(guó)內(nèi)未見有分布，是我國(guó)新頒布的進(jìn)境植物檢疫性有害生物。香蕉苞片花葉病毒的檢測(cè)方法主要包括生物學(xué)鑒定、血清學(xué)檢測(cè)和逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)等。生物學(xué)鑒定方法耗工費(fèi)時(shí)，需要隔離溫室，檢測(cè)周期較長(zhǎng)；血清學(xué)方法常用的是雙抗體夾心酶聯(lián)檢測(cè)技術(shù)，適用于多樣本的初篩，具有操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，但其檢測(cè)靈敏度較低，且常常由于抗體制備的質(zhì)量問題而出現(xiàn)非特異性反應(yīng)。RT-PCR是用于檢測(cè)病毒核酸的技術(shù)方法，具有較好的敏感性和特異性，但需要進(jìn)行DNA電泳等PCR后處理，接觸有毒試劑溴化乙錠，易發(fā)生交叉污染而造成假陽(yáng)性結(jié)果。實(shí)時(shí)熒光RT-PCR(Real-timefluorescentRT-PCR)是近幾年發(fā)展起來(lái)的RT-PCR技術(shù)與熒光檢測(cè)相結(jié)合的方法，其原理是使用能特異標(biāo)記核苷酸序列的熒光物質(zhì)，利用熒光信號(hào)的積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR過程，具有檢測(cè)周期短、特異性與靈敏度高以及無(wú)需PCR后處理等優(yōu)點(diǎn)。以TaqMan水解探針為例，探針一端標(biāo)記熒光基團(tuán)，另一端標(biāo)記淬滅基團(tuán)，通常狀態(tài)下，熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，熒光基團(tuán)的熒光被淬滅基團(tuán)吸收。當(dāng)PCR進(jìn)入退火階段時(shí)，熒光探針特異的結(jié)合在兩條引物之間，在延伸階段被聚合酶的5'端外切酶活性切開。熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，儀器檢測(cè)出熒光。熒光PCR儀在反應(yīng)過程中連續(xù)的檢測(cè)熒光信號(hào)的變化，當(dāng)熒光信號(hào)增強(qiáng)到某一閾值時(shí)，此時(shí)的循環(huán)次數(shù)(Ct)就被記錄下來(lái)。由于熒光信號(hào)伴隨著PCR模板的擴(kuò)增而增長(zhǎng)，因此可以根據(jù)熒光信號(hào)是否增長(zhǎng)來(lái)確定模板是否擴(kuò)增。因此，研究建立特異、快速、可對(duì)低含量BBrMV病毒侵染、隱性感染或持續(xù)帶毒寄主進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)的方法，在檢疫、診斷、分子流行病學(xué)研究等方面具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種對(duì)香蕉苞片花葉病毒具有特異性高、敏感性強(qiáng)和快速檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑。本發(fā)明還提供了該檢測(cè)試劑的制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為系選擇香蕉苞片花葉病毒CP編碼基因的保守片段為靶目標(biāo)，應(yīng)用primerExpress3.0軟件，設(shè)計(jì)合成引物和探針；將設(shè)計(jì)的多對(duì)引物和探針進(jìn)行最佳配對(duì)篩選實(shí)驗(yàn)，得到最合適的引物和探針。本發(fā)明所述的香蕉苞片花葉病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑包含一對(duì)特異性引物和一條特異性熒光探針，擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸序的片段長(zhǎng)度為74bp，引物和探針序列為弓I凈勿B(yǎng)BrMVTF:5'陽(yáng)caaaaactacgaacagggctagaga陽(yáng)3'BBrMVTR:5'-ccgagtgtttgatccacgaa-3'探,十5'-FAM-cacacacgcagatgaaagctgcagc-Eclipse-3'。