專利名稱：具有cba啟動(dòng)子的可表達(dá)egfp的重組桿狀病毒的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有CBA啟動(dòng)子的可表達(dá)EGFP的重組桿狀病毒的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
隨著分子生物學(xué)技術(shù)和方法的發(fā)展及應(yīng)用，桿狀病毒已被開(kāi)發(fā)成為高效的真核表達(dá)載體系統(tǒng)，用于各種外源基因的表達(dá)，并作為一種新型的疫苗、基因治療載體受到人們的高度重視。目前篩選重組桿狀病毒的方法有很多，諸如酵母-昆蟲(chóng)細(xì)胞、大腸桿菌-昆蟲(chóng)細(xì)胞的穿梭載體的開(kāi)發(fā)、桿狀病毒DNA線性化和體外定點(diǎn)酶促重組等。但是這些方法的重組效率較低、重組病毒篩選的周期較長(zhǎng)、很難同時(shí)分離多個(gè)重組桿狀病毒、基因表達(dá)的效率也很低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是要解決現(xiàn)有重組桿狀病毒介導(dǎo)的基因表達(dá)效率低的問(wèn)題，提供具有CBA 啟動(dòng)子的可表達(dá)EGFP的重組桿狀病毒的構(gòu)建方法。本發(fā)明具有CBA啟動(dòng)子的可表達(dá)EGFP的重組桿狀病毒的構(gòu)建方法，按以下步驟進(jìn)行一、PCR 擴(kuò)增 Bacmid DNA 中的 gp64sp 片段；二、PCR 擴(kuò)增 pCMV-VSVG 中的 VSVGED 片段；三、融合PCR擴(kuò)增gp64sp-VSVGED融合片段；四、將GV片段引入pMD18_T載體，構(gòu)建質(zhì)粒 PMD18-T-GV ；五、構(gòu)建質(zhì)粒 pFastBacl-GV ；六、PCR 擴(kuò)增 pFastBacl-GV 中的 pHGV 片段， 將pHGV片段引入pMD18-T載體，構(gòu)建質(zhì)粒pGM18_T-pHGV ；七、PCR擴(kuò)增質(zhì)粒pTriEx_2Hygro 中的CBA啟動(dòng)子，將CBA啟動(dòng)子克隆至pMD18-T載體，構(gòu)建質(zhì)粒pMD18_T_CBA ；八、構(gòu)建質(zhì)粒載體PFastBac [pH_]-pHBOX ；九、構(gòu)建質(zhì)粒載體pSD_CBA ；十、構(gòu)建質(zhì)粒載體pSD ； 十一、PCR擴(kuò)增質(zhì)粒pAAV-LacZ中的L-ITR片段和R-ITR片段，將L-ITR片段引入質(zhì)粒載體pSD，構(gòu)建質(zhì)粒pSD-L-ITR ；十二、將R-ITR片段引入質(zhì)粒pSD-L-ITR，構(gòu)建pSD-ITRs ； 十三、PCR擴(kuò)增質(zhì)粒pEGFP-C3中的EGFP基因，將EGFP基因克隆至pMD18_T載體，構(gòu)建質(zhì)粒pMD18-T-EGFP ；十四、構(gòu)建質(zhì)粒pSD_EGFP ；十五、構(gòu)建質(zhì)粒pSD_ITRs_EGFP ；十六、質(zhì)粒 pSD-EGFP和質(zhì)粒pSD-ITRs-EGFP分別轉(zhuǎn)化DHlOBac細(xì)胞，獲得重組載體Bacmid-SD-EGFP 和Bacmid-SD-ITRs-EGFP ；十七、利用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法將Bacmid-SD-EGFP和 Bacmid-SD-ITRs-EGFP 轉(zhuǎn)染 Sf9 細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒 BV-SD-EGFP 和 BV-SD_ITRs_EGFP ； 其中步驟一中 PCR 擴(kuò)增引物為 SD-I 和 SD-2，引物 SD-I 為 5' -CGCGGATCCATGCTACTAGTAAA TCAGTCACACCAAG-3 ‘，引物 SD-2 為 5 ‘ -ATTTTTGGATAGCCCAGTATCCGCAAAGGCAGAATGC-3 ‘； 步驟二中 PCR 擴(kuò)增引物為 SD-2 和 LM-2，引物 LM-2 為 5 ‘ -CCCAAGCTTACTTTCCAAGTCGGTTCAT CTCTAT-3‘；步驟三中融合PCR擴(kuò)增引物為L(zhǎng)M-3和SD-2，引物L(fēng)M-3為5' -CGCGGATCCATGC TACTAGTAAATCAGTCACACCAAG-3 ‘；步驟六中 PCR 擴(kuò)增引物為 LM-1 和 LM-2，引物 LM-1 為 5 ‘ -TGCTCTAGATTCGCATCCTCGGTTTTCTG-3 ‘；步驟七中 PCR 擴(kuò)增引物為 SD-3 和 SD-4，引物 SD-3 為 5' -GCTCTAGAGCCGTAATGAGACGCACAAACTAATATCACAAAC-3'，引物SD-4 為 5' -GTGAATTCCGGAGCTCTGCTCGAGCGAGGCCTAGCCGCCGGTCACACGCC-3 ‘；步驟^^一中 PCR 擴(kuò)增引物為 LM-11 和 LM-12，引物 LM-11 為 5 ‘ -TGCTCTAGATTGCTGGCCTTTTGCTCACATGT-3 ‘，引物 LM-12 為 5 ‘ -TG CTCTAGAGTAATTGATTACTATTAATAACTAGTACGCGTGCG-3 ‘；步驟十三中 PCR 擴(kuò)增引物為 eGFP-f 和 eGFP-r，引物 eGFP-f 為 5 ‘ -ACTGAATTCGCCACCATGGTGAGCAAGG-3 ‘，引物 eGFP-r 為 5 ‘ -T CAGTCGACTCACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3‘。本發(fā)明在桿狀病毒基因組中添加多個(gè)調(diào)控元件，進(jìn)行多角度的遺傳修飾，使得重組后的桿狀病毒具有高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、傳遞基因在體內(nèi)和體外中持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)。與不添加 VSV-GED, WPRE調(diào)控元件及ITRs序列的.BV-SD-controI-EGFP重組桿狀病毒相比，經(jīng)過(guò)修飾改造的BV-SD-EGFP重組桿狀病毒和BV-SD-EGFP-ITRs重組桿狀病毒所介導(dǎo)的EGFP基因的表達(dá)效率明顯增強(qiáng)。


圖1為重組桿狀病毒BV-SD-controI-EGFP侵染MYO細(xì)胞48小時(shí)后EGFP的表達(dá)情況；圖2為重組桿狀病毒BV-SD-EGFP侵染MYO細(xì)胞48小時(shí)后EGFP的表達(dá)情況；圖3為重組桿狀病毒BV-SD-ITRs-EGFP侵染MYO細(xì)胞48小時(shí)后EGFP的表達(dá)情況；圖4為質(zhì)粒 pCMV-VSVG圖譜；圖5為質(zhì)粒pFastBacl圖譜；圖6為質(zhì)粒pTriEx-2Hygro圖譜；圖7為質(zhì)粒pFastBadpH-]圖譜；圖8為pAAV_LacZ質(zhì)粒圖譜；圖9為質(zhì)粒pEGFP_C3圖譜。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式
