專利名稱：變形鏈球菌表面蛋白基因疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說是涉及到一種變形鏈球菌表面蛋白基因疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
齲病(Caries)是危害人類健康的主要口腔疾病，被WHO列為三大嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一。目前在我國齲病發(fā)生率有上升的趨勢，兒童和老年人發(fā)病率甚至高達80％以上，因此找出控制齲病的有效措施是當(dāng)前的緊迫任務(wù)。
由于齲病是一種細菌性疾病，變形鏈球菌(Streptococcus mutans，S.mutans)是齲病的主要致齲菌，它在牙面的粘附和集聚是齲病發(fā)生的先決條件。分子量為190KDa的表面蛋白(surface protein，PAc)是變鏈菌的主要粘附毒力因子之一，介導(dǎo)變形鏈球菌細胞對牙面的蔗糖非依賴性黏附或蔗糖依賴性黏附，在齲病的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。目前已成功地克隆了PAc編碼基因，并對其蛋白與基因序列進行了分析。PAc編碼基因pac全長4695bp，編碼合成具1565個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。
免疫防治是控制齲病的有效手段之一(Childers NK，Tong G.Michalek SM.Nasalimmunization of humans with dehydrated liposomes containing Streptococcus mutans antigen.Oral Microbiol Immunol，1997，12(6)329-335)。國外在曾嘗試用主要致齲菌變鏈菌的減毒全菌疫苗進行免疫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)變形鏈球菌全菌多價疫苗可降低齲病發(fā)生率，但變形鏈球菌某些抗原成分可誘發(fā)抗體與人類心臟組織發(fā)生交叉反應(yīng)。近年來，先后采用了亞單位疫苗、多肽疫苗等手段進行免疫防齲，但仍存在疫苗制備困難、成本高、免疫原性弱、免疫效力短等缺點。
目前，急需開發(fā)出能克服現(xiàn)有疫苗缺點的新型變形鏈球菌疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的是提供一種治療和預(yù)防變形鏈球菌相關(guān)疾病的疫苗。該疫苗含有如序列SEQ ID No.3所示的的變形鏈球菌表面蛋白編碼基因。
進一步的，上述變形鏈球菌表面蛋白編碼基因裝載于表達載體上。
優(yōu)選的，所述的表達載體是真核表達載體。
進一步優(yōu)選的，所述的真核表達載體是質(zhì)粒。
其中，上述的變形鏈球菌相關(guān)疾病為齲病。
本發(fā)明的第二個目的在于提供一種制備上述疫苗的方法。該方法包括以下步驟a、設(shè)計合成如SEQ ID No.1所示的特異性上游引物5’-GGCGGTACCATGAAGGTCAAAAAAACTTA-3’和如SEQ ID No.2所示的特異性下游引物5’-CGCCTCGAGTTAATCTTTCTTAGCCTTTA-3’，用這對引物從變鏈菌基因組DNA中擴增制備變形鏈球菌表面蛋白編碼基因；b、將所得變形鏈球菌表面蛋白編碼基因裝載在表達載體上。
本發(fā)明的第三個目的在于提供一種藥物組合物。該藥物組合物含有上述的疫苗以及藥學(xué)上可以接受的載體和賦形劑。
進一步的，上述藥物組合物還含有免疫佐劑。
優(yōu)選的，上述的免疫佐劑是氫氧化鋁、脂質(zhì)體或霍亂毒素B亞單位。
其中，上述藥物組合物是口服制劑、口含制劑或注射劑。
用于制備本發(fā)明基因疫苗的載體是本領(lǐng)域已知的，如重組噬菌體、質(zhì)粒、腺病毒載體和其他的經(jīng)加工后可以裝載變形鏈球菌表面蛋白編碼基因的表達載體，尤其是真核表達載體。同時，需要說明的是以上生產(chǎn)和操作本發(fā)明公開的重組載體和藥物組合物的具體技術(shù)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并可按照已描述的技術(shù)完成。
本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明基因疫苗具有制備方法簡便、成本低廉、抗原在細胞內(nèi)的表達與病原體自然感染過程相似、能夠持續(xù)高水平的誘導(dǎo)針對變形鏈球菌表面蛋白的免疫反應(yīng)、安全性高等優(yōu)點，可以彌補現(xiàn)有藥物昂貴、體內(nèi)穩(wěn)定性差等缺陷，能增大給藥時間的間隔、大大減少給藥量、減輕使用者經(jīng)濟負擔(dān)并提高患者的生活質(zhì)量。動物實驗也證明了本發(fā)明基因疫苗對齲病具有明顯的療效，并且經(jīng)檢測該基因疫苗不會整合進宿主細胞的基因組，也不會對使用者造成體重降低等其他不良影響，具有很好的安全性，符合用藥要求，具有很好的市場前景。


圖1為PCR擴增出的pac全片段的1％瓊脂糖電泳圖，其中M為λDNA/HindIII分子量Marker，1和2都為擴增所得的pac基因全片段(4.7Kb)。
圖2為重組質(zhì)粒pcDNA3-gtfB的構(gòu)建流程圖。
