專利名稱：熒光pcr定性檢測含有花椰菜花葉病毒35s啟動子轉(zhuǎn)基因作物探針序列及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種熒光PCR定性檢測含有花椰菜花葉病毒35S啟動子轉(zhuǎn)基因作物探針序列及試劑盒。
背景技術(shù)：
據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用咨詢服務(wù)中心(ISAAA)統(tǒng)計，2001年全世界轉(zhuǎn)基因作物種植面積為5260萬公頃，十多個國家已種植轉(zhuǎn)基因作物，其中99％的轉(zhuǎn)基因作物種植在美國、阿根廷、加拿大和中國，已批準(zhǔn)商品化轉(zhuǎn)基因作物有大豆、玉米、油菜、棉花、番茄、馬鈴薯、甜椒、西葫蘆、木瓜、甜菜、香石竹、矮牽牛、亞麻、煙草、西瓜、菊苣等，已批準(zhǔn)商業(yè)化種植的已近90種。據(jù)估計，用這些轉(zhuǎn)基因作物生產(chǎn)加工的食品全世界有近萬種。
對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性，特別是轉(zhuǎn)基因食品對人和動物的健康及對生態(tài)環(huán)境的影響，自轉(zhuǎn)基因技術(shù)出現(xiàn)以來，就一直是世界各國及聯(lián)合國等國際組織關(guān)心的焦點問題，2000年聯(lián)合國通過了“生物安全議定書”，該議定書對除了藥物以外的所有進(jìn)出境活性轉(zhuǎn)基因生物有關(guān)過境、審批、檢測、風(fēng)險評估和管理、賠償責(zé)任等做出了詳細(xì)的規(guī)定，其中最重要的措施之一就是對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品要進(jìn)行檢驗，以明確其種類，確定是否為已批準(zhǔn)的或已獲得許可的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，以防止一些具有風(fēng)險的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品任意擴散，造成不可挽回的損失。2001年歐盟要求對轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行標(biāo)識管理，并提出只要不是有意污染，食品中含有不超過1％的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品(閾值)則不用標(biāo)識，這樣轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測不但需要定性，還需要定量檢測。不同國家閾值大小不一樣，從1-5％不等。我國于2001年5月9日公布并實施《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》，并于2002年1月5日公布了農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價、標(biāo)識和進(jìn)口安全管理三個配套管理辦法。目前全世界36個國家和地區(qū)出臺了各種轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品有關(guān)的法律法規(guī)?？傊?，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的研究、生產(chǎn)、銷售都要在政府有關(guān)部門的許可和監(jiān)督下，在特定的環(huán)境和地點進(jìn)行。
雖然聯(lián)合國所屬機構(gòu)(FAO、WHO等)及一些地區(qū)性國際組織在召集建立世界統(tǒng)一的檢測技術(shù)和方法標(biāo)準(zhǔn)，但由于對于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性、風(fēng)險管理措施及其它利益等方面的不一致，目前各國尚難達(dá)成一致的意見。綜合世界各國轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測技術(shù)，根據(jù)檢測目標(biāo)主要分成下面三個類型檢測插入的外源基因，檢測外源基因表達(dá)物(RNA或蛋白質(zhì))，檢測插入外源基因?qū)κ荏w生物基因表達(dá)的影響(主要檢測外源基因?qū)Σ迦胛稽c附近基因影響及對整個代謝產(chǎn)物的影響)。