，還包括各具體實(shí)施方式
間的任意組合。
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式具有CBA啟動(dòng)子的可表達(dá)EGFP的重組桿狀病毒的構(gòu)建方法，按以下步驟進(jìn)行一、PCR 擴(kuò)增 Bacmid DNA 中的 gp64sp 片段；二、PCR 擴(kuò)增 pCMV-VSVG 中的 VSVGED 片段；三、融合PCR擴(kuò)增gp64sp-VSVGED融合片段；四、將GV片段引入pMD18_T載體，構(gòu)建質(zhì)粒 pMD18-T-GV ；五、構(gòu)建質(zhì)粒 pFastBacl-GV ；六、PCR 擴(kuò)增 pFastBacl-GV 中的 pHGV 片段， 將pHGV片段引入pMD18-T載體，構(gòu)建質(zhì)粒pGM18_T-pHGV ；七、PCR擴(kuò)增質(zhì)粒pTriEx_2Hygro 中的CBA啟動(dòng)子，將CBA啟動(dòng)子克隆至pMD18-T載體，構(gòu)建質(zhì)粒pMD18_T_CBA ；八、構(gòu)建質(zhì)粒載體PFastBac [pH_]-pHBOX ；九、構(gòu)建質(zhì)粒載體pSD_CBA ；十、構(gòu)建質(zhì)粒載體pSD ； 十一、PCR擴(kuò)增質(zhì)粒pAAV-LacZ中的L-ITR片段和R-ITR片段，將L-ITR片段引入質(zhì)粒載體pSD，構(gòu)建質(zhì)粒pSD-L-ITR ；十二、將R-ITR片段引入質(zhì)粒pSD-L-ITR，構(gòu)建pSD-ITRs ； 十三、PCR擴(kuò)增質(zhì)粒pEGFP-C3中的EGFP基因，將EGFP基因克隆至pMD18_T載體，構(gòu)建質(zhì)粒pMD18-T-EGFP ；十四、構(gòu)建質(zhì)粒pSD_EGFP ；十五、構(gòu)建質(zhì)粒pSD_ITRs_EGFP ；十六、質(zhì)粒 pSD-EGFP和質(zhì)粒pSD-ITRs-EGFP分別轉(zhuǎn)化DHlOBac細(xì)胞，獲得重組載體Bacmid-SD-EGFP 和Bacmid-SD-ITRs-EGFP ；十七、利用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法將Bacmid-SD-EGFP和 Bacmid-SD-ITRs-EGFP 轉(zhuǎn)染 Sf9 細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒 BV-SD-EGFP 和 BV-SD-ITRs-EGFP ； 其中步驟一中 PCR 擴(kuò)增引物為 SD-I 和 SD-2，引物 SD-I 為 5 ‘ -CGCGGATCCATGCTACTAGTAAAT CAGTCACACCAAG-3 ‘，引物 SD-2 為 5 ‘ -ATTTTTGGATAGCCCAGTATCCGCAAAGGCAGAATGC-3 ‘；步驟二中 PCR 擴(kuò)增引物為 SD-2 和 LM-2，引物 LM-2 為 5 ‘ -CCCAAGCTTACTTTCCAAGTCGGTTCATCTCTAT-3‘；步驟三中融合PCR擴(kuò)增引物為L(zhǎng)M-3和SD-2，引物L(fēng)M-3為5' -CGCGGATCCATGCTA CTAGTAAATCAGTCACACCAAG-3 ‘；步驟六中 PCR 擴(kuò)增引物為 LM-1 和 LM-2，引物 LM-1 為 5 ‘ -T GCTCTAGATTCGCATCCTCGGTTTTCTG-3 ‘；步驟七中 PCR 擴(kuò)增引物為 SD-3 和 SD-4，引物 SD-3 為 5 ‘ -GCTCTAGAGCCGTAATGAGACGCACAAACTAATATCACAAAC-3 ‘，引物 SD-4 為 5 ‘ -GTGAATTCCGG AGCTCTGCTCGAGCGAGGCCTAGCCGCCGGTCACACGCC為-3'；步驟^^一中 PCR擴(kuò)增引物為 LM-11 和 LM-12，引物 LM-11 為 5 ‘ -TGCTCTAGATTGCTGGCCTTTTGCTCACATGT-3 ‘，引物 LM-12 為 5 ‘ -TG CTCTAGAGTAATTGATTACTATTAATAACTAGTACGCGTGCG-3 ‘；步驟十三中 PCR 擴(kuò)增引物為 eGFP-f 和 eGFP-r，引物 eGFP-f 為 5 ‘ -ACTGAATTCGCCACCATGGTGAGCAAGG-3 ‘，引物 eGFP-r 為 5 ‘ -T CAGTCGACTCACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3‘。表達(dá)效果驗(yàn)證試驗(yàn)1、質(zhì)粒載體pSD-control的構(gòu)建分別對(duì)質(zhì)粒載體pMD18-T-CBA、pFastBac[pH-]進(jìn)行)(ba I與EcoRI雙酶切，獲得CBA啟動(dòng)子與pFastBactpH-]片段，膠回收并進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化Ε. coli DH5 α 感受態(tài)細(xì)胞后，以堿裂解法小量制備質(zhì)粒，鑒定陽(yáng)性克隆。以SV40-polyA-up與LM-9為引物，以質(zhì)粒載體PEGFP-C3為模板擴(kuò)增SV40-polyA片段，用EcoRI和RsrII將質(zhì)粒載體 pFastBac [pH-]-CBA與SV40-polyA片段分別進(jìn)行雙酶切，膠回收進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞后，提取重組質(zhì)粒pSD-control。2、按照本實(shí)施方式步驟十四和十五的方法構(gòu)建pSD-control-EGFP，并將 pSD-control-EGFP 轉(zhuǎn)化 DHlOBac 細(xì)胞，獲得重組載體 Bacmid-SD-control-EGFP，作為對(duì)照。3、利用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法將Bacmid-SD-control-EGFP轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒BV-SD-control-EGFP。利用倒置顯微鏡觀察正常Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞及重組病毒轉(zhuǎn)染Sf9 細(xì)胞后的細(xì)胞病變情況。隨后對(duì)細(xì)胞病變明顯的樣品進(jìn)行病毒的回收，于_70°C長(zhǎng)期保存。