圖3為重組質(zhì)粒pcDNA3-PAc酶切鑒定圖，其中M1為λDNA/HindIII酶切，M2為λDNA/HindIII+EcoRI雙酶切；1為XhoI酶切，2為KpnI酶切，3為BamHI酶切，4為KpnI+XhoI雙酶切，5為HindIII酶切，6為HindIII+XhoI雙酶切，7為PstI酶切。
圖4為點免疫印跡檢測pac基因表達產(chǎn)物結(jié)果圖，其中1與2皆為pcDNA3-PAc轉(zhuǎn)染COS-7細胞的培養(yǎng)液，3為標(biāo)準(zhǔn)抗原Pac，4為pcDNA3空載體轉(zhuǎn)染COS-7細胞培養(yǎng)液。
以下結(jié)合附圖通過具體實施方式
的描述對本發(fā)明作進一步說明，但這并非對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以作出各種變型或改進，只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
具體實施例方式實施例一 表面蛋白P1編碼基因pac的獲取并合成PCR擴增所用引物上游引物(SEQ ID No.1)5’-GGCGGTACCATGAAGGTCAAAAAAACTTA-3’下游引物(SEQ ID No.2)5’-CGCCTCGAGTTAATCTTTCTTAGCCTTTA-3’在上、下游引物的5’端分別加入KpnI和XhoI限制性內(nèi)切酶酶切位點。在酶切位點的5’端各加4個保護性堿基。上游引物在編碼基因的上游加入啟始密碼子ATG，下游引物在編碼基因的下游加入終止密碼子TTA。
用上述引物從變鏈菌組DNA中擴增目的基因pac并純化。
將擴增得到的目的基因pac用1％瓊脂糖電泳檢測，檢測結(jié)果為單一條帶，擴增特異性高，分子量為與4.7Kb(見圖1)，序列與預(yù)計相同(變形鏈球菌表面蛋白基因的核苷酸序列見SEQ ID No.3，其編碼的氨基酸序列見SEQ ID No.4)。
實施例二 重組質(zhì)粒pcDNA3-pac的構(gòu)建1、重組質(zhì)粒pcDNA3-pac的構(gòu)建(構(gòu)建流程見圖2)將真核表達載體pcDNA3和目的基因pac分別在KpnI和XhoI酶的通用緩沖液中，于37℃用KpnI和XhoI雙酶切2hr，雙酶切產(chǎn)物經(jīng)1％低熔點瓊脂糖凝膠(TakaRa，大連)電泳后，用小量膠回收試劑盒純化雙酶切產(chǎn)物。用DNA連接試劑盒(TakaRa，大連)，將目的基因pac與真核表達載體pcDNA3在T4 DNA連接酶的作用下，16℃連接3hr。連接產(chǎn)物立即轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞大腸肝菌JM109，篩選出轉(zhuǎn)化子。
2、重組質(zhì)粒的酶切鑒定重組質(zhì)粒pcDNA3-pac經(jīng)XhoI、KpnI、BamHI酶切為10.1kb的單一片段，KpnI+XhoI酶切為4.7kb和5.4kb兩段，其中4.7kb片段為插入基因pac；HindIII酶切為3943bp，6129bp兩段，HindIII+XhoI雙酶切為765bp，3943bp，5346bp三段，PstI酶切為1233bp，1420bp，1559bp，5860bp四段。結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pcDNA3-pac構(gòu)建成功(酶切結(jié)果見圖3)。
經(jīng)DNA測序結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pcDNA3-pac中插入基因長度與預(yù)計的基因序列完全相同，且插入的方向正確，也沒有改變pac基因的閱讀框架，保證了編碼氨基酸序列的正確性。
實施例三 本發(fā)明變形鏈球菌表面蛋白基因疫苗的制備1、將實施例二所得的轉(zhuǎn)化子接種于LB液體培養(yǎng)基中，置空氣搖床箱內(nèi)，37℃振搖培養(yǎng)(250rpm)過夜，用質(zhì)粒抽取試劑盒提取重組質(zhì)粒。
2、用常規(guī)方法提純重組質(zhì)粒pcDNA3-pac，并將其制備為基因疫苗。
實施例四 本發(fā)明基因疫苗注射劑的制備該注射劑可以通過以下方法制備得到無菌條件下取注射用水，再加入原料重組質(zhì)粒pcDNA3-pac，在無菌條件下混合均勻，稀釋到0.1mg/ml，并加緩沖液調(diào)節(jié)pH值至7.0后無菌過濾分裝成注射劑，低溫保存。
試驗例一 本發(fā)明變形鏈球菌表面蛋白基因疫苗在真核細胞中的表達用脂質(zhì)體介導(dǎo)本發(fā)明變形鏈球菌表面蛋白基因疫苗轉(zhuǎn)染COS-7細胞，培養(yǎng)一段時間后進行各項檢測，以確定本發(fā)明基因疫苗轉(zhuǎn)染真核細胞后具有轉(zhuǎn)錄和翻譯活性。
1、用RT-PCR法檢測插入基因pac的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在本發(fā)明基因疫苗穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的COS-7細胞中提取總RNA，經(jīng)RT-PCR擴增后進行電泳檢測，在凝膠上可見分子量與pac一致的條帶，表明有插入基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