由于第三類型的檢測成本高、所需時間長，并且被認(rèn)為重要性較低，目前對這方面的檢測在實際工作中較少涉及。在前兩種類型的檢測工作中所涉及的檢測目標(biāo)包括三種類型DNA、RNA和蛋白質(zhì)。對于蛋白質(zhì)的檢測主要用血清學(xué)方法，由于有些轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品不表達(dá)蛋白質(zhì)或表達(dá)量不穩(wěn)定，血清學(xué)檢測方法僅在個別轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測中應(yīng)用。對于DNA和RNA的檢測主要采用PCR及直接核酸雜交等基因診斷技術(shù)。基因擴增診斷方法到目前為止已經(jīng)歷了以下幾個方面的發(fā)展PCR/電泳檢測、傳統(tǒng)雜交或測序；PCR-ELISA；實時熒光PCR。
在目前所見到的轉(zhuǎn)基因作物中，轉(zhuǎn)入的目的基因種類繁多，功能各異。為了使轉(zhuǎn)入的基因成功表達(dá)，均需要插入一定的外源性調(diào)控序列，統(tǒng)計表明，35S啟動子，F(xiàn)MV啟動子，nos終止子，nptII，cry3A，bar和pat這七種基因片段，用做篩查目的靶核苷酸序列時則可覆蓋絕大多數(shù)的GMO品種。例如花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動子(或其人工改建序列)就是一種最常見的插入序列，大約70％的轉(zhuǎn)基因作物均含有該序列(詳見附錄一商品化的轉(zhuǎn)基因作物品種含有的定性篩選基因)。因此，35S啟動子成為GMO檢測的一個理想的標(biāo)志性DNA(花椰菜花葉病毒的英文名稱為Cauliflower Mosaic Virus(簡寫為CaMV)，35s是其基因組轉(zhuǎn)錄出的一個mRNA分子，35s啟動子經(jīng)常在轉(zhuǎn)基因操作中被用作目的基因的啟動子)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種熒光PCR定性檢測含有花椰菜花葉病毒35S啟動子轉(zhuǎn)基因作物探針序列及試劑盒。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案所述的熒光PCR定性檢測含有花椰菜花葉病毒35S啟動子轉(zhuǎn)基因作物探針序列包括序列tgcctctgccgacagtggtcccaa向上游延伸5個堿基、向下游延伸5個堿基的區(qū)域內(nèi)形成的序列。上游引物序列TGCCATCATTGCGATAAAG，下游引物序列CCCTTACGTCAGTGGAGAT.
所述的試劑盒組成為核酸提取試劑核酸擴增試劑35S PCR反應(yīng)液(定性)18s-rRNA PCR反應(yīng)液Taq酶(5U/ul)UNG(1U/ul)純化水對照品35S陽性對照品18s-rRNA陽性對照品基因組全序列見附錄二本發(fā)明的具體原理是利用一對靶核苷酸序列的特異性引物、一個特異性熒光探針，采用耐熱DNA聚合酶(Taq酶)、四種核苷酸單體(dNTP)等成分，并應(yīng)用PCR技術(shù)實現(xiàn)靶核苷酸序列的核酸片段擴增。同時結(jié)合熒光探針檢測技術(shù)，該探針能與引物擴增區(qū)域中間的一段模板發(fā)生特異性結(jié)合，隨著PCR過程的進(jìn)行，熒光信號發(fā)生相應(yīng)的變化，使用在線監(jiān)測的熒光PCR檢測儀，即可同時實現(xiàn)對靶核苷酸序列的擴增及自動檢測，根據(jù)收集記錄的熒光信號，判定待測樣本中靶核苷酸序列的存在。為排除假陰性的出現(xiàn)，本試劑盒系列還包括植物共有的18s-rRNA基因檢測系統(tǒng)，用于檢測樣本DNA的提取和PCR反應(yīng)過程。


圖1熒光PCR定性檢測含有花椰菜花葉病毒35s啟動子轉(zhuǎn)基因作物擴增1中，陽性樣品為1、為馬鈴薯，2、為油菜種子，3、為蕃茄，4、為美國大豆，5、為阿根廷大豆，6、為棉花，7、為Cry9c玉米，8、為0.1％大豆。
具體實施例方式
引物、探針設(shè)計對GMO中選用的多種35s啟動子序列(包括CaMV啟動子的天然序列以及人工改建序列)進(jìn)行比較，選擇其中缺乏二級結(jié)構(gòu)且保守的基因區(qū)設(shè)計多對引物。引物長度一般為20個堿基左右，GC含量為50％-60％，引物內(nèi)無二級結(jié)構(gòu)和重復(fù)性，引物間和引物內(nèi)無互補序列，引物間的熔解溫度(Tm值)相差小于5℃。探針的長度在25個堿基左右，Tm值比引物Tm值高5℃左右。根據(jù)上述原則設(shè)計出的引物、探針如下上游35s7185；35s7190；35s7201；35s7240；35s7248；