本發(fā)明所述的香蕉苞片花葉病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑的制備方法，由下述歩驟組成一、選擇香蕉苞片花葉病毒CP編碼基因的保守片段為靶目標(biāo)，該保守片段的擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸序列為caaaaactacgaacagggctagagaagcacacacgcagatgaaagctgca50gctattcgtggatcaaacactcgg74二、應(yīng)用primerExpress3.0軟件，設(shè)計(jì)合成引物和探針；三、引物和探針的合成采用卩一乙腈磷酸胺化學(xué)合成法，使用全自動(dòng)DNA合成儀進(jìn)行01igoDNA的合成；四、探針合成同時(shí)進(jìn)行兩端熒光標(biāo)記，探針5'端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM，3'端標(biāo)記的是不發(fā)熒光的淬滅基團(tuán)Eclipse;熒光報(bào)告基團(tuán)FAM也可以用TET、VIC、JOE等發(fā)光基團(tuán)代替；五、將設(shè)計(jì)合成的多對(duì)引物和探針進(jìn)行最佳配對(duì)篩選實(shí)驗(yàn)后，初歩確定候選引物和探針；六、經(jīng)過大量的反應(yīng)條件優(yōu)選、對(duì)比試驗(yàn)和驗(yàn)證試驗(yàn)，并經(jīng)過大量實(shí)際樣品的檢測(cè)應(yīng)用評(píng)估，得到擴(kuò)增效率和特異性好的所述的引物和所述的探針。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于香蕉苞片花葉病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑是將RT-PCR技術(shù)與熒光檢測(cè)相結(jié)合，構(gòu)建并篩選出上述擴(kuò)增效率和特異性好的一對(duì)引物和一條探針，克服了常規(guī)RT-PCR費(fèi)時(shí)、易污染以及擴(kuò)增后需電泳檢測(cè)等缺點(diǎn)，可對(duì)樣品中的BBrMV進(jìn)行快速準(zhǔn)確的定性檢測(cè)，具有簡(jiǎn)單、易操作、結(jié)果直觀、敏感性高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。具體優(yōu)點(diǎn)如下1、本發(fā)明與常規(guī)RT-PCR的檢測(cè)試劑相比，具有特異、敏感的優(yōu)點(diǎn)；本發(fā)明可對(duì)樣品中低含量的BBrMV病毒、隱性感染或持續(xù)帶毒寄主進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)，是一種非常適合BBrMV檢測(cè)的試劑。2、本發(fā)明與常規(guī)RT-PCR的檢測(cè)試劑相比，具有適用范圍廣，使用安全的優(yōu)點(diǎn)；可對(duì)果實(shí)、種子、葉片、莖稈、土壤、媒介昆蟲等多種樣品中的BBrMV進(jìn)行快速檢領(lǐng)ij，適用范圍廣；本發(fā)明克服了常規(guī)RT-PCR的產(chǎn)物須電泳檢測(cè)、接觸有毒試劑的缺點(diǎn)，降低了生物安全隱患，提高了使用安全性。3、本發(fā)明與常規(guī)RT-PCR的檢測(cè)試劑相比，具有檢測(cè)量大和快速的優(yōu)點(diǎn)；可同時(shí)進(jìn)行大量樣品檢測(cè)，具有高通量性，可減少RNA、cDNA或PCR產(chǎn)物污染的風(fēng)險(xiǎn)；常規(guī)RT-PCR的檢測(cè)時(shí)間一般6小時(shí)以上，本發(fā)明無(wú)需擴(kuò)增后的電泳分析，樣品檢測(cè)時(shí)間在4小時(shí)之內(nèi)。更重要的是實(shí)時(shí)熒光RT-PCR特別適用于保存時(shí)間長(zhǎng)而無(wú)法進(jìn)行分離病毒的大批量樣品的檢測(cè)。4、與常規(guī)RT-PCR相比，實(shí)時(shí)熒光RT-PCR依靠?jī)x器做出客觀的估計(jì)，判斷出陽(yáng)性、陰性和可疑結(jié)果，Ct值為40.0可確定為陽(yáng)性和陰性的臨界值。5、本試劑所組成的試劑盒可在收到樣品后4小時(shí)之內(nèi)作出定性檢測(cè)結(jié)果。該實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試劑盒是一種檢測(cè)實(shí)際樣品中BBrMV的特異、敏感和穩(wěn)定的方法。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。K設(shè)計(jì)引物和探針本發(fā)明選擇BBrMV外殼蛋白編碼基因的保守片段為靶目標(biāo)，通過GenBank中報(bào)道的BBrMV各株系的CP編碼基因序列進(jìn)行同源性分析比較，選定BBrMV特征基因的保守片段(74bp)，應(yīng)用primerExpress3.0軟件，設(shè)計(jì)引物和探針。引物和探針的合成采用卩一乙腈亞磷酸胺化學(xué)合成法，使用全自動(dòng)DNA合成儀進(jìn)行OligoDNA的合成探針，合成同時(shí)進(jìn)行兩端熒光標(biāo)記，探針5'端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM，3'端標(biāo)記的是不發(fā)熒光的淬滅基團(tuán)Eclipse。