4、病毒的傳代及培養(yǎng)Pl代病毒滴度較低，在IXlO6 IX IOWmL之間，擴(kuò)增后滴度可達(dá)IXlO7 1 X 108pfu/mLo取ImL Pl代病毒液加入到處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的懸浮培養(yǎng)的IOmL Sf9細(xì)胞中， 27°C，70r/min懸浮培養(yǎng)。感染后觀察細(xì)胞病變，當(dāng)細(xì)胞完全裂解后，lOOOr/min離心20min， 收集上清即為P2病毒儲(chǔ)備。再取3mL P2儲(chǔ)備感染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的懸浮培養(yǎng)的30mL Sf9細(xì)胞，270C，70r/min懸浮培養(yǎng)，直至細(xì)胞100 %出現(xiàn)病變，1000r/min離心20min，上清轉(zhuǎn)入新的離心管中，此病毒液即為P3病毒儲(chǔ)備，4°C避光保存。5、雞原代胚骨骼肌細(xì)胞的制備雞骨骼肌細(xì)胞來(lái)自培養(yǎng)10-12天的雞胚細(xì)胞，小心的將皮膚從胸肌上剝離，然后將胸肌從骨骼上剝離，用剪子將其剪碎。用PBS組織塊沖洗2-3次，剪成l-2mm3的小塊。用含有0. 25 %胰蛋白酶和0. 03 % EDTA的PBS溶液37°C消化^iin后，立即加入含血清的DMEM 培養(yǎng)液終止消化，小心棄去液體保留組織塊。用2-3mL DMEM培養(yǎng)液將細(xì)胞沉淀重新懸浮， 用吸管反復(fù)吹打2-3次，用四層紗布過(guò)濾。用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，細(xì)胞密度調(diào)整至3 X IO5個(gè)/ mL接種到六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。6、重組桿狀病毒轉(zhuǎn)染雞原代胚骨骼肌細(xì)胞以每孔IX IO6個(gè)細(xì)胞將MYO接種到六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。置于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細(xì)胞呈纖維狀單層鋪滿率達(dá)80 %且生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，接種病毒。移棄DMEM培養(yǎng)液，用PBS輕輕洗滌細(xì)胞表面兩次后棄去。設(shè)定三個(gè)試驗(yàn)組(1)P3代BV-CBA-EGFP重組桿狀病毒儲(chǔ)液MOI (感染復(fù)數(shù))=50，添加丁酸鈉至終濃度為5mM ； (2) P3代BV-SD-EGFP重組桿狀病毒儲(chǔ)液MOI = 50，添加丁酸鈉至終濃度為5mM ； (3)P3代BV-SD_EGFP-ITRs重組桿狀病毒儲(chǔ)液MOI = 50，添加丁酸鈉至終濃度為5mM ；接種病毒用量通過(guò)此公式計(jì)算接種病毒體積(mL) = (Μ0Ι X細(xì)胞數(shù))/病毒滴度。接種后置于371，5%0)2培養(yǎng)箱，病毒侵染細(xì)胞2 小時(shí)后，棄去病毒液。每孔加入3mL維持液(DMEM培養(yǎng)基加2%胎牛血清)，置于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。7、CBA啟動(dòng)的EGFP重組桿狀病毒在雞原代細(xì)胞中表達(dá)的檢測(cè)細(xì)胞固定重組桿狀病毒侵染雞骨骼肌細(xì)胞4 后向每孔中加入IOOyL 4%多聚甲醛，25°C固定lOmin，棄去全部液體，每孔中加入IOOyL 4%多聚甲醛，25°C固定20min。 棄去全部液體，每孔中加入100 μ L PBS洗三遍，加入50 μ L核染料，25°C靜置20min。棄去全部液體，每孔中加入IOOyL PBS洗三遍，使固定后的細(xì)胞浸泡在PBS溶液中，4°C保存。熒光圖像的獲得利用尼康公司生產(chǎn)的TE2000型倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及EGFP表達(dá)情況，制備雞原代骨骼肌細(xì)胞(MYO)，至其在六孔細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)板上鋪滿單層時(shí)，接種P3代重組桿狀病毒儲(chǔ)液。設(shè)定三個(gè)試驗(yàn)組(1)P3代BV-SD-control-EGFP重組桿狀病毒儲(chǔ)液，MOI = 50 ； (2)P3代BV-SD-EGFP重組桿狀病毒儲(chǔ)液，MOI = 50 ； (3)P3代 BV-SD-EGFP-ITRs重組桿狀病毒儲(chǔ)液，感染復(fù)數(shù)MOI = 50。感染48小時(shí)后，觀察報(bào)告基因表達(dá)情況，圖1為重組桿狀病毒BV-SD-control-EGFP侵染MYO細(xì)胞48小時(shí)后EGFP的表達(dá)情況，圖2為重組桿狀病毒BV-SD-EGFP侵染MYO細(xì)胞48小時(shí)后EGFP的表達(dá)情況，圖3為重組桿狀病毒BV-SD-ITRs-EGFP侵染MYO細(xì)胞48小時(shí)后EGFP的表達(dá)情況。從圖中可看出，與不添加VSV-GED、WPRE調(diào)控元件及ITRs序列的 BV-SD-control-EGFP重組桿狀病毒相比，經(jīng)過(guò)修飾改造的BV-SD-EGFP重組桿狀病毒和 BV-SD-EGFP-ITRs重組桿狀病毒所介導(dǎo)的EGFP基因的表達(dá)效率明顯增強(qiáng)。
具體實(shí)施方式
二 本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟一中PCR反應(yīng)體 %% 50μ L, 2μ L Bacmid DNAUO μ L 5 X Primer STAR Buffer、4 μ L 濃度為 0. 2mmol/ μ L 的 dNTP、1 μ L 弓丨物 SD-I、1 μ L 弓丨物 SD_2、0. 5 μ L濃度為 2. 5U/ μ L 的 Primer STAR DNA 聚合酶和余量的去離子水組成；PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min，94°C變性10s，55°C退火 k，72°C延伸lmin，共30個(gè)循環(huán)，再72°C延伸lOmin。其它與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟二中PCR反應(yīng)體系為 50 μ L，由 2 μ L 質(zhì)粒 pCMV-VSVG、10 μ L 5 X Primer STAR Buffer,4 μ L 濃度為 0. 2mmol/y L 的 dNTP、ly L 引物 SD_2、ly L 引物 LM_2、0. 5μ L 濃度為 2. 5U/y L 的 Primer STAR DNA聚合酶和余量的去離子水組成；PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min，94°C變性10s，55°C退火5s，72°C延伸lmin，共30個(gè)循環(huán)，再72°C延伸lOmin。其它與具體實(shí)施方式