下游35s7250r；35s7260r；35s7282r；35s2r；35s730r；35s7345r；35s7365r探針6153；35S FAM-BHQ；35S FAM-TAMRA；7275FAM；7273FAM-BHQ；7270FAM最優(yōu)引物、探針序列如下上游引物35s7201TGCCATCATTGCGATAAAG下游引物35s7345RCCCTTACGTCAGTGGAGAT探針35S7248FambFam-tgcctctgccgacAgtggtcccaa-TAMRA反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化中所采用的靶區(qū)域模板以如下方法獲得用購自符合國際標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)入該基因的Fluka轉(zhuǎn)基因大豆，以Promega Purification kit提取基因組核酸，再分別用上述檢測序列區(qū)域中的最長的擴增片段的引物進(jìn)行PCR擴增。擴增產(chǎn)物用1×TE進(jìn)行10倍梯度稀釋，選取10-3、10-4、10-5、10-6、10-7共5個稀釋度為系列陽性模板，并取其中Ct值23至27之間者作為以后反應(yīng)體系優(yōu)化時的模板。
引物、探針的篩選引物篩選實驗中將上述上游引物和下游引物結(jié)合特異的探針，任意配對進(jìn)行實驗。熒光PCR儀采用PE7700熒光PCR儀。所采用的PCR反應(yīng)體系如下表所示。
PCR反應(yīng)體系

PCR條件的選擇依據(jù)本公司以往的經(jīng)驗，PCR條件的選擇如下94℃3min；

在同樣的模板量、同樣的反應(yīng)條件下，以35s啟動子序列的特異熒光探針信號所獲得的Ct值和Rn值為指標(biāo)(這兩者能反映擴增片斷的量和質(zhì))，比較不同引物對組合的擴增情況。選擇Ct值和Rn值高者，做為待選的DNA/PCR檢測的引物對。
從多次重復(fù)實驗中選定下述最佳引物/探針組合為最佳組合上游引物35s7201；下游引物35s7345R；探針35S7248Famb。
用選出的最佳上下游引物對進(jìn)行PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化。
引物和探針濃度的優(yōu)化實驗中將引物濃度從0.1umol/L至0.8umol/L以0.1umol/L遞增，探針濃度從0.025umol/L至0.2umol/L以0.025umol/L遞增。對引物和探針不同濃度的配比進(jìn)行了比較。
最佳引物和探針終濃度結(jié)果如下

探針名稱35S7248Famb 最佳終濃度0.1μM。
鎂離子濃度的優(yōu)化實驗中將鎂離子濃度從1.0mmol/L至2.5mmol/L以0.5mmol/L遞增。
從多次重復(fù)實驗中選定2.5mmol/L MgCl2為試劑盒反應(yīng)體系鎂離子濃度。
Taq DNA聚合酶(Taq酶)用量的優(yōu)化Taq酶用量(以單位U計)的優(yōu)化實驗結(jié)果，選定2U Taq酶作為試劑盒中使用Taq酶量。
dNTPs濃度的優(yōu)化dNTPs濃度的優(yōu)化實驗中選定0.2mmol/L作為試劑盒dNTPs的終濃度。
綜合以上反應(yīng)體系優(yōu)化實驗結(jié)果，優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系見下表。
優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系

DNA提取方法推薦使用傳統(tǒng)的植物DNA提取方法CTAB法。
18s-rRNA基因18s-rRNA基因是存在于所有植物中的一種基因，所以本試劑盒選用它作為內(nèi)標(biāo)基因，用于監(jiān)測DNA提取及熒光PCR整個過程，18s-rRNA體系的建立同上，引物、探針序列如下上游引物序列18s-rRNA1403ucctgagaaacggctaccat下游引物序列18s-rRNA1449rcgtgtcaggattgggtaat探針序列18s-rRNA1423fbFAM-TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-TAMRA核酸提取試劑可使用傳統(tǒng)的植物DNA提取方法，例如CTAB法，也可采用Promega公司的Wizard Magnetic DNA Purification System for Food試劑盒(Cat FF3750，200tests)。