將設(shè)計(jì)合成的多對(duì)引物和探針進(jìn)行最佳配對(duì)篩選實(shí)驗(yàn)后，確定擴(kuò)增效率和特異性最好的一對(duì)引物和一條探針。2、RNA提取取100pL體積的研磨勻漿樣品上清液，加入700Trizol試劑，室溫振蕩充分混勻5min，加入200pL氯仿，充分顛倒混勻15sec，12000r/min(4°C)離心10min，小心吸取上清，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻后室溫靜置10min，12000r/min(4°C)離心10min，棄上清，沉淀用70%乙醇洗滌一次，干燥后溶于20經(jīng)焦碳酸二乙酯(DEPC)處理過的雙蒸水中。3、BBrMV實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增BBrMV實(shí)時(shí)熒光RT-PCR采用25pL體積反應(yīng)液，在ABI7000型實(shí)時(shí)熒光PCR儀中，按下列反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行42'C反轉(zhuǎn)錄5min，95。C預(yù)變性10sec;95。C變性5sec，60°C延伸31sec，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。引物和探針的濃度進(jìn)行精確篩選，以獲得最低的Ct值和較高的熒光強(qiáng)度增加值(ARn)。每次檢測(cè)時(shí)，設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照采用感染BBrMV的葉片，經(jīng)Trizol試劑方法提取得到的含有BBrMV核酸的總RNA;陰性對(duì)照采用健康香蕉組織，經(jīng)Trizol試劑方法提取得到的植物組織總RNA。每個(gè)樣品檢測(cè)做3管平行試驗(yàn)。在陰性對(duì)照為陰性、陽(yáng)性對(duì)照為陽(yáng)性時(shí)，整個(gè)試驗(yàn)有效，可進(jìn)一歩判斷結(jié)果。每個(gè)樣品須作多個(gè)備份，以進(jìn)行穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)。4、BBrMV實(shí)時(shí)熒光RT-PCR的特異性和敏感性試驗(yàn)采用馬鈴薯Y病毒(PototoWmsy,PVY)、李痘病毒(P/wwpoxWmy,PPV)、小麥線條花葉病毒(Wfea"fre"A:vZmy,WSMV)、李屬壞死環(huán)斑病毒(iVw"wswecra〃cn'"g^w/wV斷PNRSV)、桃叢簇花葉病毒(Peac/zro化從wo加/cWn^，PRMV)以及健康香蕉組織進(jìn)行特異性比較檢測(cè)。對(duì)感染BBrMV的葉片樣品，采用Trizol試劑方法提取得到含有BBrMV核酸的總RNA，用常規(guī)RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)，比較它們的敏感性，常規(guī)RT-PCR采用的引物與實(shí)時(shí)熒光RT-PCR的引物一致。5、BBrMV實(shí)時(shí)熒光RT-PCR的穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗(yàn)在評(píng)估實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)BBrMV方法中的組內(nèi)和組間試驗(yàn)的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性時(shí)，用陽(yáng)性樣品和陰性樣品，在同樣反應(yīng)條件下，反復(fù)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)，每次試驗(yàn)的每個(gè)樣品做6個(gè)平行的反應(yīng)管，重復(fù)12次。6、引物和探針及其濃度的篩選選擇引物、探針、模板的最佳濃度配比，獲得實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)的最低Ct值和最高ARii，提高擴(kuò)增效率和敏感性。應(yīng)用不同RNA模板濃度的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性樣品，對(duì)設(shè)計(jì)的引物與探針，選用50nM、100nM、200nM、300nM、400nM和500nM的使用終濃度，采用矩陣法優(yōu)選引物和探針的最佳濃度。7、對(duì)樣品的檢測(cè)對(duì)進(jìn)境香蕉樣品、PVY、PPV、WSMV、PNRSV、PRMV以及健康香蕉組織進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果表明，陽(yáng)性樣品均具有典型的擴(kuò)增曲線，Ct值小于35.0，陰性對(duì)照及陰性樣品均無(wú)典型擴(kuò)增曲線，也無(wú)Ct值。三個(gè)平行試驗(yàn)的結(jié)果穩(wěn)定一致。