2、用免疫組化LSAB法檢測外源基因pac在細胞內(nèi)的表達產(chǎn)物實驗結(jié)果顯示，本發(fā)明基因疫苗穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的COS-7細胞的胞漿呈棕色，pcDNA3空載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的COS-7細胞的胞漿內(nèi)未見明顯棕色著色，表明本發(fā)明基因疫苗穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的COS-7細胞的胞內(nèi)有目的蛋白的表達。
3、用流式細胞儀檢測外源基因在細胞膜上的表達產(chǎn)物，結(jié)果本發(fā)明基因疫苗穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的COS-7細胞的細胞膜上有變形鏈球菌表面蛋白存在。
4、經(jīng)點免疫印跡分析，pcDNA3-PAc轉(zhuǎn)染COS-7細胞后，其細胞培養(yǎng)液和陽性對照均著藍色，陰性對照不著色(結(jié)果見圖4)。
本發(fā)明基因疫苗轉(zhuǎn)染真核細胞后具有轉(zhuǎn)錄和翻譯活性，表達的蛋白質(zhì)在胞內(nèi)、胞膜上及胞外均有分布，分子量與預(yù)計相同，并可與相應(yīng)的抗體特異結(jié)合。
試驗例二 本發(fā)明基因疫苗注射劑免疫效果的動物實驗實驗分組及免疫將體重合適的適齡健康大鼠24只隨機均分為pcDNA3-pac注射劑組、變形鏈球菌JBP滅活全菌組、pcDNA3空載體組、PBS組，每組大鼠分別行雙側(cè)頜下腺周注射，每只每次100ul(1ug/ul)，共免疫3次。
隨后，給各組分別接種變形鏈球菌，用致齲食物誘齲至實驗結(jié)束(共90天)。
防齲作用檢測指標(biāo)血清IgG和唾液S-IgA；唾液變形鏈球菌計數(shù)；牙面菌斑指數(shù)；齲齒計分(根據(jù)Keyes評分標(biāo)準(zhǔn)計分)。
實驗結(jié)果本發(fā)明變形鏈球菌表面蛋白基因疫苗經(jīng)腺周注射免疫大鼠均產(chǎn)生了顯著的的防齲效果(與pcDNA3空載體組和PBS組相比P＜0.01)，并且應(yīng)用效果與現(xiàn)有的滅菌全菌疫苗基本相當(dāng)。
試驗例三 本發(fā)明變形鏈球菌表面蛋白基因疫苗的安全性實驗1、本發(fā)明變形鏈球菌表面蛋白基因疫苗對受試大鼠的體重的影響在試驗例二的受試前后結(jié)束后，測量各組大鼠的體重。
滅活全菌組大鼠受試組的體重明顯較其他組輕(P＜0.01)，而本發(fā)明基因疫苗組與pcDNA3空載體組和PBS組相比無明顯差異，表明本發(fā)明基因疫苗基本無毒性，安全性明顯優(yōu)于現(xiàn)有的滅菌全菌疫苗。
2、本發(fā)明變形鏈球菌表面蛋白基因疫苗生物安全性驗證實驗通過PCR實驗對本發(fā)明基因疫苗整合進受試大鼠的基因組的可能性進行了檢測。PCR實驗結(jié)果表明，在10000個組織細胞核中就能檢測出一個pcDNA3-Pac拷貝的檢測水平下進行多次實驗，免疫各組中均沒有發(fā)現(xiàn)本發(fā)明基因疫苗整合進宿主細胞基因組，即其整合幾率低于萬分之一。表明本發(fā)明基因疫苗具有很好的生物安全性。
由以上實例可見，本發(fā)明變形鏈球菌表面蛋白基因疫苗制備簡便、成本低廉、免疫效果好、使用安全，具有很好的市場前景。
以上的較優(yōu)的具體實施方式
是對本發(fā)明作進一步的舉例說明，但并非對本發(fā)明范圍的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以作出各種變型或改進，只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的精神及所附上的權(quán)利要求書定義的范圍之內(nèi)。
變形鏈球菌表面蛋白基因疫苗及其制備方法.ST25SEQUENCE LISTING<110>四川大學(xué)<120>變形鏈球菌表面蛋白基因疫苗及其制備方法<130>A060037<160>4<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>29<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>PCR引物1<400>1ggcggtacca tgaaggtcaa aaaaactta 29<210>2<211>29<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>PCR引物2<400>2cgcctcgagt taatctttct tagccttta 29<210>3<211>4865<212>DNA<213>Streptococcus mutans<400>3atttcagcaa aaattgacaa atcaaatcaa ttatattaca attttttaac gtatattaca 60aaaatatatt tggaagattt attcagattt ggaggattta tgaaagtcaa aaaaacttac120ggttttcgta aaagtaaaat tagtaaaaca ctgtgtggtg ctgttctagg