專利名稱：變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地涉及到一種變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
齲病(Caries)是危害人類健康的主要口腔疾病，被WHO列為三大嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一。目前在我國齲病發(fā)生率有上升的趨勢，兒童和老年人發(fā)病率甚至高達(dá)80％以上，因此找出控制齲病的有效措施是當(dāng)前的緊迫任務(wù)。
由于齲病是一種細(xì)菌性疾病，變形鏈球菌(Streptococcus mutans，S.mutans)是齲病的主要致齲菌，它在牙面的粘附和集聚是齲病發(fā)生的先決條件。葡糖基轉(zhuǎn)移酶(glucosyltransferase，GTFs)是變鏈菌的主要粘附毒力因子之一，介導(dǎo)變形鏈球菌細(xì)胞對牙面的蔗糖依賴性黏附，在齲病的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用(ChiaJS，Lin RH，Chen JY et al.Inhibition of glucosyltransferase activities of Streptococcus mutans by amonoclonal antibody to a subsequence peptide.Infect Immun，1993；61(11)4689-95)。變鏈菌的GTFs有三種形式，即GtfB、GtfC和GtfD，其中以合成水不溶性葡聚糖的GtfB在變鏈菌的蔗糖依賴性粘附中尤為重要。GtfB分子量為165.8KDa，其基因全長為4428bp，編碼合成約1400個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，蛋白分子中有特定的功能區(qū)定位和抗原表位的分布(Eto A，Saido TC，F(xiàn)ukushima K et al.Inhibitory effect of aself-derived peptide on glucosyltransferase of Streptococcus mutans.Possible novel anticariesmeasures.J biol chem，1999；274(22)15797-802)。
免疫防治是控制齲病的有效手段之一。國外在20世紀(jì)70年代就嘗試用主要致齲菌變鏈菌的減毒全菌疫苗進(jìn)行免疫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)變形鏈球菌全菌多價疫苗可降低齲病發(fā)生率，但變形鏈球菌某些抗原成分可誘發(fā)抗體與人類心臟組織發(fā)生交叉反應(yīng)。近年來，先后采用了亞單位疫苗、多肽疫苗等手段進(jìn)行免疫防齲，但仍存在疫苗制備困難、成本高、免疫原性弱、免疫效力短等缺點。
目前，急需開發(fā)出能克服現(xiàn)有疫苗缺點的新型變形鏈球菌疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的是提供一種治療和預(yù)防變形鏈球菌相關(guān)疾病的疫苗。該疫苗含有序列SEQ ID No.3所示的的變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶B編碼基因。
進(jìn)一步的，上述變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶B編碼基因片段裝載于表達(dá)載體上。
優(yōu)選的，所述的表達(dá)載體是真核表達(dá)載體。
進(jìn)一步優(yōu)選的，所述的真核表達(dá)載體是質(zhì)粒。
其中，上述的變形鏈球菌相關(guān)疾病為齲病。
本發(fā)明的第二個目的在于提供一種制備上述疫苗的方法。該方法包括以下步驟a、合成序列SEQ ID No.1所示的特異性上游引物5’-ATA TGG TAC CATGAC CGA AGC GAC ATC TAA GCA AGA-3’和序列SEQ ID No.2所示的特異性下游引物下游引物5’-ACT ACT CGA GTT AGA ACC ATT GAC CCT GAG CATTGC-3’，用這對引物從變鏈菌基因組DNA中擴(kuò)增制備序列SEQ ID No.3所示的變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶B編碼基因；b、將所得變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶B編碼基因裝載在表達(dá)載體上。
本發(fā)明的第三個目的在于提供一種藥物組合物。該藥物組合物含有上述的疫苗以及藥學(xué)上可以接受的載體和賦形劑。