35S試劑盒組成

試劑盒中各組分配方35S PCR反應(yīng)液取合格25mmol/L MgCl2、100mmol/L dATP、100mmol/L dUTP、100mmol/L dGTP、100mmol/L dCTP、50umol/L 35S上游引物、50umol/L 35S下游引物、50umol/L 35S探針、10×PCR緩沖液、1U/ul UNG和純化水，按以下配方配制PCR反應(yīng)液。

CTAB法樣本處理試劑配方

18s-rRNA PCR反應(yīng)液取合格25mmol/L MgCl2、100mmol/L dATP、100mmol/L dUTP、100mmol/L dGTP、100mmol/L dCTP、50umol/L 18s-rRNA上游引物、50umol/L 18s-rRNA下游引物、50umol/L 18s-rRNA探針、10×PCR緩沖液、1U/ul UNG和純化水，按以下配方配制PCR反應(yīng)液。

其中，UNG是UNG酶(尿嘧啶-N-糖苷酶)Uracil-N-glycosylase純化水的制備用自來水一次蒸餾，經(jīng)過Millipore MILLI-Q PF PLUS純水儀純化，收取電阻率≥18.0MΩ.cm的水，貯于無菌瓶中。
陽性對照品的制備取相應(yīng)的陽性樣品，CTAB法樣本處理試劑提取DNA，將上述制備好的DNA，用比檢測反應(yīng)擴增片段更長的引物擴增(用dTTP而非dUTP)，采用Promega公司的Wizard PCRPreps DNA Purification System試劑盒純化上述PCR產(chǎn)物中的目的核酸片段，再用1.5％瓊脂糖凝膠電泳的方法對純化的擴增產(chǎn)物進(jìn)行粗略定量，然后用Promega公司的PGEM-TEasy Vector System II試劑盒將目的片段與T載體相連接；再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入JM109感受態(tài)細(xì)胞，然后用X-Gal和IPTG瓊脂平板篩選克隆目的菌落，PCR反應(yīng)鑒定之。用LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行質(zhì)粒的擴增。最后用Promega公司的Wizard Plus Minipreps DNAPurification System試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒的提純，仍以1.5％瓊脂糖凝膠電泳的方法對提純的質(zhì)粒進(jìn)行純度檢測，合格者為陽性對照品母液。用1X TE進(jìn)行大量稀釋。
稀釋的質(zhì)粒，用合格試劑盒進(jìn)行檢測，取Ct值在28～30者，留置大量，用做配試劑盒，也用做暫定的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品。
自備設(shè)備及試劑水浴鍋，離心機；氯仿、異丙醇(-20℃預(yù)冷)、70％乙醇(-20℃預(yù)冷)適用儀器PE Gene Amp7700熒光PCR檢測儀或其次她合適的熒光PCR儀保存與有效期測試樣本處理試劑置室溫保存，其他試劑置-20℃保存，避免反復(fù)凍融。自檢定合格之日起有效期為12個月。連續(xù)生產(chǎn)的三批試劑盒檢定合格之日起在試劑盒要求的儲存溫度下保存，每個月按成品檢定規(guī)程檢測一次，一直到14個月時，各項指標(biāo)均合格，因此確定試劑盒有效期為12個月。
使用方法樣本核酸提取1.1 CTAB法提取DNA1.1.1 稱取100mg充分粉碎后的植物樣品放入2ml離心管中，加800ul CTAB緩沖液，混勻后于65℃溫育30分鐘；1.1.2 15500g離心10分鐘，轉(zhuǎn)移上層液至含400ul氯仿的管中，混勻30秒，再以15500g離心10分鐘直至液相分層，吸取上層液至干凈離心管中；1.1.3 加入2V CTAB沉淀緩沖液，室溫下溫育60分鐘；1.1.4 混合液以15500g離心5分鐘，棄上清；1.1.5 加入500ul沉淀溶解液溶解沉淀，并加入500ul氯仿，混勻30秒后以15500g離心10分鐘；1.1.6 轉(zhuǎn)移上清至另一新管中，加入0.6倍體積異丙醇，充分混勻后15500g離心10分鐘，棄上清液；1.1.7 加入70％乙醇500ul于含有沉淀的小管中，小心混勻洗滌管壁后離心10分鐘(15500g)，棄上清；1.1.8 室溫干燥，然后將DNA溶解在100ul無菌去離子水中(如果樣本DNA當(dāng)天不使用，請于-20℃保存)。
