專利名稱：：猴泡沫病毒的實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
中病毒的分子生物學(xué)檢測(cè)方法，特別是涉及猴泡沫病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
：猴泡沫病毒(SiminaFoamyViruses,SFV)的傳染源主要為大猩猩、非洲大狒狒、長(zhǎng)尾猴，主要存在于非洲、美洲和亞洲，在經(jīng)常接觸非人靈長(zhǎng)類(non-humanprimates,NHPs)人群中的傳播時(shí)有發(fā)生。SFV通過體液進(jìn)行傳播，可以遺傳給后代。動(dòng)物工作者中，SFV感染比猴免疫缺陷病毒(SIV)感染更為普遍，而且潛伏期較長(zhǎng)。SFV雖然不會(huì)對(duì)靈長(zhǎng)類動(dòng)物致病，但在物種間的傳播會(huì)引起致病性的改變，SFV的感染對(duì)人類來說意義重大。SFV的致病性研究一直受到各國(guó)學(xué)者的關(guān)注，有學(xué)者認(rèn)為其有可能對(duì)人類致病，也有報(bào)道其不明顯的致病作用使得SFV成為逆轉(zhuǎn)錄病毒基因轉(zhuǎn)移載體而被用于基因治療。近來有研究人員提出病毒從靈長(zhǎng)類動(dòng)物傳染給人的頻率要比原先預(yù)想的高。因此，對(duì)SFV的研究越來越受到專家們的高度重視。Wolfe等人對(duì)喀麥隆9個(gè)叢林地區(qū)的1100名獵人進(jìn)行篩查時(shí)，在接觸過大猩猩、非洲大狒狒和長(zhǎng)尾猴等動(dòng)物體液的10個(gè)人的血液中發(fā)現(xiàn)一種病毒抗體。由于這種病毒和艾滋病病毒非常相似，傳染途徑也和艾滋病病毒類似，有專家稱其為“準(zhǔn)艾滋病病毒”。ffolfe通過分析比較感染者血液中的病毒基因組序列，發(fā)現(xiàn)“準(zhǔn)艾滋病病毒”是一種猴泡沫病毒，并第一次證明這種逆轉(zhuǎn)錄病毒可以傳染給人類，而且在人類宿主中能持續(xù)存在(WolfeND,SwitzerWM,CarrJK,etal.NaturallyacquiredsimianretrovirusinfectionsincentralAfricanhunters.Lancet,2004,363:932937.)。SFV屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retrovidae)，泡沫病毒亞科(Spumavirinae)。泡沫病毒(FoamyVirus,FV)有11個(gè)血清型，而感染恒河猴的主要是1型猴泡沫病毒(SFV-I)。現(xiàn)已在幾種靈長(zhǎng)類動(dòng)物體內(nèi)分離到SFV，包括SFV-I型、SFV-3型、SFV-6型和黑猩猩的猴泡沫病毒(SFVcpz)οSFV為單正鏈RNA病毒，是迄今發(fā)現(xiàn)的基因組最長(zhǎng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒。SFV_1、SFV_3基因組RNA分別為11.52kb、ll.62kb，前病毒eDNA為12_13kb。其基因組結(jié)構(gòu)為兩端為長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)，中間部分有g(shù)ag、p0l、env三個(gè)結(jié)構(gòu)基因，從5'端到3'端以gag-pol-env二聚體形式裝配在病毒粒子中。其中，pol編碼逆轉(zhuǎn)錄酶，gag編碼病毒殼蛋白，env編碼囊膜糖蛋白。加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)用猴和猴源性生物制品的病毒檢測(cè)不僅可以保證疫苗等生物制品的安全性，同時(shí)也減少了人類的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染率。目前，國(guó)內(nèi)外一系列高敏感性的檢測(cè)方法已用于檢測(cè)動(dòng)物SFV的感染狀況，以及分析猴源性生物制品(如減毒活疫苗)的SFV污染情況。PCR技術(shù)由于其快速、安全且具有較高敏感性和特異性等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用。任麗虹等人建立了猴血中SFV基因PCR檢測(cè)方法(任麗虹，白巍，林凌.猴血中SFV病毒基因PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用.中國(guó)病毒學(xué)，2001，16(2):179-182.)。李華等在評(píng)價(jià)脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗的安全性中，用RT-PCR結(jié)合PCR方法對(duì)生產(chǎn)用的毒種、半成品及成品糖丸疫苗進(jìn)行了檢測(cè)，對(duì)保證疫苗的安全具有重要意義(李華，胡凝珠，謝忠平等.脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗中SV40和泡沫病毒的檢測(cè)·中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2004，17(4)229-232.)。SFV的血清學(xué)檢測(cè)方法中，有報(bào)道分別用兩種不同的SFV抗原SFV(AGM)(Africangreenmonkey)和SFV(CPZ)(chimpanzee)來評(píng)價(jià)動(dòng)物體內(nèi)SFV感染(WilliamΜ.Switzer,VinodBhulIar,VedapuriShanmugam,etal.FrequentSimianFoamyVirusInfectioninPersonsOccupationallyExposedtoNonhumanPrimates.JournalofVirology,2004,78(6):2780_2789.)