aacagtagca180gcagtctctg tagcaggaca aaaggttttt gccgatgaaa cgaccactac tagtgatgta240gatactaaag tagttggaac acaaactgga aatccagcga ccaatttgcc agaggctcaa300ggaagtgcga gtaagcaagc tgaacaaagt caaaccaagc tggagagaca aatggttcat360accattgaag tacctaaaac tgatcttgat caagcagcaa aagatgctaa gtctgctggt420gtcaatgttg tccaagatgc cgatgttaat aaaggaactg ttaaaacagc tgaagaagca480gtccaaaaag aaactgaaat taaagaagat tacacaaaac aagctgagga tattaagaag540acaacagatc aatataaatc ggatgtagct gctcatgagg cagaagttgc taaaatcaaa600gctaaaaatc aggcaactaa agaacagtat ggaaaagata tggtagctca taaagccgag660gttgaacgca ttaatgctgc aaatgctgcc agtaaaacag cttatgaagc taaattggct720caatatcaag cagatttagc agccgttcaa aaaaccaatg ctgccaatca agcatcctat780caaaaagccc ttgctgctta tcaggctgaa ctgaaacgtg ttcaggaagc taatgcagcc840gccaaagccg cttatgatac tgctgtagca gcaaataatg ccaaaaatac agaaattgcc900gctgccaatg aagaaattag aaaacgcaat gcaacggcca aagctgaata tgagactaag960ttagctcaat atcaagctga actaaagcgt gttcaggaag ctaatgccgc aaacgaagca 1020
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變形鏈球菌表面蛋白基因疫苗及其制備方法.ST25ccatctggtt atcaatttaa tcctgaagct acaaaagctg ccagccctgg ctttgatgtc3300gcttatgata atgcaactaa tacagtcacc ttcaaggcaa ctgcagcaac tttggctacg3360tttaatgctg atttgactaa gtcagtggca acgatttatc caacagtggt cggacaagtt3420cttaatgatg gcgcaactta taagaataat ttctcgctca cagtcaatga tgcttatggc3480attaaatcca atgttgttcg ggtgacaact cctggtaaac caaatgatcc agataaccca3540aataataatt acattaagcc aactaaggtt aataaaaatg aaaatggcgt tgttattgat3600ggtaaaacag ttcttgccgg ttcaacgaat tattatgagc taacttggga tttggatcaa3660tataaaaacg accgctcttc agcagatacc attcaacaag gattttacta tgtagatgat3720tatccagaag aagcgcttga attgcgtcag gatttagtga agattacaga tgctaatggc3780aatgaagtta ctggtgttag tgtggataat tatactagtc ttgaagcagc ccctcaagaa3840attagagatg ttctttctaa ggcaggaatt agacctaaag gtgctttcca aattttccgt3900gccgataatc caagagaatt ttatgatact tatgtcaaaa ctggaattga tttgaagatt3960gtatcaccaa tggttgttaa aaaacaaatg ggacaaacag gcgggagtta tgaagatcaa4020gcttaccaaa ttgactttgg taatggttat gcatcaaata tcgttatcaa taatgttcct4080aagattaacc ctaagaaaga tgtgacctta acacttgatc cggctgatac aaataatgtt4140gatggtcaga ctattccact taatacagtc tttaattacc gtttgattgg tggcattatc4200cctgcaaatc actcagaaga actctttgaa tacaatttct atgatgatta tgatcaaaca4260ggagatcact atactggtca gtataaagtt tttgccaagg ttgatatcac tcttaaaaac4320ggtgttatta tcaagtcagg tactgagtta actcagtata cgacagcgga agttgatacc4380actaaaggtg ctatcacaat