1.2 Promega法提取DNA的步驟(備選)原方法樣本稱取量為200mg。根據(jù)本公司的經(jīng)驗，此量極難混勻，故將樣本稱取量改為100mg，其后的試劑用量和操作步驟則完全按原方法進(jìn)行。
2. 試劑配制(PCR前準(zhǔn)備區(qū))從試劑盒中取出各管試劑，室溫融化，2000rpm離心5秒。
a)設(shè)35S PCR所需要的管數(shù)為n(n＝樣本數(shù)×2+1管空白對照+1管35s陽性對照品)；b)設(shè)18s-rRNA PCR所需要的管數(shù)為m(m＝樣本數(shù)×2+1管空白對照+1管18s-rRNA陽性對照品)；每個測試反應(yīng)體系配制如下表

計算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積試管中，充分混合均勻，向設(shè)定的n個PCR反應(yīng)管中分別加入35S PCR反應(yīng)液各35ul；向設(shè)定的m個PCR反應(yīng)管中分別加入18s-rRNA PCR反應(yīng)液反應(yīng)液各35ul，一同轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。
2.1 加樣(樣本處理區(qū))若樣本DNA保存在-20℃，先置室溫解凍。
在各設(shè)定的PCR反應(yīng)管中，分別加入上述樣本DNA溶液、純化水(空白對照)和相應(yīng)陽性對照品各5ul，蓋好PCR反應(yīng)管蓋，轉(zhuǎn)移至檢測區(qū)，置于定量PCR檢測儀上并記錄樣本擺放順序。
2.2. PCR擴增(檢測區(qū))2.2.1 循環(huán)條件設(shè)置37℃5min；95℃3min；95℃15sec，60℃1min 40個循環(huán)。反應(yīng)體系設(shè)為40ul。
2.2.2 儀器檢測通道選擇所有PCR反應(yīng)管熒光信號收集設(shè)為Fam熒光通道。
具體設(shè)置方法請參照儀器使用說明書。
3. 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)35S空白對照的檢測結(jié)果應(yīng)為陰性；35S陽性對照品的Ct值≤32.0；18s-rRNA空白對照的檢測結(jié)果應(yīng)為陰性；18s-rRNA陽性對照品的Ct值≤30.0；上述指標(biāo)有一項不符合者，應(yīng)重做PCR擴增。
4. 結(jié)果判斷4.1. 閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照品擴增曲線的最高點，使陰性對照品成陰性結(jié)果為準(zhǔn)。
4.2. 待測樣本18s-rRNA Ct值應(yīng)該≤17.0，如果不在此范圍，則需重新提取樣本DNA，重做PCR擴增。
4.3. 將同一樣品兩個平行管的Ct值取平均值，做為判斷用的待測樣品Ct值。
4.4.待測樣本35S啟動子序列測定Ct值等于40.0者，報35S啟動子序列陰性(其他熒光PCR儀對陰性的表示也可能為0.0或空白無數(shù)值)。
4.5. 待測樣本35S啟動子序列測定Ct值≤34.0，報35S啟動子序列陽性。
4.6. 如果34.0＜待測樣本35S啟動子序列測定Ct值＜40.0，需重新做PCR擴增。
如再次擴增結(jié)果35S啟動子序列測定Ct值仍＜40.0，報35S啟動子序列陽性。
如再次擴增結(jié)果35S啟動子序列測定Ct值等于40.0，則報35S啟動子序列陰性。
試劑盒使用注意事項請嚴(yán)格按照行業(yè)行政主管部門頒布的有關(guān)基因擴增檢驗實驗室的管理規(guī)范執(zhí)行。
實施例1選取轉(zhuǎn)基因及非轉(zhuǎn)基因的農(nóng)產(chǎn)品如大豆、玉米、油菜、番茄、土豆，以Promega磁珠法提取基因組DNA，具體為稱重100mg植物材料，置于2ml離心管中；加入500ul LysisBuffer A和5ul RNase A，與材料混勻；加入250ul Lysis Buffer B，混勻，室溫放置10分鐘；加入750ul沉淀緩沖液，混勻后高速離心(13000×g)10分鐘；吸取上清于干凈的2ml離心管中，加入50ul磁粉液，混勻；混合液中加入0.8體積異丙醇，混勻，室溫放置5分鐘；將離心管置于磁架上1分鐘，去澄清液；取出離心管，再加入250ul Lysis Buffer B，混勻后置于磁架上1分鐘，去澄清液；用1ml 70％乙醇清洗磁粉，置于磁架上1分鐘，去澄清液；步驟重復(fù)2次；取出離心管，于65℃干浴鍋中干燥5分鐘或室溫下干燥15-30分鐘；離心管中加入100ul去離子水，混勻后于65℃干浴鍋中孵育5分鐘，再移至磁架上1分鐘，吸取澄清液于0.5ml干凈離心管中，做為DNA模板備用。
