一種小鼠脾臟細(xì)胞的培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種小鼠脾臟細(xì)胞的培養(yǎng)方法，具體涉及一種能夠使小鼠脾臟細(xì)胞長(zhǎng) 期貼壁的培養(yǎng)方法，屬于生命科學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 原代細(xì)胞不僅廣泛應(yīng)用于分子、細(xì)胞生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研宄，如蛋白質(zhì)組學(xué)、 基因組學(xué)、細(xì)胞株研宄等，還可應(yīng)用于當(dāng)今熱門的生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)如藥物篩選、藥物代謝和毒 理研宄等。原代細(xì)胞在生物醫(yī)藥領(lǐng)域有不可替代性作用，市場(chǎng)前景廣闊。通常原代細(xì)胞不 能長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)，并且傳代2-3次后就無法繼續(xù)傳代。
[0003] 脾臟是機(jī)體最大的免疫器官，占全身淋巴組織總量的25%，含有大量的淋巴細(xì)胞 和巨噬細(xì)胞，是機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的中心。脾臟中有許多細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)不能貼 壁生長(zhǎng)，例如B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞、NK細(xì)胞等，但也有一些細(xì)胞能夠貼壁生長(zhǎng)。 貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞對(duì)不能貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞在固定、分化等方面起著重要作用。雖然目前已經(jīng) 對(duì)如B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等脾臟中不能貼壁的細(xì)胞已經(jīng)進(jìn)行了很多詳細(xì)的研宄，但是對(duì) 脾臟中能貼壁的細(xì)胞研宄較少，因此急需一種能夠使小鼠脾臟細(xì)胞長(zhǎng)期貼壁生長(zhǎng)的培養(yǎng)方 法，以為對(duì)這些細(xì)胞的研宄奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種小鼠脾臟細(xì)胞的培養(yǎng)方 法，該培養(yǎng)方法能夠?qū)崿F(xiàn)小鼠脾臟中貼壁細(xì)胞的連續(xù)傳代，能夠使小鼠脾臟細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)間 超過六個(gè)月。
[0005] 為解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：
[0006] -種小鼠脾臟細(xì)胞的培養(yǎng)方法，該培養(yǎng)方法包括如下步驟：
[0007] 1)分離脾臟細(xì)胞：無菌條件下取出小鼠脾臟，然后采用80~150目的篩網(wǎng)碾磨分 離脾臟細(xì)胞，邊碾磨邊滴加含有體積分?jǐn)?shù)為20 %的胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液；然后收集 篩網(wǎng)濾出液；
[0008] 2)在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入含有體積分?jǐn)?shù)為10~20 %的胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng) 液，將步驟1)收集的篩網(wǎng)濾出液轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中并置于36~38°C、0. 5%C02條件下 進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為45~75天；
[0009] 3)當(dāng)步驟2)中的細(xì)胞長(zhǎng)滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶時(shí)，按照1 :2的比例進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)。
[0010] 在上述方法中，在分離脾臟細(xì)胞之前還包括以下前處理步驟：
[0011] 1)配制小鼠表面消毒液：往濃度為75%的酒精中加入0. 1~0. 5M的NaOH和占酒 精體積〇. 1~1%的甲醛，攪拌均勻待用；
[0012] 2)小鼠前處理：將小鼠脫臼處死，然后將小鼠放入步驟1)中制得的消毒液中消毒 至少30min，處理溫度為20~25°C。
[0013] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，在進(jìn)行小鼠消毒過程中使用鑷子或其他工具晃動(dòng)小鼠， 以促使消毒液與小鼠的體表和毛發(fā)全方位接觸。
[0014] 具體地，在步驟1)分離脾臟細(xì)胞中含有20%的胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液的滴 加量為5~15ml。
[0015] 具體地，在步驟2)和步驟3)連續(xù)傳代培養(yǎng)的培養(yǎng)過程中每隔15天更換培養(yǎng)液。
[0016] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，連續(xù)傳代培養(yǎng)每個(gè)代次的培養(yǎng)時(shí)間為30~45天。
[0017] 實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的一種實(shí)施方式是：所述連續(xù)傳代培養(yǎng)至少傳代5代以上。