一相同。本實(shí)施方式所述質(zhì)粒pCMV-VSVG購(gòu)自addgene公司，質(zhì)粒pCMV-VSVG圖譜如圖4 所示。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟三中融合PCR 反應(yīng)體系為 50μ L，由 2μ L gp6hp 片段、2yL VSVGED 片段、10 μ L 5 X Primer STAR Buffer (Mg2+plus)、4 μ L 濃度為 2. 5mmol/ μ L 的 dNTP、1 μ L 濃度為 10 μ M 的引物 LM—3、1 μ L濃度為10 μ M的引物SD-2、0. 5 μ L濃度為2. 5U/ μ L的I^rimer STAR DNA聚合酶和余量的去離子水組成；PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min，94°C變性10s，55°C退火k，72°C延伸 1.5min，共30個(gè)循環(huán)，再72°C延伸lOmin。其它與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟四中將GV片段與 PMD18-T載體用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，得到質(zhì)粒pMD18_T_GV。其它與具體實(shí)施方式
一相同。本實(shí)施方式步驟四中連接反應(yīng)體系為10yL，由3μ L GV片段、IyL pMD18_T載體、5 μ LLigation solution和1 μ L去離子水組成；連接反應(yīng)條件于16°C連接10 12h。
具體實(shí)施方式
六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟五中用限制性內(nèi)切酶BamH I和Hind III分別對(duì)質(zhì)粒pFastBacl和質(zhì)粒pMD18_T_GV進(jìn)行雙酶切，然后用 T4DNA連接酶進(jìn)行連接，得到質(zhì)粒pFastBacl-GV。其它與具體實(shí)施方式
一相同。本實(shí)施方式步驟五中雙酶切反應(yīng)體系為20yL，由IyL被酶切質(zhì)粒(質(zhì)粒 pFastBacl 或質(zhì)粒 pMD18-T-GV)、2yL IOXH buffer、?！?5μ L BamH 1,0. 5μ L Hind III 和余量的去離子水組成。本實(shí)施方式步驟五中連接反應(yīng)體系為10yL，由2μ L pi^astBacl雙酶切產(chǎn)物、 0. 5 μ LpMD18-T-GV雙酶切產(chǎn)物、0. 2 μ LT4DNA連接酶和余量的去離子水組成。本實(shí)施方式所述質(zhì)粒pFastBacl購(gòu)自addgene公司，質(zhì)粒pFastBacl圖譜如圖5 所示。
具體實(shí)施方式
七本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟六中PCR反應(yīng)體系為 50yL，由 2yL pFastBacl-GV、10 μ L 5 X Primer STAR Buffer、4 μ L 濃度為 0. 2mmol/y L 的 dNTP、l μ L 引物 LM_1、1 μ L 引物 LM_2、0. 5 μ L 濃度為 2· 5U/μ L 的 Primer STAR DNA聚合酶和余量的去離子水組成；PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min，94°C變性10s， 51°C退火k，72°C延伸1.5min，共30個(gè)循環(huán)，再72°C延伸lOmin。其它與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
八本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟六中將PHGV片段與pMD18-T載體用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，得到質(zhì)粒pMD18_T-pHGV。其它與具體實(shí)施方式
一相同。本實(shí)施方式步驟六中連接反應(yīng)體系為10 μ L，由IyL 恥￥片段、3“1^ pMD18_T載體、5 μ L Ligation solution和1 μ L去離子水組成；連接反應(yīng)條件于16°C連接10 12h。
具體實(shí)施方式
九本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟七中PCR反應(yīng)體系為 50yL，由 2μ L 質(zhì)粒 PjTriExIHygroUOy L 5 X Primer STAR Buffer、4yL 濃度為 0. 2mmol/y L 的 dNTPU μ L 引物 SD-3U μ L 引物 SD_4、0. 5 μ L 濃度為 2. 5U/μ L 的 Primer STAR DNA聚合酶和余量的去離子水組成；PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min，94°C變性10s，51°C退火5s，72°C延伸1. 5min，共30個(gè)循環(huán)，再72°C延伸lOmin。其它與具體實(shí)施方式
一相同。本實(shí)施方式質(zhì)粒pTriEx_2Hygro購(gòu)自addgene公司，質(zhì)粒pTriEx_2Hygro圖譜如圖6所示。
具體實(shí)施方式
十本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟七中將CBA啟動(dòng)子與pMDIS-T載體用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，得到質(zhì)粒pMD18_T_CBA。其它與具體實(shí)施方式
一相同。本實(shí)施方式步驟七中連接反應(yīng)體系為10yL，由3μ L CBA啟動(dòng)子、IyL pMD18_T 載體、5 μ L Ligation solution和1 μ L去離子水組成；連接反應(yīng)條件于16°C連接10 12h。
具體實(shí)施方式
十一本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟八中用限制性內(nèi)切酶Xba I和Hind III分別對(duì)質(zhì)粒pFastBac [pH-]和pGM18_T-pHGV進(jìn)行雙酶切，然后用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，得到質(zhì)粒pFastBac[ρΗ-]-ρΗΒ0Χ。其它與具體實(shí)施方式
