一種表面展示有h5n1流感病毒ha蛋白的家蠶重組桿狀病毒的純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及病毒純化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種表面展示有H5N1流感病毒HA蛋白 (75KD)的家蠶重組桿狀病毒的純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 桿狀病毒基因組為130kb左右，因此可以容納較大的外源DNA片段。病毒基因組 中多角體蛋白基因是病毒感染晚期高效表達(dá)的基因，卻是病毒復(fù)制增殖的非必需區(qū)，因此 適于插入外源基因的多拷貝。該基因受強(qiáng)啟動(dòng)子調(diào)控，可較高水平表達(dá)外源蛋白。外源DNA 插入多角體蛋白基因內(nèi)，使此基因功能喪失，不能再合成多角體蛋白。而野生型病毒多角體 蛋白基因表達(dá)出大量產(chǎn)物形成包涵體，篩選時(shí)極易將之與重組病毒區(qū)別開(kāi)來(lái)。另外，桿狀病 毒表面展示系統(tǒng)能夠完成翻譯后蛋白質(zhì)的加工修飾，使外源產(chǎn)物具有較高生物學(xué)活性。
[0003]本申請(qǐng)人構(gòu)建了重組家蠶桿狀病毒，將H5N1型流感病毒表面HA蛋白與桿狀病毒 囊膜表面gp64蛋白在家蠶細(xì)胞中融合表達(dá)，其定位于受重組桿狀病毒感染的家蠶細(xì)胞膜 表面。當(dāng)桿狀病毒通過(guò)出芽方式從細(xì)胞釋放出來(lái)時(shí)，大部分病毒會(huì)形成帶有融合蛋白的病 毒包膜。這樣，通過(guò)篩選就可以鑒定出表面展示有目的蛋白（HA蛋白）的重組桿狀病毒。
[0004] 純化病毒的方法主要有沉淀法、離心法和透析法等。目前病毒粒子的純化大多用 離心法，較常使用的梯度材料有蔗糖、甘油、氯化銫和重水等?，F(xiàn)有的表面展示有H5N1流感 病毒HA蛋白的家蠶重組桿狀病毒粒子的純化方法，存在步驟復(fù)雜繁瑣，成本較高，純化效 率低等問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)以上現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新的表面展示 有H5N1流感病毒HA蛋白的家蠶重組桿狀病毒的純化方法，該方法主要依據(jù)HA蛋白和病毒 粒子分子量大小，通過(guò)簡(jiǎn)單的勻漿，低速離心，高速離心，超速離心超濾和過(guò)濾方法，獲得具 有較純的在家蠶桿狀病毒表面展示有禽流感H5N1HA蛋白的病毒粒子。
[0006]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：
[0007] -種表面展示有H5N1流感病毒HA蛋白的家蠶重組桿狀病毒的純化方法，它以感 染了重組桿狀病毒NPV-gp64-HA的蠶蛹為原料，與無(wú)菌水進(jìn)行混合后進(jìn)行勻漿，取勻漿液 低速離心，取低速離心的稠狀溶液高速離心，取高速離心的上清用0. 1Um膜包超濾，取截 留液超速離心，得到黑團(tuán)用超濾液重懸過(guò)夜，蔗糖密度梯度離心，然后取區(qū)帶后活性高的樣 品，300KD膜包超濾，0. 22ym濾膜過(guò)濾，收集截留液，獲得表面展示有H5N1流感病毒HA蛋 白的病毒粒子。
[0008] 作為優(yōu)選，所述蠶蛹與無(wú)菌水混合的質(zhì)量比為1 :3。
[0009] 作為優(yōu)選，所述低速離心在20°C的溫度條件下進(jìn)行；所述高速離心在4°C的溫度 條件下進(jìn)行；所述超速離心在l〇°C的溫度條件下進(jìn)行。
[0010] 作為優(yōu)選，所述低速離心速率為8000rpm;所述高速離心的速率為15000rpm;所述 超速離心的速率為50000rpm;所述蔗糖密度梯度離心的速率為35000rpm。
[0011] 作為優(yōu)選，所述蔗糖密度梯度離心所用蔗糖密度為30%蔗糖、55%蔗糖。所用試劑 PB:NaC185. 0g、Na2HP0470. 0g、NaH2P043 . 4g、EDTA4. 0g倒入裝有純化水的 5L燒杯中，溶解后 用1L量筒定容至1L。
