專利名稱：：熒光定量pcr檢測(cè)馬秋波病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供一種利用熒光定量PCR檢測(cè)馬秋波病毒的方法。
背景技術(shù)：
：馬秋波病毒(machupovirus,MACV)屬于沙粒病毒屬(Arenavirus)，有包膜，毒粒呈多型性，大小為80150nm。1963年首次在玻利維亞委內(nèi)瑞拉暮鼠(Calomyscallosus)中分離到的。病毒基因組為單負(fù)鏈RNA雙環(huán)，分節(jié)段，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)復(fù)制。幾乎所有的沙粒病毒都能引起嚙齒類動(dòng)物持續(xù)性感染。馬秋波病毒被視為沙粒病毒屬中新世界病毒的代表之一。它與胡寧病毒(Junin)、瓜納里托病毒(Guanarito)是引起人出血熱重要病毒，主要癥狀表現(xiàn)為發(fā)燒、乏力、肌肉酸痛、厭食等，3-4天后會(huì)伴隨頭痛頭暈、惡心和嚴(yán)重衰竭，潛伏期在1-2周。其高致病性和致死率不低于30%。雖然，我國(guó)還未發(fā)現(xiàn)感染馬秋波病毒的病例存在，但是隨著全球經(jīng)濟(jì)一體化和貿(mào)易自由化，國(guó)外的醫(yī)學(xué)媒介生物通過先進(jìn)的交通工具和國(guó)際貿(mào)易，可以迅速把傳染病從一個(gè)國(guó)家或地區(qū)傳向全球，造成國(guó)際間傳播。傳染病在國(guó)際間的廣泛傳播與流行，已成為各國(guó)政府密切關(guān)注的政治問題?！秶?guó)際衛(wèi)生條例》、《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生檢疫法》、都對(duì)傳染病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警與快速?zèng)Q策做出了相應(yīng)的規(guī)定。我國(guó)在“十一五”期間將傳染病防控提升到戰(zhàn)略的角度，予以高度重視。目前，針對(duì)外來(lái)疫病的實(shí)驗(yàn)室快速檢測(cè)技術(shù)主要采用的是免疫學(xué)檢測(cè)及核酸檢測(cè)技術(shù)，尤其是以PCR技術(shù)為代表的核酸檢測(cè)技術(shù)，能夠非常靈敏的檢測(cè)到各種疫病病原體。但是由于PCR擴(kuò)增技術(shù)經(jīng)常帶來(lái)特異性問題，各國(guó)科學(xué)家和技術(shù)人員都在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上，結(jié)合其它新技術(shù)，努力改善PCR技術(shù)的特異性和敏感度。近年來(lái)，基于PCR技術(shù)及ABITaqman探針雜交技術(shù)發(fā)展起來(lái)的實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)極大地改善了傳統(tǒng)PCR技術(shù)的特異性和敏感性以及抗污染的能力，已經(jīng)越來(lái)越廣泛的應(yīng)用到各種疫病的檢驗(yàn)檢疫中。隨著探針技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展完善，一種新型的HydroEasyProbes的出現(xiàn)，能夠有效的改進(jìn)Taqman探針本底信號(hào)高的缺點(diǎn)，并且進(jìn)一步提高檢測(cè)的靈敏度。本發(fā)明擬采用新型HydroEasyProbes設(shè)計(jì)技術(shù)，開展馬秋波病毒的熒光PCR檢測(cè)試劑研究，使之成為應(yīng)對(duì)外來(lái)疫病傳入我國(guó)的有力武器，保障人民群眾的生命安全和國(guó)家的衛(wèi)生安全。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種馬秋波病毒的熒光定量PCR檢測(cè)方法。該方法利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)，設(shè)計(jì)了一對(duì)引物和探針對(duì)病毒樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測(cè)。檢測(cè)特異性好，靈敏度高。本發(fā)明檢測(cè)方法首先包括獲得檢測(cè)馬秋波病毒的引物和探針的步驟，該步驟具體為⑴篩選馬秋波病毒S片段全長(zhǎng)序列，進(jìn)行同源性比對(duì)，在其保守區(qū)設(shè)計(jì)引物；(2)根據(jù)PCR擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)的核苷酸序列設(shè)計(jì)特異性探針，并提交至GENEBANK中檢測(cè)探針的特異性；(3)對(duì)待檢測(cè)物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析。在本發(fā)明上述方法中，所篩選的馬秋波病毒可以是NCBI公布的所有馬秋波病毒S片段全長(zhǎng)序列。另外，本發(fā)明的方法中，可以利用DNASTiAR軟件進(jìn)行序列的同源性比對(duì)。比對(duì)結(jié)果見圖1。圖中陰影部分為S基因序列高保守區(qū)。