一相同。本實(shí)施方式質(zhì)粒pFastBac [pH-]購(gòu)自addgene公司，質(zhì)粒pFastBac [pH-]圖譜如圖7所示。本實(shí)施方式步驟八中雙酶切反應(yīng)體系為20yL，由IyL被酶切質(zhì)粒(質(zhì)粒 pFastBac 或質(zhì)粒 pGM18-T-pHGV)、2 μ L IOXH buffer.O. 5μ L Xba 1,0. 5μ L Hind III和余量的去離子水組成。本實(shí)施方式步驟八中連接反應(yīng)體系為10yL，由2yL pFastBac [pH-]雙酶切產(chǎn)物、0. 5μ LpGM18-T-pHGV雙酶切產(chǎn)物、1 μ L IOXligation Buffer.O. 2μ L T4DNA連接酶和余量的去離子水組成。
具體實(shí)施方式
十二 本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟九中用限制性內(nèi)切酶XbaI和EcoRI分別對(duì)質(zhì)粒pFastBac [pH-] -pHBOX和pMD18_T_CBA進(jìn)行雙酶切，然后用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，得到質(zhì)粒pSD-CBA。其它與具體實(shí)施方式
一相同。本實(shí)施方式步驟九中雙酶切反應(yīng)體系為20yL，由IyL被酶切質(zhì)粒(質(zhì)粒 pFastBac -pHBOX 或質(zhì)粒 pMD18-T-CBA)、2 μ L 10ΧΗ buffer、?！?5μ L Xbal.O. 5μ L EcoRI和余量的去離子水組成。本實(shí)施方式步驟九中連接反應(yīng)體系為10 μ L，由0. 5 μ L pFastBac [pH-] -pHBOX雙酶切產(chǎn)物、2 μ L pMD18-T-CBA 雙酶切產(chǎn)物、1 μ L IOXligation Buffer.O. 2μ L T4DNA 連接酶和余量的去離子水組成。
具體實(shí)施方式
十三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟十中用限制性內(nèi)切酶RsrII和EcoRI分別對(duì)質(zhì)粒pSD-CBA和pT-soe2進(jìn)行雙酶切，然后用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，得到質(zhì)粒PSD。其它與具體實(shí)施方式
一相同。本實(shí)施方式步驟十中雙酶切反應(yīng)體系為20yL，由IyL被酶切質(zhì)粒(質(zhì)粒 pSD-CBA或質(zhì)粒pT-soe2)、2μ L IOXH buffer.O. 5μ L RsrII.O. 5μ L EcoRI 和余量的去離子水組成。本實(shí)施方式步驟十中連接反應(yīng)體系為10yL，由0. 5yL pSD-CBA雙酶切產(chǎn)物、 2μ LpT-soe2雙酶切產(chǎn)物、1 μ L IOXligation Buffer.O. 2μ L T4DNA連接酶和余量的去離子水組成。本實(shí)施方式質(zhì)粒pT-SOe2的構(gòu)建方法為(1)片段WPRE的PCR擴(kuò)增以質(zhì)粒pWHV8為模板，以LM-8和LM-1 Ob為引物，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為 50μ L，由 2μ L pffHV8U0y L 5XPrimer STAR Buffer、4yL濃度為 0. 2mmol/y L 的 dNTP、l μ L 引物 LM_8、1 μ L 引物 LM_10b、0. 5μ L 濃度為 2. 5U/μ L 的 Primer STAR DNA聚合酶和余量的去離子水組成。PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min，94°C變性10s，55°C退火5s，72°C延伸lmin，共30個(gè)循環(huán)，再72°C延伸IOmin0引物L(fēng)M-8為5' -CGGAATTCACGCATGCTTGTCGACGTTAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGA-3 ‘，引物 LM-1 Ob 為 5 ‘ -T AAAACCTCTACAAATGTGGTATGGCTGATTAAAACAGGCGGGGAGGCGG-3‘。(2)片段pA的PCR擴(kuò)增以質(zhì)粒pEGFP_C3為模板，以LM-IOa和LM-9為引物，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)體系為 50μ L，由 2μ L pEGFP_C3、10 μ L 5 X Primer STAR Buffer, 4μ L濃度為 0. 2mmol/y L 的 dNTP、l μ L 引物 LM_10a、l μ L 引物 LM_9、0. 5 μ L 濃度為 2. 5U/ μ L的I^rimer STAR DNA聚合酶和余量的去離子水組成。PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min， 94°C變性10s，55°C退火5s，72°C延伸lmin，共30個(gè)循環(huán)，再72°C延伸IOmin0引物L(fēng)M-IOa 為 5 ‘ -CCGCCTCCCCGCCTGTTTTAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTA-3 ‘，引物 LM-9 為 5 ‘ -A TACGGTCCGTAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCAC-3‘。(3)片段WPRE與pA的融合融合PCR反應(yīng)體系為50yL，由1.5yL WPRE片段 (37ng) ,4 μ L pA 片段(266ng) UO μ L 5 XPrimer STAR Buffer (Mg2+plus)、4 μ L 濃度為 2. 5mmol/ μ L的dNTP、1 μ L濃度為10 μ M的引物L(fēng)M-8、1 μ L濃度為10 μ M的引物L(fēng)M-9、 0. 5 μ L濃度為2. 5U/ μ L的I^rimer STAR DNA聚合酶和余量的去離子水組成；PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min，94°C變性10s，55°C退火5s，72°C延伸lmin，共30個(gè)循環(huán)，再72°C延伸lOmin。對(duì)融合PCR產(chǎn)物soe2進(jìn)行膠回收純化。引物L(fēng)M-8為5 ‘ -CGGAATTCACGCATGCTT GTCGACGTTAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGA-3 ‘，引物 LM-9 為 5 ‘ -ATACGGTCCGTAAGATACA TTGATGAGTTTGGACAAACCAC-3‘。(4)片段soe2的TA克隆PCR產(chǎn)物末端加“Α”反應(yīng)體系為25yL，由2. 5 μ L 10XTaqBuffer,2y L 2. 5mM 的 dNTP Mixture、20 μ L 膠回收產(chǎn)物和 O. 5 μ L 5U/μ L 的 Taq DNA聚合酶組成，72°C反應(yīng)15分鐘。連接反應(yīng)體系為5 μ L，由0. 5 μ L pMD18_T載體、片段 soe2加“A”產(chǎn)物、Solution I和余量的ddH20組成，16°C條件下連接12h，獲得重組質(zhì)粒 pT-soe2。Solution I為pMD18_T載體配套緩沖液，內(nèi)含T4DNA連接酶，購(gòu)買自大連寶生物工程有限公司。