[0018] 具體地，第一次傳代的細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間為60天；第二次傳代的細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間為45 天；第三次傳代的細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間為40天；第四次傳代的細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間為40天；第五次傳代 的細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間為35天。
[0019] 相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：
[0020] 本發(fā)明所述的小鼠脾臟細(xì)胞的培養(yǎng)方法通過采用含有10~20 %胎牛血清的 RPMI1640培養(yǎng)液對(duì)小鼠脾臟細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并通過合理控制小鼠脾臟中貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)條 件和傳代時(shí)間，使得小鼠脾臟貼壁細(xì)胞能夠1~2月傳一代，很好地解決了目前普通的哺乳 動(dòng)物傳代培養(yǎng)方法不能實(shí)現(xiàn)小鼠脾臟中貼壁細(xì)胞的連續(xù)傳代和長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)的問題，大大延 長(zhǎng)了小鼠脾臟細(xì)胞中貼壁細(xì)胞的生長(zhǎng)時(shí)間，實(shí)現(xiàn)了小鼠脾臟中貼壁細(xì)胞的連續(xù)傳代，能夠 使小鼠脾臟中貼壁細(xì)胞連續(xù)傳代5代以上，生長(zhǎng)時(shí)間超過6個(gè)月。
[0021] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
【附圖說明】
[0022] 圖1為按本發(fā)明所述方法培養(yǎng)的脾臟細(xì)胞F1代生長(zhǎng)第3天時(shí)的細(xì)胞狀況圖；
[0023] 圖2為脾臟細(xì)胞F1代生長(zhǎng)第15天時(shí)的細(xì)胞狀況圖；
[0024] 圖3為脾臟細(xì)胞F1代生長(zhǎng)第30天時(shí)的細(xì)胞狀況圖；
[0025] 圖4為脾臟細(xì)胞F1代生長(zhǎng)第60天長(zhǎng)滿時(shí)的細(xì)胞狀況圖；
[0026] 圖5為脾臟細(xì)胞F2代生長(zhǎng)第15天時(shí)的細(xì)胞狀況圖；
[0027] 圖6為脾臟細(xì)胞F2代生長(zhǎng)第30天時(shí)的細(xì)胞狀況圖；
[0028] 圖7為脾臟細(xì)胞F2代生長(zhǎng)第45天長(zhǎng)滿時(shí)的細(xì)胞狀況圖；
[0029] 圖8為脾臟細(xì)胞F3代生長(zhǎng)第15天時(shí)的細(xì)胞狀況圖；
[0030] 圖9為脾臟細(xì)胞F3代生長(zhǎng)第40天長(zhǎng)滿時(shí)的細(xì)胞狀況圖；
[0031] 圖10為脾臟細(xì)胞F4代生長(zhǎng)第15天時(shí)的細(xì)胞狀況圖；
[0032] 圖11為脾臟細(xì)胞F4代生長(zhǎng)第40天長(zhǎng)滿時(shí)的細(xì)胞狀況圖；
[0033] 圖12為脾臟細(xì)胞F5代生長(zhǎng)第15天時(shí)的細(xì)胞狀況圖；
[0034] 圖13為脾臟細(xì)胞F5代生長(zhǎng)第35天長(zhǎng)滿時(shí)的細(xì)胞狀況圖。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 實(shí)施例1 :
[0036] -種小鼠脾臟細(xì)胞的培養(yǎng)方法，該培養(yǎng)方法包括如下步驟：
[0037] 1)配制小鼠表面消毒液：往濃度為75%的酒精中加入0. 2M的NaOH和占酒精體積 0.1 %的甲醛，攪拌均勻待用；
[0038] 2)小鼠前處理：將BALB/c小鼠脫白處死，然后將小鼠放入步驟1)中制得的消毒 液中消毒30min，處理溫度為25°C，消毒過程中使用鑷子或其他工具晃動(dòng)小鼠，趕出附著在 皮膚和毛發(fā)上的氣體，以促使消毒液與小鼠的體表和毛發(fā)全方位接觸；
[0039] 3)分離脾臟細(xì)胞：無菌條件下取出小鼠脾臟，然后采用100目的篩網(wǎng)碾磨分離脾 臟細(xì)胞，邊碾磨邊滴加l〇ml含有20%的胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液（Gibco公司）；然后 收集篩網(wǎng)濾出液；
[0040] 4)在25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入含有體積分?jǐn)?shù)為20%的胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng) 液（Gibco公司），將步驟1)收集的篩網(wǎng)濾出液轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中并置于37°C、0. 5%C02 條件下進(jìn)行培養(yǎng)；
[0041] 5)培養(yǎng)過程中每隔15天更換培養(yǎng)基，當(dāng)步驟2)中的細(xì)胞長(zhǎng)滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶時(shí)，按照 1 :2的比例進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)；
[0042] 6)細(xì)胞第一次傳代后將細(xì)胞置于相同的條件下培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶時(shí)按 照1 :2的比例進(jìn)行連續(xù)傳代。
[0043] 上述細(xì)胞連續(xù)傳代情況如圖1~圖13、下表所示：
[0044] 表1、細(xì)胞連續(xù)傳代情況