。這種方法程序復(fù)雜，且僅適合于極少數(shù)量非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的檢測(cè)。為使SFV的血清學(xué)檢測(cè)更為便捷。Hussain等人將來源于SFV(AGM)和SFV(CPZ)的抗原相結(jié)合再進(jìn)行CA-WB(CPZ-AGMWestrenblot)檢測(cè)，與PCR檢測(cè)結(jié)果一致(HussainAl,ShanmugamV,BhullarVB,etal.ScreeningforsimianfoamyvirusinfectionbyusingacombinedantigenWesternblotassay:evidenceforawidedistributionamongOldWorldprimatesandidentificationoffournewdivergentviruses.Virology,2003,309(2):248_257.)。利用CA-WB還在曾經(jīng)認(rèn)為未受SFV感染的沼澤猴、長(zhǎng)臂猿等體內(nèi)檢測(cè)到SFV，說明CA-WB具有較高的敏感性。國(guó)外還報(bào)道了一些檢測(cè)SFV的特殊技術(shù)，包括逆轉(zhuǎn)錄酶的測(cè)定、透射電子顯微術(shù)、免疫熒光檢測(cè)、免疫印跡法以及高敏感性的PCR方法。在分析動(dòng)物SFV感染狀況和檢測(cè)生物制品SFV污染時(shí)，適當(dāng)?shù)穆?lián)合運(yùn)用各種檢測(cè)方法對(duì)SFV的綜合評(píng)估非常重要。近年來，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-timefluorescentquantitativePCR,FQ-PCR)技術(shù)以其靈敏度高、速度快、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)在基因表達(dá)水平分析、突變和多態(tài)性研究、病原體的定性和定量檢測(cè)等方面得到廣泛應(yīng)用。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種高通量的熒光分析技術(shù)，是指在PCR指數(shù)擴(kuò)增期間通過連續(xù)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)弱的變化來即時(shí)測(cè)定特異性產(chǎn)物的量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量，可推算出組織中病毒的含量，推測(cè)動(dòng)物是處于發(fā)病階段還是亞臨床感染階段。目前仍未見熒光定量PCR技術(shù)用于猴泡沫病毒的定量檢測(cè)。鑒于近年來的研究進(jìn)展，WHO第49次生物標(biāo)準(zhǔn)化專家委員會(huì)會(huì)議對(duì)脊髓灰質(zhì)炎疫苗規(guī)程做出明確補(bǔ)充，指出用于疫苗生產(chǎn)的猴腎細(xì)胞應(yīng)是來自隔離猴群泡沫病毒抗體陰性的猴體。第11屆美國(guó)逆轉(zhuǎn)錄病毒年會(huì)的科學(xué)家及第4屆國(guó)際泡沫病毒學(xué)術(shù)會(huì)議專家對(duì)SFV與SIV的關(guān)系、病毒的復(fù)制與變異，SFV在AIDS疫苗研制、抗AIDS藥物治療方面的作用以及SFV在供血、供體方面的重要性作了一些研究，指出病毒在體外、體內(nèi)復(fù)制已造成一定損傷，所以一些國(guó)家對(duì)供血、供體者攜帶的SFV，對(duì)生物制劑用非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物細(xì)胞基質(zhì)或基因疫苗載體的SFV做出了控制要求。SFV已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中常見的有干擾作用的病原體，已有報(bào)告證明我國(guó)猴群中SFV檢出率11.36%，抗體陽(yáng)性率88.12%。因此，應(yīng)引起重視。綜上所述，為了分析猴群中猴泡沫病毒的感染狀況，需要實(shí)現(xiàn)猴群的批量檢測(cè)，提高檢測(cè)的靈敏度，而目前已有的多種檢測(cè)技術(shù)并不適合，建立適于批量檢測(cè)猴群猴泡沫病毒的方法以及研制相應(yīng)的檢測(cè)試劑變得十分迫切。隨著對(duì)SFV研究的不斷深入，揭開其基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制以及病毒與宿主細(xì)胞的相互作用機(jī)制，將有助于我們更好的分析SFV的致病性及其在物種間感染的特點(diǎn)。不斷探索敏感性更高、特異性更好的SFV檢測(cè)方法，對(duì)于控制SFV傳播和人民用藥安全具有深遠(yuǎn)意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了用于對(duì)猴泡沫病毒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的弓丨物和TaqMan探針，以實(shí)現(xiàn)猴群的批量檢測(cè)，提高檢測(cè)的靈敏度。本發(fā)明所提供的引物和TaqMan探針，是根據(jù)SFVpol基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)的，用以定量檢測(cè)猴淋巴細(xì)胞或相關(guān)生物制品中SFV的核酸拷貝數(shù)。