證明實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)BBrMV的特異性強(qiáng)、敏感度高和重復(fù)性好。8、BBrMV實(shí)時(shí)熒光RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)化試劑盒和檢測(cè)程序8.1按如下表配置標(biāo)準(zhǔn)化試劑盒組份(25pL反應(yīng)X100次):溶液I(Trizol)35mLX2瓶溶液II(2X—步RT-PCR緩沖液，含引物和探針)1.25mL溶液III(TaqDNA聚合酶，5U/pL)50n乙溶液IV(RNA酶抑制劑和逆轉(zhuǎn)錄酶混合液)50nL溶液V(DEPC處理水)1.25mLX2支陽(yáng)性對(duì)照(含有BBrMV的植物組織凍干粉)0.2克陰性對(duì)照(不含有BBrMV的植物組織凍干粉)0.2克按照優(yōu)化的反應(yīng)條件配制。8.2操作方法8.2.1總RNA提取(1)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照與樣品的總RNA提取過程一致。取0.110克組織樣品，按l:10(克mL)加入蒸餾水，充分研磨勻漿，2000r/min，4°C，離心10min。(2)取100pL上清液加入700pL溶液I，充分振蕩混勻，室溫靜置5min，徹底裂解。(3)加200pL氯仿，小心蓋上帽蓋，用力快速振蕩15sec。12000r/min，4'C，離心10min。(4)小心吸取上層水相，轉(zhuǎn)移至一新的1.5mL管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻后室溫靜置10min。12000r/min，4°C，離心10min，棄上清液。(5)沉淀用70%乙醇洗滌一次，晾干后，溶于20^L經(jīng)焦碳酸二乙酯(DEPC)處理過的雙蒸水中?？芍苯佑糜跀U(kuò)增或-7(TC保存?zhèn)溆谩?.2.2反應(yīng)組份配制(1)取一支200^L光學(xué)pcr反應(yīng)管，反應(yīng)總體積為25hL，向反應(yīng)管中加入下列表中的反應(yīng)物:<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(2)設(shè)立對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照各設(shè)2管。8.2.3擴(kuò)增在ABI7000型實(shí)時(shí)熒光PCR儀中，按下列反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行42t:反轉(zhuǎn)錄5min，95°C預(yù)變性10sec;95。C變性5sec，60。C延伸31sec，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。8.2.4結(jié)果分析和判定(1)結(jié)果分析條件設(shè)定閾值線設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)。(2)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)——陰性對(duì)照無(wú)Ct值，并且無(wú)典型擴(kuò)增曲線。——陽(yáng)性對(duì)照的Ct值應(yīng)小于35.0，并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，2個(gè)陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增曲線基本重合，特別是在熒光臨界值(Ct值)附近。否則，此次實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。(3)結(jié)果描述及判定——陰性無(wú)ct值或無(wú)擴(kuò)增曲線，表示樣品中無(wú)香蕉苞片花葉病毒?！?yáng)性Ct值應(yīng)小于等于35.0，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，表示樣品中存在香蕉苞片花葉病毒。——有效原則Ct值在35.0~40.0的樣本建議重做。重做結(jié)果無(wú)Ct值或無(wú)典型擴(kuò)增曲線判為陰性，否則判為陽(yáng)性。