用該試劑盒做熒光PCR檢測，具體為40ul反應(yīng)體系中，加入植物基因組DNA 5ul，進(jìn)行熒光PCR檢測，具體反應(yīng)條件同前。經(jīng)檢測，上述轉(zhuǎn)入35S啟動子的轉(zhuǎn)基因作物均呈陽性擴增，其檢測靈敏度均可達(dá)到0.1％；而非轉(zhuǎn)基因的農(nóng)產(chǎn)品如普通玉米、白玉米等均無擴增信號，提示該引物對具有良好的靈敏度和特異性(具體見圖一)。
試劑盒靈敏度為0.1％GMO，將0.1％的標(biāo)準(zhǔn)品做5倍稀釋后，仍可檢測到目標(biāo)片段。
試劑盒精密性測試公司中3位技術(shù)熟練的操作人員在3個不同時間，各做3次精密性檢測實驗(總計9次)，每次平行處理10份精密性參比品。對每10次所得的Ct值用Microsoft Excel分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，得出平均值和10個Ct值的CV值，實驗結(jié)果顯示，Ct值的CV值在5.0％以下，表明該試劑盒有良好的精密性。
試劑盒特異性測試該試劑盒對陰性大豆、玉米、油菜、馬鈴薯標(biāo)本均無非特異性擴增，表明該試劑盒具有良好的特異性。
對于所有植物DNA均應(yīng)該擴增。按本試劑盒的方法提取DNA，其Ct值在9至25之間。
以符合國際標(biāo)準(zhǔn)的Fluka大豆標(biāo)準(zhǔn)品0.1％轉(zhuǎn)基因大豆提取的DNA做模板，得到的Ct值在29.0-33.0之間，這是目前不同熒光測定儀器的可靠檢測下限；而0.1％的檢測靈敏度已經(jīng)達(dá)到了目前國際同類產(chǎn)品的檢測標(biāo)準(zhǔn)。
該試劑盒中的引物探針還可以用作雜交探針檢測含有花椰菜花葉病毒35s啟動子轉(zhuǎn)基因作物。
PCR-ELISA的方法學(xué)原理簡介該實驗要設(shè)計一對PCR引物和一條探針，它們均與模板DNA鏈互補，且探針的結(jié)合部位在引物結(jié)合部位之間。將PCR的一條引物5’端標(biāo)記上熒光素(Fluorescein)，進(jìn)行PCR擴增，得到的擴增產(chǎn)物帶有熒光素標(biāo)記。同時將探針的5’端標(biāo)記上生物素(Biotin)，酶聯(lián)板上包被有親和素(Avidin)，通過生物素與親和素的親和作用，將探針包被在酶聯(lián)板上。檢測時，將擴增產(chǎn)物變性成單鏈，在酶聯(lián)板上與探針進(jìn)行特異的結(jié)合，洗板，再加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的熒光素抗體，通過顯色劑顯色，在酶標(biāo)板上讀取OD值，根據(jù)OD值判斷樣品的陰陽性。
實施例2將上述探針35s7248FAMB的5’端標(biāo)記生物素，3’端不做標(biāo)記；將引物35s7345r的5’端標(biāo)記上熒光素。預(yù)先將探針包被在有親和素的酶聯(lián)板上。
按常規(guī)方法(CTAB法或磁珠法)提取樣本中的DNA。由10×PCR緩沖液、dNTPs、Mg2+、Taq酶、上下游引物、H2O，以及DNA模板組成PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行擴增。
擴增結(jié)束后，將擴增產(chǎn)物變性成單鏈，加到包被了探針的酶聯(lián)板上，如果有特異性擴增，擴增產(chǎn)物中的一條鏈與探針雜交，洗板，加入酶聯(lián)熒光素抗體，洗板，加入顯色劑，顯色10分鐘，停止顯色，在酶標(biāo)儀上讀取OD值，根據(jù)OD值判斷樣本的陰陽性。下表是一次的實驗結(jié)果


實驗結(jié)果表明只要含有35s啟動子序列的轉(zhuǎn)基因作物經(jīng)該系統(tǒng)檢測結(jié)果均為陽性，而不含有35s啟動子序列的作物經(jīng)該系統(tǒng)檢測均為陰性。
本發(fā)明的優(yōu)點1.本試劑盒對于轉(zhuǎn)入花椰菜花葉病毒35S啟動子的轉(zhuǎn)基因作物檢測靈敏度可達(dá)0.1％，說明本試劑盒具有良好的靈敏度。