具體來講，所述引物的上游引物具有序列表中SEQIDNO:1的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQIDNO2的核苷酸序列；所述TaqMan探針具有序列表中SEQIDNO3的核苷酸序列。所述TaqMan探針為經(jīng)過熒光標(biāo)記的，其5’端標(biāo)記有報(bào)告熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記有淬滅熒光基團(tuán)。所述報(bào)告熒光基團(tuán)為FAM，熒光淬滅基團(tuán)為NFQ。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種猴泡沫病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。本發(fā)明所提供檢測(cè)方法，是以本發(fā)明的引物和TaqMan探針進(jìn)行的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。所述20ulPCR反應(yīng)體系可包括=TaqMan探針+引物Iul(TaqMan探針濃度250nM，上、下游引物濃度各為900nM)，Rnase0.5ul(ABI一步法試劑盒)，RNA6ul(26.17μg/mL)，無(wú)RNA酶水2.5ul，Mix(ABI一步法試劑盒)IOul。所述PCR反應(yīng)條件可為先48°C反轉(zhuǎn)錄30min;然后95°C預(yù)變性IOmin；最后950C15s,60°Clmin，共40個(gè)循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)的延伸結(jié)束時(shí)進(jìn)行熒光信號(hào)檢測(cè)。所述檢測(cè)方法還包括標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立，方法為用含有目的片段的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，將其10倍系列稀釋成1.0X1(Γ7、1.0Χ1(Γ6、1.0Χ1(Γ5、1.0Χ1(Γ4、1.0Χ1(Γ3、1.0Χ1(Γ2、1.OX10—1，將質(zhì)粒作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，得到用于猴泡沫病毒檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的20ulPCR反應(yīng)體系包括=TaqMan探針+引物Iul(TaqMan探針濃度250nM，上、下游引物濃度各為900nM)，Rnase0.5ul(ABI一步法試劑盒)，質(zhì)粒DNAIul(27.4mg/mL)，無(wú)RNA酶水7.5ul，Mix(ABI一步法試劑盒)IOul；PCR反應(yīng)條件與上述相同。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種用于對(duì)猴泡沫病毒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的試劑盒。本發(fā)明所提供的試劑盒，包括上述用于對(duì)猴泡沫病毒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的引物和TaqMan探針。本發(fā)明提供了一種猴泡沫病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法及其專用引物和TaqMan探針。該方法是以待檢樣品中的核酸為檢測(cè)對(duì)象，準(zhǔn)確度及精密度均較好。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1、首次建立了猴泡沫病毒探針法熒光定量PCR檢測(cè)方法，利用此檢測(cè)方法可以對(duì)實(shí)驗(yàn)用猴的血樣及相關(guān)生物制品進(jìn)行批量檢測(cè)。2、本檢測(cè)方法與猴泡沫病毒的其它常規(guī)檢測(cè)方法如病毒的分離培養(yǎng)鑒定、全病毒ELISA法和Nest-PCR相比，靈敏度較高，取樣便捷，檢測(cè)效率得到了大幅提高，并且有效地防止了污染。3、本檢測(cè)方法與猴泡沫病毒的其它常規(guī)檢測(cè)方法，如病毒的分離培養(yǎng)鑒定、全病毒ELISA法和Nest-PCR相比，具有操作程序簡(jiǎn)單易用的特點(diǎn)，并可進(jìn)一步制成檢測(cè)試劑盒，操作程序化，適合大面積推廣和應(yīng)用。4、本檢測(cè)方法不僅能夠評(píng)價(jià)猴群的猴泡沫病毒感染狀況，同時(shí)也為猴泡沫病毒的流行病學(xué)、致病機(jī)理等相關(guān)領(lǐng)域的研究提供了依據(jù)。5、本檢測(cè)方法也可用于檢測(cè)猴源性生物制品如脊髓灰質(zhì)炎疫苗、狂犬疫苗、實(shí)驗(yàn)室常用猴源性細(xì)胞中猴泡沫病毒的殘留狀況，從而評(píng)價(jià)相關(guān)生物制品的質(zhì)量。綜上所述，本發(fā)明能準(zhǔn)確的檢測(cè)出猴群SFV的感染情況及相關(guān)生物制品中SFV的殘留狀況，對(duì)控制實(shí)驗(yàn)猴群的質(zhì)量及在進(jìn)出口動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域中具有重要意義，能夠保證相關(guān)生物制品的質(zhì)量，對(duì)于控制SFV傳播和人民用藥安全意義重大。本發(fā)明的檢測(cè)方法及試劑盒可用于恒河猴及相關(guān)生物制品的猴泡沫病毒檢測(cè)，應(yīng)用前景廣闊。