taagttcaag gaagcctttc tgcgttctgt ttcaattgat4440tcagccttcc aagctgaaag ttatatccaa atgaaacgta ttgcggttgg tacttttgaa4500aatacctata ttaatactgt caatggggta acttacagtt caaatacagt ggaaacaact4560actcctgagg atcctgcaga ccctactgat ccgcaagatc catcatcacc gcggacttca4620actgtaatta tctacaaacc tcaatcaact gcttatcaac caagctctgt ccaaaaaacg4680ttaccaaata cgggagtaac aaacaatgct tatatgcctt tacttggtat tattggctta4740gttactagtt ttagtttgct tggcttaaag gctaagaaag attgacagca tagatattac4800attagaatta aaaagtgaga tgaagcgata aatcacagat tgagctttta tctcattttt4860tgatt4865<210>4<211>1561<212>PRT<213>Streptococcus mutans<400>4Met Lys Val Lys Lys Thr Tyr Gly Phe Arg Lys Ser Lys Ile Ser Lys1 5 10 15Thr Leu Cys Gly Ala Val Leu Gly Thr Val Ala Ala Val Ser Val Ala20 25 30Gly Gln Lys Val Phe Ala Asp Glu Thr Thr Thr Thr Ser Asp Val Asp35 40 45
變形鏈球菌表面蛋白基因疫苗及其制備方法.ST25Thr Lys Val Val Gly Thr Gln Thr Gly Asn Pro Ala Thr Asn Leu Pro50 55 60Glu Ala Gln Gly Ser Ala Ser Lys Gln Ala Glu Gln Ser Gln Thr Lys65 70 75 80Leu Glu Arg Gln Met Val His Thr Ile Glu Val Pro Lys Thr Asp Leu85 90 95Asp Gln Ala Ala Lys Asp Ala Lys Ser Ala Gly Val Asn Val Val Gln100 105 110Asp Ala Asp Val Asn Lys Gly Thr Val Lys Thr Ala Glu Glu Ala Val115 120 125Gln Lys Glu Thr Glu Ile Lys Glu Asp Tyr Thr Lys Gln Ala Glu Asp130 135 140Ile Lys Lys Thr Thr Asp Gln Tyr Lys Ser Asp Val Ala Ala His Glu145 150 155 160Ala Glu Val Ala Lys Ile Lys Ala Lys Asn Gln Ala Thr Lys Glu Gln165 170 175Tyr Gly Lys Asp Met Val Ala His Lys Ala Glu Val Glu Arg Ile Asn180 185 190Ala Ala Asn Ala Ala Ser Lys Thr Ala Tyr Glu Ala Lys Leu Ala Gln195 200 205Tyr Gln Ala Asp Leu Ala Ala Val Gln Lys Thr Asn Ala Ala Asn Gln210 215 220Ala Ser Tyr Gln Lys Ala Leu Ala Ala Tyr Gln Ala Glu Leu Lys Arg225 230 235 240Val Gln Glu Ala Asn Ala Ala Ala Lys Ala Ala Tyr Asp Thr Ala Val245 250 255Ala Ala Asn Asn Ala Lys Asn Thr Glu Ile Ala Ala Ala Asn Glu Glu260 265 270Ile Arg Lys Arg Asn Ala Thr Ala Lys Ala Glu Tyr Glu Thr Lys Leu275 280 285Ala Gln Tyr Gln Ala Glu Leu Lys Arg Val Gln Glu Ala Asn Ala Ala290 295 300Asn Glu Ala Asp Tyr Gln Ala Lys Leu Thr Ala Tyr Gln Thr Glu Leu305 310 315 320Ala Arg Val Gln Lys Ala Asn Ala Asp Ala Lys Ala Ala Tyr Glu Ala325 330 335Ala Val Ala Ala Asn Asn Ala Lys Asn Ala Ala Leu Thr Ala Glu Asn340 345 350