[0012] 作為優(yōu)選，所述區(qū)帶后活性高的樣品在超濾之前，用1 :4000的丙內(nèi)酯，4°C滅 活24小時(shí)，37°C水解4小時(shí)。
[0013]作為優(yōu)選，所述超濾液為：NaC185g、Na2HP0470g、NaH2P043. 4g、EDTA4g、檸檬酸鈉 50g倒入裝有純化水的5L燒杯中，溶解后用1L量筒定容至1L。
[0014] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下顯著優(yōu)點(diǎn)和有益效果：
[0015] 本發(fā)明的純化方法減少了對(duì)目的蛋白的損傷及損耗，能夠利用最簡(jiǎn)單的步驟獲得 大量較純的帶有H5N1流感病毒HA蛋白的病毒粒子，操作簡(jiǎn)單且成本低廉。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1所示的是融合基因gp64-HA的PCR鑒定圖，其中M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:空白 對(duì)照；2、融合片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0017] 圖2所示的是載體pFastBacl的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0018] 圖3所示的是含有g(shù)p64_HA序列的重組質(zhì)粒pFstBacl-gp64_HA構(gòu)建示意圖，其 中Pph:多角體啟動(dòng)子；SP:gp64基因的信號(hào)肽序列；HA:HA蛋白；TM:gp64基因的跨膜區(qū)序 列；BamHI、NotI:酶切位點(diǎn)。
[0019] 圖4所示的是重組桿狀病毒NPV-gp64-HA的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0020] 圖5所示的是純化后的病毒粒子的電泳檢測(cè)圖，其中M:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；S:標(biāo)準(zhǔn) 品；1:純化樣品一；2:純化樣品二，樣品一和樣品二作為重復(fù)。
[0021] 圖6所示的是純化后的病毒粒子的Westernblot檢測(cè)圖，其中M:蛋白分子量標(biāo) 準(zhǔn)；S:標(biāo)準(zhǔn)品；1:純化樣品一；2:純化樣品二，樣品一和樣品二作為重復(fù)。
[0022] 序列表信息：
[0023]SEQIDN0 :1:桿狀病毒NPVgp64 7[目號(hào)膚基因序列；
[0024]SEQIDN0 :2:桿狀病毒NPVgp64跨膜域基因序列；
[0025]SEQIDNO:3 :H5N1型流感病毒HA蛋白基因序列；
[0026]SEQIDNO:4:上游引物Pspl;
[0027]SEQIDNO:5:下游引物Psp2;
[0028]SEQIDNO:6:上游引物Phal;
[0029]SEQIDNO:7:下游引物Pha2;
[0030]SEQIDNO:8:上游引物Ptml;
[0031]SEQIDNO:9:下游引物Ptm2;
[0032]SEQIDNO:10:在家蠶蛹中表達(dá)的重組HA融合蛋白。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 以下具體說(shuō)明都是例示性的，旨在對(duì)本發(fā)明提供進(jìn)一步的說(shuō)明。除非另有說(shuō)明，本 發(fā)明所使用的所有科學(xué)和技術(shù)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域人員通常理解的相同含義。
[0034] 本實(shí)施例根據(jù)高致病性禽流感毒香港分離株（H5N1)表面的HA蛋白基因信息進(jìn)行 人工合成，插入到桿狀病毒表面展示載體，將其表達(dá)并展示在桿狀病毒的囊膜表面，形成表 面攜帶HA胞外結(jié)構(gòu)域的病毒顆粒NPV-gp64-HA。以此NPV-gp64-H