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。圖1為用于對(duì)猴泡沫病毒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖2為猴泡沫病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的特異性試驗(yàn)結(jié)果圖3為猴泡沫病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的敏感性試驗(yàn)結(jié)果具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中末注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如sambrook等人所編《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中所述的條件，或按照制造廠商建議的條件。所用引物及TaqMan探針由ABI公司合成，所有序列測(cè)定工作均由上海英駿公司完成。實(shí)施例1、用于對(duì)猴泡沫病毒(SFV)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的引物及TaqMan探針的設(shè)計(jì)將與猴泡沫病毒基因組結(jié)構(gòu)極為相似的小鼠淋巴細(xì)胞白血病病毒(MuLV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)分別進(jìn)行序列比對(duì)，選擇猴泡沫病毒pol基因(GeneBank=6386687)保守區(qū)域，采用ABIPrimerExpress3.0實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)合成TaqMan探針及引物。探針的熒光標(biāo)記選擇FAM(5’端)作為報(bào)告發(fā)光基團(tuán)，NFQ(3’端)為淬滅基團(tuán)。序列如下上游引物(SFV-I):5，-CAGTGTCTGGTAACTAACGCTACAA3，(序列表中SEQIDNO:1)；下游引物(SFV2)5‘-GGTTTTAGAGGCTTTACAGGCCTA-3‘(序列表中SEQIDNO2)。TaqMan探針5，F(xiàn)AM-CTTCGCCACCAATACT-NFQ3，(序列表中SEQIDNO3)。實(shí)施例2、猴泡沫病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)一、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立1、構(gòu)建pGEM-TEasy-pol重組質(zhì)粒1.1目的基因的克隆-NestPCR反應(yīng)用TRIzoI法提取猴泡沫病毒的RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系如下無(wú)Rnase水7ul反轉(zhuǎn)錄緩沖液5ul(Promega公司逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng))dNTP4ul(各2.5mM)隨機(jī)引物0.5ul(Promega公司逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，濃度為500μg/mL)RNA模板8ul26.17μg/mL反轉(zhuǎn)錄酶0.5ull0U/yL_總體積25ul反應(yīng)條件為37°C90min，72°C15min，4°C5min。針對(duì)目的基因合成嵌套引物序列如下PRl5'GCCACCCAAGGAAGTTATGTGG3‘PR25'GCTGCCCCTTGGTCAGAGTG3‘；nPRl5'CCTGGATGCAGAGCTGGATC3‘nPR25'GAGGGAGCCTTTGTGGGATA3‘Nest-PCR第一輪擴(kuò)增體系ddH2032ulBuffer5ul(TakaraDRR20AM試劑)Mg2+2ul(20mM)dNTP4ul(各2.5mM)上游引物PRllul(10ymol/L)下游引物PR2lul(10ymol/L)cDNA4ul(27μg/mL)LA-TaqIul(5U/μ1)_總共50ul反應(yīng)條件94°C5分鐘；前2個(gè)循環(huán)變性94°C1分鐘，復(fù)性38°C1分鐘，延伸720C2分鐘；后18個(gè)循環(huán)變性94°C1分鐘，復(fù)性55°C1分鐘，延伸72°C2分鐘；最后72V10分鐘。Nest-PCR第二輪擴(kuò)增體系ddH2032ulBuffer5ulMg2+2uldNTP4ul上游引物nPRlIul(10μmol/L)下游引物nPR2Iul(10μmol/L)cDNA4ulLA-TaqIul_總共50ul反應(yīng)條件94°C5分鐘；前2個(gè)循環(huán)變性94°C1分鐘，復(fù)性38°C1分鐘，延伸720C2分鐘；后28個(gè)循環(huán)變性94°C1分鐘，復(fù)性55°C1分鐘，延伸72°C2分鐘；最后720C10分鐘。1.2構(gòu)建目的基因與pGEM-TEasy載體重組質(zhì)粒1.2.1回收純化反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果得到了475bp的目的條帶，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(購(gòu)自經(jīng)科宏達(dá)公司)回收并純化。1.2.2純化后的產(chǎn)物與pGEM-TEasy載體的連接連接反應(yīng)體系2XRapidLigationBuffer5ul(Promega公司載體系統(tǒng))pGEM-TEasy載體0.5ul(濃度50ng/μ1)目的基因4ul(45yg/mL)T4DNALigase0.5ul(5U/y1)_總共IOul混勻后，室溫放置lh，然后4°C過夜已得到最大量的連接產(chǎn)物。