具體實(shí)施方式
十四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟十一中PCR 反應(yīng)體系為 50μ L，由 2μ L pAAV-LacZUOy L 5 X Primer STAR Buffer、4 μ L 濃度為 0. 2mmol/y L 的 dNTP、l μ L 引物L(fēng)M-11、1 μ L引物L(fēng)M-12、0. 5μ L濃度為 2. 5U/μ L 的Primer STAR DNA聚合酶和余量的去離子水組成；PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min，94°C變性10s， 51°C退火k，72°C延伸1.5min，共30個(gè)循環(huán)，再72°C延伸lOmin。其它與具體實(shí)施方式
一相同。本實(shí)施方式pAAV-LacZ 購(gòu)自 Biovector Science Lab 公司，pAAV-LacZ 質(zhì)粒圖譜如圖8所示。
具體實(shí)施方式
十五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟十一中用限制性內(nèi)切酶)(bal分別對(duì)質(zhì)粒載體pSD和L-ITR片段進(jìn)行單酶切，然后用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，得到質(zhì)粒pSD-L-ITR。其它與具體實(shí)施方式
一相同。本實(shí)施方式步驟十一中單酶切反應(yīng)體系為30 μ L，由20 μ L被酶切質(zhì)?；蚱?質(zhì)粒pSD或片段L-ITR)、3yL 10XM buffer、3yL XbaI和余量的去離子水組成。本實(shí)施方式步驟i^一中連接反應(yīng)體系為10 μ L，由1 μ L pSD單酶切產(chǎn)物、3 μ L片段L-ITR單酶切產(chǎn)物、5 μ L T4DNA連接酶和余量的去離子水組成。
具體實(shí)施方式
十六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟十二中用限制性內(nèi)切酶Rsr II分別對(duì)質(zhì)粒pSD-L-ITR和R-ITR片段進(jìn)行單酶切，然后用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，得到質(zhì)粒pSD-ITRs。其它與具體實(shí)施方式
一相同。本實(shí)施方式步驟十二中單酶切反應(yīng)體系為30 μ L，由20 μ L被酶切質(zhì)?；蚱?質(zhì)粒pSD-L-ITR或片段R-ITR)、3yL IOXM buffer、3yL Rsr II和余量的去離子水組成。本實(shí)施方式步驟十二中連接反應(yīng)體系為10 μ L，由2 μ L pSD_L_ITR單酶切產(chǎn)物、 0.5μ L 片段 R-ITR單酶切產(chǎn)物、IyL IOXligation Buffer、。· 2μ L T4DNA 連接酶和余量的去離子水組成。
具體實(shí)施方式
十七本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟十三中PCR反應(yīng)體系為 50μ L，由 2μ L 質(zhì)粒 pEGFP-C3、10y L 5 X Primer STAR Buffer、4 μ L 濃度為 0. 2mmol/ μ L 的 dNTP、1 μ L 引物 eGFP-f、1 μ L 引物 eGFP_r、0. 5 μ L 濃度為 2. 5U/ μ L 的 Primer STAR DNA聚合酶和余量的去離子水組成；PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min，94°C變性10s，51°C退火5s，72°C延伸1. 5min，共30個(gè)循環(huán)，再72°C延伸lOmin。其它與具體實(shí)施方式
一相同。本實(shí)施方式質(zhì)粒pEGFP-C3購(gòu)自上海研域化學(xué)試劑有限公司，質(zhì)粒pEGFP_C3圖譜如圖9所示。
具體實(shí)施方式
十八本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟十三中將EGFP 基因和pMD18-T載體用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，得到質(zhì)粒pMD18_T_EGFP。其它與具體實(shí)施方式
一相同。本實(shí)施方式步驟十三中連接反應(yīng)體系為10yL，由3yL EGFP基因、IyL pMD18_T 載體、5 μ L T4DNA連接酶和余量的去離子水組成。
具體實(shí)施方式
十九本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟十四中構(gòu)建質(zhì)粒pSD-EGFP是用限制性內(nèi)切酶EcoRI和Mil分別對(duì)質(zhì)粒pSD和pMD18_T_EGFP進(jìn)行雙酶切，然后用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，得到質(zhì)粒pSD-EGFP。其它與具體實(shí)施方式
一相同。本實(shí)施方式步驟十四中雙酶切反應(yīng)體系為20 μ L，由IyL被酶切質(zhì)粒(質(zhì)粒pSD 或質(zhì)粒 pMD18-T-EGFP)、2yL 10Xbuffer、0. 5 μ L EcoRI.O. 5μ L Sail 和余量的去離子水組成。本實(shí)施方式步驟十四中連接反應(yīng)體系為10yL，由0.5yL pSD雙酶切產(chǎn)物、 2yLpMD18-T-EGFP 雙酶切產(chǎn)物、IyL IOXligation Buffer.O. 2μ L T4DNA 連接酶和余量的去離子水組成。
具體實(shí)施方式
二十本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟十五中構(gòu)建質(zhì)粒pSD-ITRs-EGFP是用限制性內(nèi)切酶EcoRI和MlI分別對(duì)質(zhì)粒pSD-ITRs和pMD18_T_EGFP 進(jìn)行雙酶切，然后用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，得到質(zhì)粒pSD-ITRs-EGFP。其它與具體實(shí)施方式