在本發(fā)明引物和探針設(shè)計(jì)中，首先在比對(duì)的序列保守區(qū)設(shè)計(jì)上下游引物，根據(jù)引物設(shè)計(jì)原理，在保守區(qū)之間設(shè)計(jì)上游和下游引物，其中在上游引物的第16位存在簡(jiǎn)并性，下游引物的第14位存在簡(jiǎn)并性，設(shè)計(jì)位于擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)的特異的探針，其中在探針的第1位和第30位分別存在簡(jiǎn)并性。引物和探針在合成時(shí)，探針5'端連接FAM熒光基團(tuán)，3'端連接BHQ非熒光基團(tuán)。引物的特異性增強(qiáng)。引物和探針序列見表1。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>表2為利用軟件分析設(shè)計(jì)的引物和探針的參數(shù)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>本發(fā)明檢測(cè)方法其次包括檢測(cè)馬秋波病毒的步驟，該步驟具體為(1)核酸提取病毒RNA提取選用QIAampMinikit52906病毒RNA提取試劑盒。<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>本發(fā)明所述的方法中，探針與熒光基團(tuán)相連，所述熒光基團(tuán)為FAM-BHQ，其它熒光基團(tuán)也同樣適用，比如，F(xiàn)AM-TAMARA,MGB等。所述RT-PCR反應(yīng)可使用的儀器包括ABI實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(例如7000，7300，7500，7900等)；BioRad實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)、Stratagene定量多聚酶鏈反應(yīng)儀(例如MX4000，MX3000,MX3005)。圖1為DNASTAR軟件分析S片段全長(zhǎng)基因的同源性區(qū)域。圖2為引物靈敏度的檢測(cè)結(jié)果。選用S片段全長(zhǎng)基因中保守片段作為標(biāo)準(zhǔn)品。圖中為病毒RNA各個(gè)濃度梯度擴(kuò)增后，熒光強(qiáng)度隨反應(yīng)循環(huán)數(shù)變化的曲線，其中，橫坐標(biāo)為循環(huán)次數(shù)，縱坐標(biāo)代表相應(yīng)的校正后報(bào)告熒光強(qiáng)度(Rn)。圖3為用本發(fā)明建立的模擬添加實(shí)驗(yàn)進(jìn)行特異性以及靈敏度檢測(cè)的結(jié)果。其中，X軸表示循環(huán)次數(shù)，Y軸表示相應(yīng)的校正后報(bào)告熒光強(qiáng)度。圖4為用本發(fā)明建立的方法對(duì)未知樣本的RNA進(jìn)行檢測(cè)。其中，X軸表示循環(huán)次數(shù)，Y軸表示相應(yīng)的校正后報(bào)告熒光強(qiáng)度。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1引物靈敏度檢測(cè)1)選擇已知樣本S片段全長(zhǎng)基因中高保守區(qū)片段做為標(biāo)準(zhǔn)品，將其病毒RNA濃度從KT1依次稀釋到10,；2)陰性對(duì)照無(wú)核酸酶水；3)反應(yīng)體系按照表3進(jìn)行配制。檢測(cè)結(jié)果如圖2、表4所示。圖2中，1-9曲線分別為標(biāo)準(zhǔn)品用無(wú)核酸酶水濃度稀釋度為IiT1-IO-9擴(kuò)增的曲線。表4為引物靈敏度檢測(cè)結(jié)果，表中所示的數(shù)據(jù)為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品不同稀釋度的CT值。其中，CT值結(jié)果為“-”表示該引物對(duì)此濃度的樣本無(wú)擴(kuò)增反應(yīng)。NTC為陰性對(duì)照。從圖2和表4中可以看出，引物和探針檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的最低檢出限為10Λ表4<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實(shí)施例2樣品模擬添加實(shí)驗(yàn)1)將任意鼠肺RNA添加到陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品RNA，進(jìn)行梯度稀釋依次從KT1-IO,；2)陰性對(duì)照非陽(yáng)性鼠肺RNA；3)反應(yīng)體系按照表3進(jìn)行配制。檢測(cè)結(jié)果如圖3、表5所示。圖3中1-5曲線分別為標(biāo)準(zhǔn)品濃度稀釋度為KT1-IO-5擴(kuò)增的曲線。從圖中可以看出，引物和探針檢測(cè)用非陽(yáng)性鼠肺RNA稀釋陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的最低檢出限為10_4。表5中所示的數(shù)據(jù)為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品用非陽(yáng)性鼠肺RNA稀釋為不同梯度的CT值。其中CT值結(jié)果為“-”表示該引物對(duì)此濃度的樣本無(wú)擴(kuò)增反應(yīng)。