1.2.3轉(zhuǎn)化使用天根生化公司生產(chǎn)的DH5α感受態(tài)細(xì)胞，于超凈臺(tái)內(nèi)操作，步驟如下1.2.3.1冰上溶解DH5α感受態(tài)，將連接產(chǎn)物10μ1加入到感受態(tài)細(xì)菌細(xì)胞(約100μ1)中，輕彈混勻，冰浴20分鐘。隨后室溫放置10分鐘。1.2.3.2加入400μ1LB培養(yǎng)基，37°C，200rpm振蕩培養(yǎng)30分鐘。1.2.3.3取100μ1菌液涂于含100μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，于37°C溫箱中培養(yǎng)12-16小時(shí)。1.2.4提質(zhì)粒并用EcoRI酶切鑒定1.2.4.1用消毒過的吸頭在培養(yǎng)1216小時(shí)的含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上挑取濕潤(rùn)、光滑、邊緣整齊的菌落，轉(zhuǎn)接到5mL氨芐青霉素(終濃度為100μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37°C搖床過夜培養(yǎng)后每個(gè)克隆取900μ1菌液加100μI80%甘油保種，剩余菌液用質(zhì)粒小提試劑盒(購(gòu)自經(jīng)科宏達(dá)公司)提取質(zhì)粒。1.2.4.2EcoRI酶切鑒定重組質(zhì)粒酶切反應(yīng)體系ddH203ulIOXHBufferIul(Takara試劑)質(zhì)粒DNA5ul(27.4mg/mL)EcoRIIul(5U/μ1)_總共IOul混勻后于37°C水浴反應(yīng)3h，加入2ulIOXLoadingBuffer終止反應(yīng)，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果獲得了475bp的目的條帶及pGEM-TEasy質(zhì)粒條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，將初步鑒定正確的陽(yáng)性質(zhì)粒菌液送上海英駿公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明獲得了序列及插入位置均正確的含目的基因的重組質(zhì)粒，命名為PGEM-TEasy-pol。1.2.5從測(cè)序正確的菌液中提取質(zhì)粒，并用紫外分光光度法(0D260nm值)測(cè)定DNA濃度，結(jié)果濃度為27.4mg/mL,_20°C保存，用前稀釋。2、實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制用含有目的片段的質(zhì)粒pGEM-TEasy-pol作為標(biāo)準(zhǔn)品，將其10倍系列稀釋，做七個(gè)稀釋度(稀釋成1.0X1(Γ7、1.0Χ1(Γ6、1.0Χ1(Γ5、1.0Χ1(Γ4、1.0Χ1(Γ3、1.0Χ1(Γ2、1.0XΙΟ—1)，作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)體系如下探針+引物11110^91&111探針濃度2501^，上、下游引物濃度各為9001^)Rnase0.5ul(ABI—步法試劑盒，購(gòu)自歐比特公司)質(zhì)粒DNAIul(27.4mg/mL)無(wú)RNA酶水7.5ulMixIOul(ABI一步法試劑盒)_總共20ul反應(yīng)條件為先48°C反轉(zhuǎn)錄30min;然后95°C預(yù)變性IOmin；最后95°C15s,60°Clmin，共40個(gè)循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)的延伸結(jié)束時(shí)進(jìn)行熒光信號(hào)檢測(cè)。繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。二、對(duì)由猴淋巴細(xì)胞和脊髓灰質(zhì)炎疫苗提取的RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)1、從猴淋巴細(xì)胞和脊髓灰質(zhì)炎疫苗中提取RNA用TRIzol法從猴淋巴細(xì)胞(從實(shí)驗(yàn)用恒河猴全血中分離)和脊髓灰質(zhì)炎疫苗(購(gòu)自北京天壇生物制品股份有限公司)中提取RNA，具體方法為1.1樣品處理將脊髓灰質(zhì)炎疫苗水溶液SOOOrpm離心5分鐘，收集上清。1.2用1000μ1加樣槍分別取500μ1脊髓灰質(zhì)炎疫苗上清液及猴淋巴細(xì)胞于1.5mL離心管中，加入500μ1冰冷的TRIzol試劑，充分震蕩混勻10s，室溫放置IOmin01.3加入200μ1氯仿，蓋緊管蓋，劇烈震蕩10s，室溫凈置lOmin，4°C、12000r/min離心15min。1.4吸取上清于新離心管中，切忌吸動(dòng)白色中間相，加等體積冰冷的異丙醇，輕輕顛倒離心管充分混勻液體，室溫靜置10min，4°C、12000r/min離心15min。1.5用加樣槍小心吸棄所有上清，以75%乙醇(預(yù)冷于-20°C)ImL洗滌RNA—次后，4°C8000r/min離心7min。1.6用加樣槍小心吸棄上清，開蓋倒置，在超凈臺(tái)中室溫干燥lOmin。1.7加入20μIDEPt^jC(無(wú)Rnase水)溶解RNA，55_60°C水浴助溶lOmin。1.8立即進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，剩余RNA凍存于_70°C冰箱備用。