變形鏈球菌表面蛋白基因疫苗及其制備方法.ST25Thr Ala Ile Lys Gln Arg Asn Glu Asn Ala Lys Ala Thr Tyr Glu Ala355 360 365Ala Leu Lys Gln Tyr Glu Ala Asp Leu Ala Ala Val Lys Lys Ala Asn370 375 380Ala Ala Asn Glu Ala Asp Tyr Gln Ala Lys Leu Thr Ala Tyr Gln Thr385 390 395 400Glu Leu Ala Arg Val Gln Lys Ala Asn Ala Asp Ala Lys Ala Ala Tyr405 410 415Glu Ala Ala Val Ala Ala Asn Asn Ala Ala Asn Ala Ala Leu Thr Ala420 425 430Glu Asn Thr Ala Ile Lys Lys Arg Asn Ala Asp Ala Lys Ala Asp Tyr435 440 445Glu Ala Lys Leu Ala Lys Tyr Gln Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Gln Lys450 455 460Asp Leu Ala Asp Tyr Pro Val Lys Leu Lys Ala Tyr Glu Asp Glu Gln465 470 475 480Ala Ser Ile Lys Ala Ala Leu Ala Glu Leu Glu Lys His Lys Asn Glu485 490 495Asp Gly Asn Leu Thr Glu Pro Ser Ala Gln Asn Leu Val Tyr Asp Leu500 505 510Glu Pro Asn Ala Asn Leu Ser Leu Thr Thr Asp Gly Lys Phe Leu Lys515 520 525Ala Ser Ala Val Asp Asp Ala Phe Ser Lys Ser Thr Ser Lys Ala Lys530 535 540Tyr Asp Gln Lys Ile Leu Gln Leu Asp Asp Leu Asp Ile Thr Asn Leu545 550 555 560Glu Gln Ser Asn Asp Val Ala Ser Ser Met Glu Leu Tyr Gly Asn Phe565 570 575Gly Asp Lys Ala Gly Trp Ser Thr Thr Val Ser Asn Asn Ser Gln Val580 585 590Lys Trp Gly Ser Val Leu Leu Glu Arg Gly Gln Ser Ala Thr Ala Thr595 600 605Tyr Thr Asn Leu Gln Asn Ser Tyr Tyr Asn Gly Lys Lys Ile Ser Lys610 615 620Ile Val Tyr Lys Tyr Thr Val Asp Pro Lys Ser Lys Phe Gln Gly Gln625 630 635 640Lys Val Trp Leu Gly Ile Phe Thr Asp Pro Thr Leu Gly Val Phe Ala
變形鏈球菌表面蛋白基因疫苗及其制備方法.ST25645 650 655Ser Ala Tyr Thr Gly Gln Val Glu Lys Asn Thr Ser Ile Phe Ile Lys660 665 670Asn Glu Phe Thr Phe Tyr Asp Glu Asp Gly Lys Pro Ile Asn Phe Asp675 680 685Asn Ala Leu Leu Ser Val Ala Ser Leu Asn Arg Glu Asn Asn Ser Ile690 695 700Glu Met Ala Lys Asp Tyr Thr Gly Lys Phe Val Lys Ile Ser Gly Ser705 710 715 720Ser Ile Gly Glu Lys Asn Gly Met Ile Tyr Ala Thr Asp Thr Leu Asn725 730 735Phe Arg Gln Gly Gln Gly Gly Ala Arg Trp Thr Met Tyr Thr Arg Ala740 745 750Ser Glu Pro Gly Ser Gly Trp Asp Ser Ser Asp Ala Pro Asn Ser Trp755 760 765Tyr Gly Ala Gly Ala Ile Arg Met Ser Gly Pro Asn Asn Ser Val Thr770 775 780Leu Gly Ala Ile Ser Ser Thr Leu Val Val Pro Ala Asp Pro Thr Met785 790 795 800Ala Ile Glu Thr Gly Lys Lys Pro Asn Ile Trp Tyr Ser Leu Asn Gly805 810 815Lys Ile Arg Ala Val Asn Leu Pro Lys Val Thr Lys Glu Lys Pro Thr820 825 830Pro Pro Val Lys Pro Thr Ala Pro Thr Lys Pro Thr Tyr Glu Thr Glu835 840 845Lys Pro Leu Lys Pro Ala Pro Val Ala Pro Asn Tyr Glu Lys Glu Pro850 855 860Thr Pro Pro Thr Arg Thr Pro Asp Gln