<110>寧波檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院<120>香蕉苞片花葉病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑及制備方法和應(yīng)用<160>4<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>25<212>RNA<213>人工序列<220><223>用于檢測(cè)香蕉苞片花葉病毒的特異性熒光探針序列<400>15'-FAM-cacacacgcagatgaaagctgcagc-Eclipse-3'25<210>2<211>25<212>RNA<213>人工序列<220><223>用于檢測(cè)香蕉苞片花葉病毒的特異性引物BBrMVTF序列<400>25'-caaaaactacgaacagggctagaga-3'25<210〉3<211>20<212>RNA<213>人工序列<220>〈223〉用于檢測(cè)香蕉苞片花葉病毒的特異性引物BBrMVTR序列<400>35'-ccgagtgtttgatccacgaa陽(yáng)3'20<210>4<211>74<212>RNA<213>香蕉苞片花葉病毒的保守片段<400>4caa認(rèn)ctacg雄鄉(xiāng)gctagagaagcacacacgcagatg腿gctgca50gctattcgtggatcaaacactcgg7權(quán)利要求1、香蕉苞片花葉病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑，其特征在于包含一對(duì)特異性引物和一條特異性熒光探針，擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸序列的片段長(zhǎng)度為74bp，引物和探針序列為如下所示引物BBrMVTF5′-caaaaactacgaacagggctagaga-3′BBrMVTR5′-ccgagtgtttgatccacgaa-3′探針5′-FAM-cacacacgcagatgaaagctgcagc-Eclipse-3′。2、制備權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試劑的方法，其特征在于由下述步驟組成(1)選擇香蕉苞片花葉病毒CP編碼基因的保守片段為靶目標(biāo)，該保守片段的擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸序列為caaaaactacgaacagggctagagaagcacacacgcagatgaaagctgca50gctattcgtggatcaaacactcgg74(2)應(yīng)用primerExpress3.0軟件，設(shè)計(jì)合成引物和探針；(3)引物和探針的合成采用P—乙腈磷酸胺化學(xué)合成法，使用全自動(dòng)DNA合成儀進(jìn)行01igoDNA的合成；(4)探針合成同時(shí)進(jìn)行兩端熒光標(biāo)記，探針5'端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM,3'端標(biāo)記的是不發(fā)熒光的淬滅基團(tuán)Eclipse;(5)將設(shè)計(jì)合成的多對(duì)引物和探針進(jìn)行最佳配對(duì)篩選實(shí)驗(yàn)后，初步確定候選引物和探針；(6)經(jīng)過大量的反應(yīng)條件優(yōu)選、對(duì)比試驗(yàn)和驗(yàn)證試驗(yàn)，并經(jīng)過大量實(shí)際樣品的檢測(cè)應(yīng)用評(píng)估，得到擴(kuò)增效率和特異性好的所述的引物和探針。3、權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試劑在制備BBrMV實(shí)時(shí)熒光RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)化試劑盒中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了香蕉苞片花葉病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑及制備方法和應(yīng)用，系選擇香蕉苞片花葉病毒特異且各株系之間比較保守的CP編碼基因片段為靶目標(biāo)序列，經(jīng)過精心設(shè)計(jì)并合成，包含一對(duì)特異性引物和一條特異性熒光探針，擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸序列的片段長(zhǎng)度為74bp，引物序列為BBrMVTF5′-caaaaactacgaacagggctagaga-3′，BBrMVTR5′-ccgagtgtttgatccacgaa-3′，探針序列為5′-FAM-cacacacgcagatgaaagctgcagc-Eclipse-3′；本發(fā)明克服了常規(guī)RT-PCR費(fèi)時(shí)、易污染以及擴(kuò)增后需電泳檢測(cè)等缺點(diǎn)，可對(duì)樣品中的BBrMV進(jìn)行快速準(zhǔn)確的定性檢測(cè)，具有簡(jiǎn)單、易操作、結(jié)果直觀、敏感性高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。文檔編號(hào)G01N21/64GK101591716SQ20091009958公開日2009年12月2日申請(qǐng)日期2009年6月12日優(yōu)先權(quán)日2009年6月12日發(fā)明者楊文潮,聞偉剛申請(qǐng)人:寧波檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院