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種小鼠脾臟細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于：該培養(yǎng)方法包括如下步驟： 1) 分離脾臟細(xì)胞：無菌條件下取出小鼠脾臟，然后采用80~150目的篩網(wǎng)碾磨分離脾 臟細(xì)胞，邊碾磨邊滴加含有體積分?jǐn)?shù)為20%的胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液；然后收集篩網(wǎng) 濾出液； 2) 在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入含有體積分?jǐn)?shù)為10~20%的胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，將 步驟1)收集的篩網(wǎng)濾出液轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中并置于36~38°C、0. 5%C02條件下進(jìn)行培 養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為45~75天； 3) 當(dāng)步驟2)中的細(xì)胞長(zhǎng)滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶時(shí)，按照1 :2的比例進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的小鼠脾臟細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于：在分離脾臟細(xì)胞之 前還包括以下前處理步驟： 1) 配制小鼠表面消毒液：往濃度為75%的酒精中加入0. 1~0. 5M的NaOH和占酒精體 積0. 1~1%的甲醛，攪拌均勻待用； 2) 小鼠前處理：將小鼠脫臼處死，然后將小鼠放入步驟1)中制得的消毒液中消毒至少 30min，處理溫度為20~25°C。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的小鼠脾臟細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于：在進(jìn)行小鼠消毒過 程中使用鑷子或其他工具晃動(dòng)小鼠，以促使消毒液與小鼠的體表和毛發(fā)全方位接觸。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的小鼠脾臟細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于：在步驟1)中含有 20%的胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液的滴加量為5~15ml。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的小鼠脾臟細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于：培養(yǎng)過程中每隔15 天更換培養(yǎng)液。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的小鼠脾臟細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于：連續(xù)傳代培養(yǎng)每個(gè) 代次的培養(yǎng)時(shí)間為30~45天。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的小鼠脾臟細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于：所述連續(xù)傳代培養(yǎng) 至少傳代5代以上。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的小鼠脾臟細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于：第一次傳代的細(xì)胞 培養(yǎng)時(shí)間為60天；第二次傳代的細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間為45天；第三次傳代的細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間為40 天；第四次傳代的細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間為40天；第五次傳代的細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間為35天。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種小鼠脾臟細(xì)胞的培養(yǎng)方法，具體涉及一種能夠使小鼠脾臟細(xì)胞長(zhǎng)期貼壁的培養(yǎng)方法，屬于生命科學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。該培養(yǎng)方法包括如下步驟：1)分離脾臟細(xì)胞：無菌條件下取出小鼠脾臟，然后采篩網(wǎng)碾磨分離脾臟細(xì)胞，收集篩網(wǎng)濾出液；2)在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入培養(yǎng)液，將步驟1)收集的篩網(wǎng)濾出液轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為45～75天，培養(yǎng)過程中每隔15天更換培養(yǎng)基；4)當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶時(shí)按照1：2的比例進(jìn)行連續(xù)傳代。該培養(yǎng)方法能夠?qū)崿F(xiàn)小鼠脾臟中貼壁細(xì)胞的連續(xù)傳代，能夠使小鼠脾臟細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)間超過六個(gè)月。
【IPC分類】C12N5-078
【公開號(hào)】CN104711222
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510152418
【發(fā)明人】蔣春英, 陳瑞愛, 徐家華, 王新秋, 張東霞
【申請(qǐng)人】肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司, 廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司
【公開日】2015年6月17日
【申請(qǐng)日】2015年3月31日