2、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)在96孔板中按以下體系加樣，每個(gè)樣品做三個(gè)重復(fù)探針+引物Iul(TaqMan探針濃度250nM，上、下游引物濃度各為900nM)Rnase0.5ul(ABI一步法試劑盒)RNA6ul(26.17μg/mL)無(wú)RNA酶水2.5ulMixIOul(ABI—步法試劑盒)_總共20ul反應(yīng)條件為先48°C反轉(zhuǎn)錄30min;然后95°C預(yù)變性IOmin；最后95°C15s,60°Clmin，共40個(gè)循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)的延伸結(jié)束時(shí)進(jìn)行熒光信號(hào)檢測(cè)。反應(yīng)結(jié)束，得到結(jié)果(表1，F(xiàn)UF2、F3、F5、F6、F7、F8、F9、FlO為九只恒河猴淋巴細(xì)胞RNA樣品，JUJ2、J3為三批脊髓灰質(zhì)炎疫苗RNA樣品，對(duì)應(yīng)的批號(hào)分別為脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗2007120227，脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗2007120118，脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗2006090103)，9份猴淋巴細(xì)胞樣品中猴泡沫病毒的拷貝數(shù)分別為28179拷貝/μ1，347483拷貝/μ1，3145031拷貝/μL，10718拷貝/μ1，965557拷貝/μ1，1198325拷貝/μ，244327552拷貝/μ1，2965605拷貝/μ1，5244054拷貝/μ1，三批脊髓灰質(zhì)炎疫苗中猴泡沫病毒的拷貝數(shù)為126251拷貝/μ1，466749拷貝/μ1，124005拷貝/μ1。表1對(duì)猴淋巴細(xì)胞和脊髓灰質(zhì)炎疫苗進(jìn)行的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果循環(huán)閾值平均樣品名循環(huán)閾值拷貝數(shù)拷貝數(shù)平均值值~F138.2335338.1036625782232817985~F137.9737938.1036630577.4628179.85““F233.9852334.30653419733.6347483.6~~F234.6278234.30653275233.6347483.6F330.54547309795940181303145032F331.4137130.9795922719333145032F539.6885639.574319915.92410718.6F539.4600739.574311152127107186F632.884173272498864977.19655576325657832.7249810661389655576~32.3484532.3883212296971198326~32.428232.3883211669541198326<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>試驗(yàn)1、猴泡沫病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的特異性、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性檢測(cè)設(shè)定MuLV、HIV及空白對(duì)照，檢測(cè)本發(fā)明猴泡沫病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的特異性；用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法對(duì)3份不同的恒河猴陽(yáng)性組織樣品進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，評(píng)價(jià)本發(fā)明方法的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件與實(shí)施例2相同。特異性檢測(cè)結(jié)果如圖2所示(1-3=SFV4-6=MuLV79=HIV10-12空白對(duì)照)，可以看出只有以猴泡沫病毒為模板會(huì)出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增曲線，以MuLV及HIV為模板均為直線無(wú)擴(kuò)增，空白對(duì)照也為直線，表明本發(fā)明的檢測(cè)方法具有較好的特異性。準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果起始濃度分別為2.8X108、2.8X107、2.8XIO6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)品的最終實(shí)測(cè)值的均值分別為2.880Χ108、2.795ΧΙΟ7』815XIO6拷貝/uL,變異系數(shù)分別為0.159%,0.402%、1.059%。說明此方法具有良好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。試驗(yàn)2、猴泡沫病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法與套式PCR檢測(cè)方法的靈敏度比較取SFV病毒液，用TRIzoI法提取RNA，分別用DEPC水做10倍梯度稀釋稀釋成1.0X1(T7、1.0X1(T6、1.0X1(T5、1.0X1(T4、1.0X1(T3、1.0X1(T2、1.OXlir1梯度，分別進(jìn)行套式PCR與實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，比較2種檢測(cè)方法的靈敏度。