2.本試劑盒對于非轉(zhuǎn)基因的農(nóng)產(chǎn)品如大豆、玉米等均無擴增信號，說明本試劑盒具有良好的特異性。
3.由于本試劑盒采用了熒光PCR作為檢測方法，整個反應(yīng)均閉管進(jìn)行，避免了其他核酸檢測方法如PCR-電泳等易于形成氣溶膠污染而造成假陽性。
4.由于本試劑盒采用了植物內(nèi)源基因18S-rRNA作為內(nèi)標(biāo)，避免了假陰性的產(chǎn)生。
5.由于本方法對PCR產(chǎn)物實行了實時監(jiān)測，大大節(jié)省了檢測時間，節(jié)約了人力物力。
備注英文字母表示的引物探針的名稱、引物探針的序列、基因的名稱等大小寫通用；“Ct值”的英文全稱為“Threshold Cycles”，意指熒光值超過閾值時所處的循環(huán)數(shù)。在不同熒光PCR儀上有不同的名稱，但含義是一樣的。
附錄一


附錄二CCCCAGATTAGGCTTTTCAATTTCAGAAAGAATGCTAACCCACAGATGGTTAGAGAGGCTTACGCAGCAGGTCTCATCAAGACGATCTACCCGAGCAATAATCTCCAGGAAATCAAATACCTTCCCAAGAAGGTTAAAGATGCAGTCAAAAGATTCAGGACTAACTGCATCAAGAACACAGAGAAAGATATATTTCTCAAGATCAGAAGTACTATTCCAGTATGGACGATTCAAGGCTTGCTTCACAAACCAAGGCAAGTAATAGAGATTGGAGTCTCTAAAAAGGTAGTTCCCACTGAATCAAAGGCCATGGAGTCAAAGATTCAAATAGAGGACCTAACAGAACTCGCCGTAAAGACTGGCGAACAGTTCATACAGAGTCTCTTACGACTCAATGACAAGAAGAAAATCTTCGTCAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGG35s7201AAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCA35S7248FambTCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACG35s7345RTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGAACACGGGGGACTCTAGAGGATCCATAGATCTGATAACAAAGATGAG
序列表<110>國家出入境檢驗檢疫局動植物檢疫實驗所深圳市匹基生物工程股份有限公司<120>熒光PCR定性檢測含有花椰菜花葉病毒35S啟動子轉(zhuǎn)基因作物探針序列及試劑盒<130><160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>24<212>DNA<213>人工合成<400>1tgcctctgcc gacagtggtc ccaa24<210>2<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>2tgccatcatt gcgataaag 19<210>3<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>3cccttacgtc agtggagat 19<210>4<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>4tgcgcgcctg ctgccttcct 20<210>5<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>5cctgagaaac ggctaccat 19<210>6<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>6cgtgtcagga ttgggtaat 19
權(quán)利要求