一相同。本實(shí)施方式步驟十五中雙酶切反應(yīng)體系為20 μ L，由IyL被酶切質(zhì)粒(質(zhì)粒 pSD-ITRs 或質(zhì)粒 pMD18-T-EGFP)、2μ L 10Xbuffer,0. 5 μ L EcoRI.0. 5μ L Sail 和余量的去離子水組成。本實(shí)施方式步驟十五中連接反應(yīng)體系為10 μ L，由2 μ L pSD_ITRs雙酶切產(chǎn)物、 0. 5yLpMD18-T-EGFP 雙酶切產(chǎn)物、IyL IOXligation Buffer、0. 2 μ L T4DNA 連接酶和余量的去離子水組成。
具體實(shí)施方式
二十一本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟十六將 100 μ LDHlOBac感受態(tài)細(xì)胞分裝于2個(gè)離心管中，分別加入5 μ L的質(zhì)粒pSD-EGFP和5 μ L 的質(zhì)粒pSD-ITRs-EGFP混勻，冰中放置30min，然后42°C熱休克45s，立即冰浴2min，分別加入預(yù)先溫育的900 μ L S. 0. C培養(yǎng)基，370C 225r/min振蕩培養(yǎng)4h，用S. 0. C培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞做梯度稀釋(ΙΟ—1，ΙΟ"2, ΙΟ"3)，每個(gè)梯度中取100 μ L涂于LB瓊脂平板(含50 μ g/mL卡那霉素，7 μ g/mL 慶大霉素，10 μ g/mL 四環(huán)素，100 μ g/mL X-gal 和 40 μ g/mL IPTG.)，37°C培養(yǎng)48h，篩選白色克隆，并進(jìn)行鑒定分析，含有EGFP基因的重組陽(yáng)性Bacmid即為重組載體 Bacmid-SD-EGFP和Bacmid-SD-ITRs-EGFP。其它與具體實(shí)施方式
一相同。
權(quán)利要求
1.具有CBA啟動(dòng)子的可表達(dá)EGFP的重組桿狀病毒的構(gòu)建方法，其特征在于具有CBA啟動(dòng)子的可表達(dá)EGFP的重組桿狀病毒的構(gòu)建方法，按以下步驟進(jìn)行一、PCR 擴(kuò)增 Bacmid DNA 中的 gp64sp 片段；二、PCR 擴(kuò)增 pCMV-VSVG 中的 VSVGED 片段；三、融合PCR擴(kuò)增gp64sp-VSVGED融合片段；四、將GV片段引入pMD18_T載體，構(gòu)建質(zhì)粒 pMD18-T-GV ；五、構(gòu)建質(zhì)粒 pFastBacl-GV ；六、PCR 擴(kuò)增 pFastBacl-GV 中的 pHGV 片段， 將pHGV片段引入pMD18-T載體，構(gòu)建質(zhì)粒pGM18_T-pHGV ；七、PCR擴(kuò)增質(zhì)粒pTriEx_2Hygro 中的CBA啟動(dòng)子，將CBA啟動(dòng)子克隆至pMD18-T載體，構(gòu)建質(zhì)粒pMD18_T_CBA ；八、構(gòu)建質(zhì)粒載體PFastBac [pH_]-pHBOX ；九、構(gòu)建質(zhì)粒載體pSD_CBA ；十、構(gòu)建質(zhì)粒載體pSD ； 十一、PCR擴(kuò)增質(zhì)粒pAAV-LacZ中的L-ITR片段和R-ITR片段，將L-ITR片段引入質(zhì)粒載體pSD，構(gòu)建質(zhì)粒pSD-L-ITR ；十二、將R-ITR片段引入質(zhì)粒pSD-L-ITR，構(gòu)建pSD-ITRs ； 十三、PCR擴(kuò)增質(zhì)粒pEGFP-C3中的EGFP基因，將EGFP基因克隆至pMD18_T載體，構(gòu)建質(zhì)粒pMD18-T-EGFP ；十四、構(gòu)建質(zhì)粒pSD_EGFP ；十五、構(gòu)建質(zhì)粒pSD_ITRs_EGFP ；十六、質(zhì)粒 pSD-EGFP和質(zhì)粒pSD-ITRs-EGFP分別轉(zhuǎn)化DHlOBac細(xì)胞，獲得重組載體Bacmid-SD-EGFP 和Bacmid-SD-ITRs-EGFP ；十七、利用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法將Bacmid-SD-EGFP和 Bacmid-SD-ITRs-EGFP 轉(zhuǎn)染 Sf9 細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒 BV-SD-EGFP 和 BV-SD_ITRs_EGFP ； 其中步驟一中 PCR 擴(kuò)增引物為 SD-I 和 SD-2，引物 SD-I 為 5 ‘ -CGCGGATCCATGCTACTAGTAAA TCAGTCACACCAAG-3 ‘，引物 SD-2 為 5 ‘ -ATTTTTGGATAGCCCAGTATCCGCAAAGGCAGAATGC-3 ‘； 步驟二中 PCR 擴(kuò)增引物為 SD-2 和 LM-2，引物 LM-2 為 5 ‘ -CCCAAGCTTACTTTCCAAGTCGGTTCAT CTCTAT-3‘；步驟三中融合PCR擴(kuò)增引物為L(zhǎng)M-3和SD-2，引物L(fēng)M-3為5' -CGCGGATCCATGC TACTAGTAAATCAGTCACACCAAG-3 ‘；步驟六中 PCR 擴(kuò)增引物為 LM-1 和 LM-2，引物 LM-1 為 5 ‘ -TGCTCTAGATTCGCATCCTCGGTTTTCTG-3 ‘；步驟七中 PCR 擴(kuò)增引物為 SD-3 和 SD-4，引物 SD-3 為 5' -GCTCTAGAGCCGTAATGAGACGCACAAACTAATATCACAAAC-3'，引物SD-4 為 5' -GTGAATTCC GGAGCTCTGCTCGAGCGAGGCCTAGCCGCCGGTCACACGCC-3 ‘；步驟i^一中 PCR 擴(kuò)增引物為 LM-11 和 LM-12，引物 LM-11 為 5 ‘ -TGCTCTAGATTGCTGGCCTTTTGCTCACATGT-3 ‘，引物 LM-12 為 5 ‘ -TG CTCTAGAGTAATTGATTACTATTAATAACTAGTACGCGTGCG-3 ‘；步驟十三中 PCR 擴(kuò)增引物為 eGFP-f 和 eGFP-r，引物 eGFP-f 為 5 ‘ -ACTGAATTCGCCACCATGGTGAGCAAGG-3 ‘，引物 eGFP-r 為 5 ‘ -T CAGTCGACTCACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3‘。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述具有CBA啟動(dòng)子的可表達(dá)EGFP的重組桿狀病毒的構(gòu)建方法,其特征在于步驟一中PCR反應(yīng)體系為50yL，由2μ L Bacmid DNAUO μ L 5 X Primer STAR Buffer、4 μ L 濃度為 0. 2mmol/ μ L 的 dNTP、l μ L 引物 SD-1、1 μ L 引物 SD_2、0. 5 μ L 濃度為2. 5U/y L的I^rimer STAR DNA聚合酶和余量的去離子水組成；PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min，94°C變性10s，55°C退火5s，72°C延伸lmin，共30個(gè)循環(huán)，再72°C延伸IOmin0