Ala Glu Pro Lys Lys Pro Thr865 870 875 880Pro Pro Thr Tyr Glu Thr Glu Lys Pro Leu Glu Pro Ala Pro Val Glu885 890 895Pro Ser Tyr Glu Ala Glu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Thr Pro Asp Gln900 905 910Ala Glu Pro Asn Lys Pro Thr Pro Pro Thr Tyr Glu Thr Glu Lys Pro915 920 925Leu Glu Pro Ala Pro Val Glu Pro Ser Tyr Glu Ala Glu Pro Thr Pro930 935 940
變形鏈球菌表面蛋白基因疫苗及其制備方法.ST25Pro Thr Pro Thr Pro Asp Gln Pro Glu Pro Asn Lys Pro Val Glu Pro945 950 955 960Thr Tyr Glu Val Ile Pro Thr Pro Pro Thr Asp Pro Val Tyr Gln Asp965 970 975Leu Pro Thr Pro Pro Ser Ile Pro Thr Val His Phe His Tyr Phe Lys980 985 990Leu Ala Val Gln Pro Gln Val Asn Lys Glu Ile Arg Asn Asn Asn Asp995 10001005Val Asn Ile Asp Arg Thr Leu Val Ala Lys Gln Ser Val Val Lys101010151020Phe Gln Leu Lys Thr Ala Asp Leu Pro Ala Gly Arg Asp Glu Thr102510301035Thr Ser Phe Val Leu Val Asp Pro Leu Pro Ser Gly Tyr Gln Phe104010451050Asn Pro Glu Ala Thr Lys Ala Ala Ser Pro Gly Phe Asp Val Ala105510601065Tyr Asp Asn Ala Thr Asn Thr Val Thr Phe Lys Ala Thr Ala Ala107010751080Thr Leu Ala Thr Phe Asn Ala Asp Leu Thr Lys Ser Val Ala Thr108510901095Ile Tyr Pro Thr Val Val Gly Gln Val Leu Asn Asp Gly Ala Thr110011051110Tyr Lys Asn Asn Phe Ser Leu Thr Val Asn Asp Ala Tyr Gly Ile111511201125Lys Ser Asn Val Val Arg Val Thr Thr Pro Gly Lys Pro Asn Asp113011351140Pro Asp Asn Pro Asn Asn Asn Tyr Ile Lys Pro Thr Lys Val Asn114511501155Lys Asn Glu Asn Gly Val Val Ile Asp Gly Lys Thr Val Leu Ala116011651170Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Glu Leu Thr Trp Asp Leu Asp Gln Tyr117511801185Lys Asn Asp Arg Ser Ser Ala Asp Thr Ile Gln Gln Gly Phe Tyr119011951200Tyr Val Asp Asp Tyr Pro Glu Glu Ala Leu Glu Leu Arg Gln Asp120512101215Leu Val Lys Ile Thr Asp Ala Asn Gly Asn Glu Val Thr Gly Val122012251230
變形鏈球菌表面蛋白基因疫苗及其制備方法.ST25Ser Val Asp Asn Tyr Thr Ser Leu Glu Ala Ala Pro Gln Glu Ile123512401245Arg Asp Val Leu Ser Lys Ala Gly Ile Arg Pro Lys Gly Ala Phe125012551260Gln Ile Phe Arg Ala Asp Asn Pro Arg Glu Phe Tyr Asp Thr Tyr126512701275Val Lys Thr Gly Ile Asp Leu Lys Ile Val Ser Pro Met Val Val128012851290Lys Lys Gln Met Gly Gln Thr Gly Gly Ser Tyr Glu Asp Gln Ala129513001305Tyr Gln Ile Asp Phe Gly Asn Gly Tyr Ala Ser Asn Ile Val Ile131013151320Asn Asn Val Pro Lys Ile Asn Pro Lys Lys Asp Val Thr Leu Thr132513301335Leu Asp Pro Ala Asp Thr Asn Asn Val Asp Gly Gln Thr Ile Pro134013451350Leu