1.一種熒光PCR定性檢測含有花椰菜花葉病毒35S啟動子轉(zhuǎn)基因作物探針序列，其特征在于所述的探針序列包括序列tgcctctgccgacagtggtcccaa向上游延伸5個堿基、向下游延伸5個堿基的區(qū)域內(nèi)形成的序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種熒光PCR定性檢測含有花椰菜花葉病毒35S啟動子轉(zhuǎn)基因作物探針序列，其特征在于所述的探針序列為tgcctctgccgacagtggtcccaa。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種熒光PCR定性檢測含有花椰菜花葉病毒35S啟動子轉(zhuǎn)基因作物探針序列做成的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒的組成為核酸提取試劑核酸擴增試劑35S PCR反應(yīng)液(定性)18s-rRNA PCR反應(yīng)液Taq酶(5U/ul)UNG(1U/ul)純化水對照品35S陽性對照品18s-rRNA陽性對照品其中，35sPCR反應(yīng)液的上游引物序列為TGCCATCATTGCGATAAAG，下游引物序列CCCTTACGTCAGTGGAGAT，其中18s-rRNA上游引物序列cctgagaaacggctaccat，下游引物序列cgtgtcaggattgggtaat，探針序列TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT。
4.一種根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種熒光PCR定性檢測含有花椰菜花葉病毒35S啟動子轉(zhuǎn)基因作物探針序列做成的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒的組成為組成成份(48tests/盒)體積CTAB法核酸提取試劑CTAB緩沖液 40ml×1管CTAB沉淀緩沖液 40ml×1管沉淀溶解液 24ml×1管核酸擴增試劑35S PCR反應(yīng)液(定性) 1ml×2管18s-rRNA PCR反應(yīng)液 1ml×2管Taq酶(5U/ul)40ul×1管UNG(1U/ul) 10ul×1管純化水 100ul×1管對照品35S陽性對照品 30ul×1管18s-rRNA陽性對照品 30ul×1管試劑盒中各組分配方35SPCR反應(yīng)液為10×buffer 1×MgCl22.5mMdNTPs(u) 200uMTaq酶(檢測時另加) (2U)35S上游引物0.2uM35S下游引物0.2uM35S探針0.1uM模板(檢測時另加) (5ul)水終體積(ul) 40ul18s-rRNA PCR反應(yīng)液試劑成份 終濃度10×buffer 1×MgCl22.5mMdNTPs(u) 200uMTaq酶(檢測時另加)(2U)18s-rRNA上游引物 0.2uM18s-rRNA下游引物 0.2uM18s-rRNA探針 0.1uM模板(檢測時另加) (5ul)水終體積(ul)40ulCTAB法樣本處理試劑配方為CTAB緩沖液 20g CTAB/L，1.4M NaCl，0.1M Tris/HCl，20mM EDTA(ph＝8.0)CTAB沉淀緩沖液 5g CTAB/L，0.04M NaCl沉淀溶解液 1.2M NaCl
5.一種根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種熒光PCR定性檢測含有花椰菜花葉病毒35S啟動子轉(zhuǎn)基因作物探針序列其特征在于所述的探針用作雜交探針檢測含有花椰菜花葉病毒35S啟動子轉(zhuǎn)基因作物。
全文摘要
一種熒光PCR定性檢測含有花椰菜花葉病毒35S啟動子轉(zhuǎn)基因作物探針序列及試劑盒，所述的探針序列包括序列tgcctctgccgacagtggtcccaa向上游延伸5個堿基、向下游延伸5個堿基的區(qū)域內(nèi)形成的序列。所述的試劑盒組成為核酸提取試劑；核酸擴增試劑，所述的核酸擴增試劑包括35sPCR反應(yīng)液、18s－rRNAPCR反應(yīng)液、Taq酶(5U/ul)、UNG(1U/ul)；對照品等。本試劑盒對于轉(zhuǎn)入花椰菜花葉病毒35S啟動子的轉(zhuǎn)基因作物檢測靈敏度可達(dá)0.1％，本試劑盒還具有良好的特異性。由于本試劑盒采用了植物內(nèi)源基因18S－rRNA作為內(nèi)標(biāo)，避免了假陰性的產(chǎn)生，由于本方法對PCR產(chǎn)物實行了實時監(jiān)測，大大節(jié)省了檢測時間，節(jié)約了人力物力。
文檔編號C12Q1/68GK1485443SQ02131298
公開日2004年3月31日 申請日期2002年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月24日
發(fā)明者朱文斯, 朱水芳, 黃茜華 申請人:深圳市匹基生物工程股份有限公司, 國家出入境檢驗檢疫局動植物檢疫實驗所