NTC為陰性對(duì)照。從這個(gè)實(shí)驗(yàn)中可以考察到陽(yáng)性樣品中病毒RNA的最低檢出限。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實(shí)施例3引物檢測(cè)未知樣本1)對(duì)采集的未知樣本進(jìn)行檢測(cè)，篩選馬秋波病毒同時(shí)監(jiān)測(cè)引物的非特異性；2)陽(yáng)性對(duì)照病毒標(biāo)準(zhǔn)品RNA濃度為10_3；3)陰性對(duì)照非陽(yáng)性鼠肺RNA；4)反應(yīng)體系按照表3進(jìn)行配制。檢測(cè)結(jié)果見圖4及表6。圖4中只出現(xiàn)了一條擴(kuò)增曲線為陽(yáng)性對(duì)照，其余樣本均無(wú)擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)果為陰性。PTC為陽(yáng)性對(duì)照。表6中的數(shù)據(jù)顯示，檢測(cè)未知樣本結(jié)果均為陰性。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>結(jié)果分析擴(kuò)增反應(yīng)完成40個(gè)循環(huán)之后，引物靈敏度檢測(cè)到的病毒RNA濃度稀釋度為10_9；任意非陽(yáng)性鼠肺RNA添加到陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品RNA梯度稀釋，稀釋度為10_4；從采集到的未知樣品檢測(cè)結(jié)果均為陰性。結(jié)果判斷當(dāng)待檢測(cè)樣本的Ct(閾值)(36時(shí)即判為陽(yáng)性。權(quán)利要求一種對(duì)馬秋波病毒的熒光定量PCR檢測(cè)方法，其特征在于，該方法利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)，通過設(shè)計(jì)一對(duì)引物和探針對(duì)病毒樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測(cè)，所設(shè)計(jì)引物和探針序列如下2.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，該方法包括引物和探針的獲得，對(duì)馬秋波病毒的檢測(cè)；其中，引物和探針的獲得步驟為(1)篩選馬秋波病毒S片段全長(zhǎng)序列，進(jìn)行同源性比對(duì)，并在其保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，(2)根據(jù)PCR擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)的核苷酸序列設(shè)計(jì)特異性探針，并提交GENEBANK檢測(cè)探針的特異性；對(duì)馬秋波病毒的檢測(cè)步驟為首先提取病毒核酸，然后進(jìn)行病毒核酸的RT-PCR擴(kuò)增，最后利用所設(shè)計(jì)的引物和探針對(duì)待檢測(cè)物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。3.如權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述RT-PCR擴(kuò)增具體為配制一定組分濃度的25μLPCR反應(yīng)體系。4.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述樣本包括鼠肺RNA。5.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，在所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)中，所述探針上連接的熒光基團(tuán)包括FAM-BHQ、MGB、FAM-TAMARA。6.如權(quán)利要求5所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述RT-PCR反應(yīng)通過使用ABI實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)、BioRad實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)、Stratagene定量多聚酶鏈反應(yīng)儀來(lái)完成。全文摘要本發(fā)明公開了一種檢測(cè)馬秋波病毒熒光定量PCR檢測(cè)方法，該方法包括引物和探針的獲得及馬秋波病毒的檢測(cè)。本發(fā)明具有特異性好，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。目前，該檢測(cè)方法國(guó)內(nèi)外還沒有相關(guān)的報(bào)道。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101805802SQ20101014646公開日2010年8月18日申請(qǐng)日期2010年4月12日優(yōu)先權(quán)日2010年4月12日發(fā)明者姚李四,張曉龍,燕清麗申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院