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件與實(shí)施例2相同。套式PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件如下由于SFV屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒，其基因組為RNA，需要經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄成cDNA才能進(jìn)行PCR反應(yīng)。2.1通過優(yōu)化隨機(jī)引物及AMV逆轉(zhuǎn)錄酶濃度，確定反轉(zhuǎn)錄體系及條件。于冰水浴中依次加入下列試劑%Rnase/K7μ15X反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液5μ1(Promega公司逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng))dNTPmixture(2.5mMeach)4μ1隨機(jī)引物0.5μ1(Promega公司逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng))RNA8μ1AMV反轉(zhuǎn)錄酶(10U/μ1)0·5μl(Promega公司逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng))_總體積25μ1反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為37°C90分鐘，72°C15分鐘，4°C5分鐘。2.2通過對(duì)dNTP濃度、引物濃度、LA-TaqDNA聚合酶用量、退火溫度及循環(huán)次數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定Nest-PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件。第一輪擴(kuò)增體系，在0.2mL薄壁PCR管中依次加入下列試劑ddH2013.25μ110XLA反應(yīng)緩沖液2.5μ1(TakaraDRR20AM試劑)Mg2+2μ1dNTPmixture(2.5mMeach)3μ1上游引物3(外引物，引物序列GCCACCCAAGGAAGTTATGTGG)1μ1下游引物3(外引物，引物序列GCTGCCCCTTGGTCAGAGTG)1μ1SFVcDNA2μ1LA-TaqDNA聚合酶0·25μ1(TakaraDRR20AM試劑)_總體積25μ1第二輪擴(kuò)增體系，在0.2mL薄壁PCR管中依次加入下列試劑ddH2012.75μ110XLA反應(yīng)緩沖液2.5μ1Mg2+2.5μ1dNTPmixture(2.5mMeach)3μ1上游引物3(內(nèi)引物，引物序列CCTGGATGCAGAGCTGGATC)1μ1下游引物3(內(nèi)引物，引物序列GAGGGAGCCTTTGTGGGATA)1μ1第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物2μ1LATaqDNA聚合酶0.25μ1_總體積25μ1反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5分鐘；94°C1分鐘，50°C1分鐘，72°C1分鐘，共35個(gè)循環(huán)；72°C再延伸IOmin0結(jié)果如圖3所示(13為將RNA稀釋1XICT1時(shí)的擴(kuò)增曲線，4_6為將RNA稀釋1X10_2時(shí)的擴(kuò)增曲線，7-9為將RNA稀釋IX10_3時(shí)的擴(kuò)增曲線)，可以看出稀釋至10_3時(shí)仍有擴(kuò)增曲線，對(duì)應(yīng)的量為4705拷貝/yL，說明本發(fā)明猴泡沫病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法能都檢測(cè)到4705拷貝/μL的猴泡沫病毒RNA，具有較高的靈敏度。而套式PCR方法僅能檢測(cè)到將RNA稀釋IX10—1時(shí)的電泳條帶，靈敏度不及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。實(shí)施例3、猴泡沫病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒將用于對(duì)猴泡沫病毒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的引物和TaqMan探針混合液360μ1以及定量PCR反應(yīng)Mix液5mL、Rnase500μ1、標(biāo)準(zhǔn)品(1.0X10人1.0X1(Γ6、1.OX10_5、1.OX10_4、1.OX10_3、1.OX10_2、1.OX10_17個(gè)梯度，每個(gè)梯度25μ1)、陽(yáng)性對(duì)照25μ1、陰性對(duì)照25μ1、無(wú)RNA酶水5mL共同包裝，得到猴泡沫病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒。權(quán)利要求用于對(duì)猴泡沫病毒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的引物和TaqMan探針，是根據(jù)SFVpol基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)的，用以定量檢測(cè)猴淋巴細(xì)胞或相關(guān)生物制品中SFV的核酸拷貝數(shù)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物和TaqMan探針，其特征在于所述引物的上游引物具有序列表中SEQIDNO:1的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQIDNO:2的核苷酸序列；所述TaqMan探針具有序列表中SEQIDNO3的核苷酸序列。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的引物和TaqMan探針，其特征在于所述TaqMan探針為經(jīng)過熒光標(biāo)記的，其5’端標(biāo)記有報(bào)告熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記有淬滅熒光基團(tuán)。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的引物和TaqMan探針，其特征在于所述報(bào)告熒光基團(tuán)為FAM，熒光淬滅基團(tuán)為NFQ。5.一種猴泡沫病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，是以權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的引物和TaqMan探針進(jìn)行的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述20ulPCR反應(yīng)體系包括TaqMan探針+引物lul(TaqMan探針濃度250nM，上、下游引物濃度各為900nM)，Rnase0.5ul，RNA6ul(26.17iig/mL)，無(wú)RNA酶水2.5ul，Mix10ul。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述PCR反應(yīng)條件為先48°C反轉(zhuǎn)錄30min；然后95°C預(yù)變性lOmin；最后95°C15s，60°Clmin，共40個(gè)循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)的延伸結(jié)束時(shí)進(jìn)行熒光信號(hào)檢測(cè)。8.根據(jù)權(quán)利要求5或6或7所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述檢測(cè)方法還包括標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立，方法為用含有目的片段的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，將其10倍系列稀釋成1.0X10_7、1.0\10-6、1.0\10、1.0\10入1.0\10、1.0\10人1.0\10、將質(zhì)粒作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，得到用于猴泡沫病毒檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的20ulPCR反應(yīng)體系包括TaqMan探針+引物lul(TaqMan探針濃度250nM，上、下游引物濃度各為900nM)，Rnase0.5ul，質(zhì)粒DNAlul(27.4mg/mL)，無(wú)RNA酶水7.5ul,Mix10ul；PCR反應(yīng)條件與權(quán)利要求7相同。10.一種用于對(duì)猴泡沫病毒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的試劑盒，包括權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述用于對(duì)猴泡沫病毒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的引物和TaqMan探針。全文摘要本發(fā)明公開了一種猴泡沫病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法及試劑盒。所述引物和TaqMan探針，是根據(jù)SFVpol基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)的，用以定量檢測(cè)猴淋巴細(xì)胞或相關(guān)生物制品中SFV的核酸拷貝數(shù)。具體來講，所述引物的上游引物具有序列表中SEQIDNO1的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQIDNO2的核苷酸序列；所述TaqMan探針具有序列表中SEQIDNO3的核苷酸序列。本發(fā)明能準(zhǔn)確的檢測(cè)出猴群SFV的感染情況及相關(guān)生物制品中SFV的殘留狀況，對(duì)控制實(shí)驗(yàn)猴群的質(zhì)量及在進(jìn)出口動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域中具有重要意義，能夠保證相關(guān)生物制品的質(zhì)量，對(duì)于控制SFV傳播和人民用藥安全意義重大。本發(fā)明的檢測(cè)方法及試劑盒可用于恒河猴及相關(guān)生物制品的猴泡沫病毒檢測(cè)，應(yīng)用前景廣闊。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101831510SQ201010194768公開日2010年9月15日申請(qǐng)日期2010年5月28日優(yōu)先權(quán)日2010年5月28日發(fā)明者付瑞,李曉波,栗景蕊,賀爭(zhēng)鳴申請(qǐng)人:中國(guó)藥品生物制品檢定所