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述具有CBA啟動(dòng)子的可表達(dá)EGFP的重組桿狀病毒的構(gòu)建方法，其特征在于步驟二中PCR反應(yīng)體系為50μ L，由2μ L質(zhì)粒pCMV-VSVG、10μ L 5 X Primer STAR Buffer、4y L 濃度為 0. 2mmol/y L 的 dNTP、l μ L 引物 SD-2U μ L 引物 LM_2、0. 5 μ L 濃度為 2. 5U/ μ L的I^rimer STAR DNA聚合酶和余量的去離子水組成；PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 10s，55°C退火 5s，72°C延伸 lmin，共 30 個(gè)循環(huán)，再 72°C延伸 IOmin0
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述具有CBA啟動(dòng)子的可表達(dá)EGFP的重組桿狀病毒的構(gòu)建方法， 其特征在于步驟三中融合PCR反應(yīng)體系為50yL，由2μ L 8 64印片段、2111^ VSVGED片段、.10 μ L 5 XPrimer STAR Buffer (Mg2+plus)、4 μ L 濃度為 2. 5mmol/μ L 的 dNTP、1 μ L 濃度為10 μ M的引物L(fēng)M-3、1 μ L濃度為10 μ M的引物SD-2、0. 5 μ L濃度為2. 5U/ μ L的Primer STAR DNA聚合酶和余量的去離子水組成；PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min，94°C變性10s， 55°C退火k，72°C延伸1.5min，共30個(gè)循環(huán)，再72°C延伸IOmin0
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述具有CBA啟動(dòng)子的可表達(dá)EGFP的重組桿狀病毒的構(gòu)建方法，其特征在于步驟六中PCR反應(yīng)體系為50μ L，由2μ L pFastBacl-GVUOy L 5XPrimer STAR Buffer、4y L 濃度為 0. 2mmol/y L 的 dNTP、1 μ L 引物 LM_1、1 μ L 引物 LM_2、0. 5 μ L 濃度為 2. 5U/ μ L的I^rimer STAR DNA聚合酶和余量的去離子水組成；PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 10s，51°C退火 5s，72°C延伸 1. 5min，共 30 個(gè)循環(huán)，再 72°C延伸 IOmin0
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述具有CBA啟動(dòng)子的可表達(dá)EGFP的重組桿狀病毒的構(gòu)建方法，其特征在于步驟七中PCR反應(yīng)體系為50 μ L，由2 μ L質(zhì)粒PiTriExjHygroUO μ L 5 X Primer STAR Buffer、4y L濃度為 0. 2mmol/μ L 的 dNTP、1 μ L 引物 SD-3、1 μ L 引物 SD_4、0. 5 μ L濃度為2. 5U/y L的I^rimer STAR DNA聚合酶和余量的去離子水組成；PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min，94°C變性10s，51°C退火5s，72°C延伸1. 5min，共30個(gè)循環(huán)，再72°C延伸IOmin0
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述具有CBA啟動(dòng)子的可表達(dá)EGFP的重組桿狀病毒的構(gòu)建方法，其特征在于步驟i^一中 PCR 反應(yīng)體系為 50 μ L，由 2 μ L pAAV-LacZUO μ L 5 X Primer STAR Buffer、4y L 濃度為 0. 2mmol/y L 的 dNTP、1 μ L 引物 LM_11、1 μ L 引物 LM_12、0. 5 μ L 濃度為2. 5U/y L的I^rimer STAR DNA聚合酶和余量的去離子水組成；PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 10s，51°C退火 5s，72°C延伸 1. 5min，共 30 個(gè)循環(huán)，再 72°C延伸 IOmin0
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述具有CBA啟動(dòng)子的可表達(dá)EGFP的重組桿狀病毒的構(gòu)建方法， 其特征在于步驟十三中PCR反應(yīng)體系為50yL，由2 μ L質(zhì)粒pEGFP_C3、10 μ L 5XPrimer STAR Buffer,4 μ L 濃度為 0. 2mmol/ μ L 的 dNTP、1 μ L 弓 | 物 eGFP-f、1 μ L 弓 | 物 eGFP-r、 0. 5 μ L濃度為2. 5U/ μ L的I^rimer STAR DNA聚合酶和余量的去離子水組成；PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min，94°C變性10s，51°C退火5s，72°C延伸1. 5min，共30個(gè)循環(huán)，再72°C 延伸lOmin。
全文摘要
具有CBA啟動(dòng)子的可表達(dá)EGFP的重組桿狀病毒的構(gòu)建方法，涉及一種具有CBA啟動(dòng)子的可表達(dá)EGFP的重組桿狀病毒的構(gòu)建方法。解決現(xiàn)有重組桿狀病毒介導(dǎo)的基因表達(dá)效率低的問(wèn)題。方法依次構(gòu)建pMD18-T-GV、pFastBac1-GV、pGM18-T-pHGV、pMD18-T-CBA、pFastBac[pH-]-pHBOX、pSD-CBA、pSD、pSD-L-ITR和pSD-ITRs；構(gòu)建pMD18-T-EGFP；構(gòu)建pSD-EGFP；構(gòu)建pSD-ITRs-EGFP；轉(zhuǎn)化DH10Bac細(xì)胞，獲得重組載體；轉(zhuǎn)染，獲得重組桿狀病毒。經(jīng)過(guò)修飾改造的重組桿狀病毒所介導(dǎo)的EGFP基因的表達(dá)效率明顯增強(qiáng)。
文檔編號(hào)C12N15/66GK102533861SQ20121001279
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月16日
發(fā)明者平文祥, 樓莊偉, 葛菁萍, 高冬妮 申請(qǐng)人:黑龍江大學(xué)