Asn Thr Val Phe Asn Tyr Arg Leu Ile Gly Gly Ile Ile Pro135513601365Ala Asn His Ser Glu Glu Leu Phe Glu Tyr Asn Phe Tyr Asp Asp137013751380Tyr Asp Gln Thr Gly Asp His Tyr Thr Gly Gln Tyr Lys Val Phe138513901395Ala Lys Val Asp Ile Thr Leu Lys Asn Gly Val Ile Ile Lys Ser140014051410Gly Thr Glu Leu Thr Gln Tyr Thr Thr Ala Glu Val Asp Thr Thr141514201425Lys Gly Ala Ile Thr Ile Lys Phe Lys Glu Ala Phe Leu Arg Ser143014351440Val Ser Ile Asp Ser Ala Phe Gln Ala Glu Ser Tyr Ile Gln Met144514501455Lys Arg Ile Ala Val Gly Thr Phe Glu Asn Thr Tyr Ile Asn Thr146014651470Val Asn Gly Val Thr Tyr Ser Ser Asn Thr Val Lys Thr Thr Thr147514801485Pro Glu Asp Pro Ala Asp Pro Thr Asp Pro Gln Asp Pro Ser Ser149014951500Pro Arg Thr Ser Thr Val Ile Ile Tyr Lys Pro Gln Ser Thr Ala150515101515
變形鏈球菌表面蛋白基因疫苗及其制備方法.ST25Tyr Gln Pro Ser Ser Val Gln Lys Thr Leu Pro Asn Thr Gly Val152015251530Thr Asn Asn Ala Tyr Met Pro Leu Leu Gly Ile Ile Gly Leu Val153515401545Thr Ser Phe Ser Leu Leu Gly Leu Lys Ala Lys Lys Asp155015551560
權(quán)利要求
1.一種治療和預(yù)防變形鏈球菌相關(guān)疾病的疫苗，其特征在于含有序列SEQ No.3所示的的變形鏈球菌表面蛋白編碼基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于所述的變形鏈球菌表面蛋白編碼基因裝載于表達載體上。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的疫苗，其特征在于所述的表達載體為真核表達載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的疫苗，其特征在于所述的真核表達載體為質(zhì)粒。
5.根據(jù)權(quán)利要求1～4任一項所述的疫苗，其特征在于所述的變形鏈球菌相關(guān)疾病為齲病。
6.一種制備權(quán)利要求2所述的疫苗的方法，其特征在于包括以下步驟a、合成SEQ ID No.1所示的特異性上游引物和SEQ ID No.2所示的特異性下游引物，用這對引物從變鏈菌基因組DNA中擴增制備變形鏈球菌表面蛋白編碼基因；b、將所得變形鏈球菌表面蛋白編碼基因轉(zhuǎn)載在表達載體上。
7.一種藥物組合物，其特征在于含有權(quán)利要求1～5任一項所述的疫苗以及藥學(xué)上可以接受的載體和賦形劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其特征在于還含有免疫佐劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的藥物組合物，其特征在于所述的免疫佐劑是氫氧化鋁、脂質(zhì)體或霍亂毒素B亞單位。
10.根據(jù)權(quán)利要求7～9任一項所述的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物是口服制劑、口含制劑或注射劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種變形鏈球菌表面蛋白基因疫苗及其制備方法。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，該藥物組合物含有本發(fā)明疫苗以及藥學(xué)上可以接受的載體和賦形劑。功效實驗也證明了本發(fā)明基因疫苗能夠持續(xù)高水平的誘導(dǎo)針對變形鏈球菌表面蛋白的免疫反應(yīng)，對齲病等變形鏈球菌相關(guān)疾病具有明顯的療效，并且經(jīng)檢測不會整合進宿主細胞的基因組，也不會對受試者造成體重降低等其他不良影響，具有很好的安全性，符合用藥要求，具有很好的市場前景。
文檔編號A61K39/395GK101036790SQ20061002050
公開日2007年9月19日 申請日期2006年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月17日
發(fā)明者劉天佳, 楊錦波, 劉建國, 郭麗宏, 楊德琴, 曹福嫻, 賈文祥, 李繼遙, 周學(xué)東, 譚紅 申請人:四川大學(xué)