進(jìn)一步的，上述藥物組合物還含有免疫佐劑。
優(yōu)選的，上述的免疫佐劑是氫氧化鋁、脂質(zhì)體或霍亂毒素B亞單位。
其中，上述藥物組合物的劑型是口服制劑、口含制劑或注射劑。
用于制備本發(fā)明基因疫苗的載體是本領(lǐng)域已知的，如重組噬菌體、質(zhì)粒、腺病毒載體和其他的經(jīng)加工后可以裝載變形鏈球菌表面蛋白編碼基因的表達(dá)載體，尤其是真核表達(dá)載體。同時，需要說明的是以上生產(chǎn)和操作本發(fā)明公開的重組載體和藥物組合物的具體技術(shù)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并可按照已描述的技術(shù)完成。
本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明基因疫苗具有制備方法簡便、成本低廉、抗原在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)與病原體自然感染過程相似、能夠持續(xù)誘導(dǎo)有效的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答、安全性高等優(yōu)點，可以彌補(bǔ)現(xiàn)有藥物昂貴、體內(nèi)穩(wěn)定性差等缺陷，能增大給藥時間的間隔、大大減少給藥量、減輕使用者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)并提高患者的生活質(zhì)量。功效實驗也證明了本發(fā)明基因疫苗對齲病等變形鏈球菌相關(guān)疾病具有明顯的療效，并且經(jīng)檢測不會整合進(jìn)宿主細(xì)胞的基因組，也不會對受試者造成體重降低等其他不良影響，具有很好的安全性，符合用藥要求，具有很好的市場前景。


圖1為PCR擴(kuò)增出的gtfB基因片段的1％瓊脂糖電泳圖，其中M為DNA分子量Markerλ-EcoT14I，1和2都為擴(kuò)增所得的gtfB基因(4.7Kb)。
圖2為重組質(zhì)粒pcDNA3-gtfB的構(gòu)建流程圖。
圖3為重組質(zhì)粒pcDNA3-gtfB酶切鑒定的1％瓊脂糖凝膠電泳圖，M為DNA分子量Markerλ-EcoT14I，1和2為KpnI酶切，3和4為XhoI酶切，5、6和7為KpnI+XhoI雙酶切。
以下結(jié)合附圖通過具體實施方式
的描述對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但這并非對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以作出各種變型或改進(jìn)，只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
具體實施例方式實施例一 變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶B編碼基因gtfB的獲取合成擴(kuò)增變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶B編碼基因gtfB所用的特異性PCR引物上游引物(SEQ ID No.1)5’-ATA TGG TAC CAT GAC CGA AGC GAC ATCTAA GCAA GA-3’；下游引物(SEQ ID No.2)5’-ACT ACT CGA GTT AGA ACC ATT GAC CCTGAG CAT TGC-3’。
在上、下游引物的5’端分別加入KpnI和XhoI限制性內(nèi)切酶酶切位點。在酶切位點的5’端各加4個保護(hù)性堿基。上游引物在編碼基因的上游加入啟始密碼子ATG，下游引物在編碼基因的下游加入終止密碼子TTA。
以變形鏈球菌GS-5全基因組DNA為模板，采用高信度的Pyrobest DNA合成酶(TakaRa，大連)，用以上設(shè)計的引物，用Gene Amp PCR System 9600型PCR儀(Perking Elmer，美國)進(jìn)行擴(kuò)增，獲得gtfB基因片段(904-4578bp)。擴(kuò)增條件采用二步法PCR，94℃變性30Sec，68℃退火和延伸8min，30次循環(huán)，4℃貯存PCR產(chǎn)物。采用小量膠回收試劑盒(Watson，上海)回收并純化gtfB目的基因。
將擴(kuò)增得到的目的基因gtfB用1％瓊脂糖電泳檢測，檢測結(jié)果為單一條帶，擴(kuò)增特異性高，分子量為與4.7Kb(見圖1)，序列與預(yù)計相同序列與預(yù)計相同(變形鏈球菌表面蛋白基因的核苷酸序列見SEQ ID No.3，其編碼的氨基酸序列見SEQ ID No.4)。
實施例二 重組質(zhì)粒pcDNA3-gtfB的構(gòu)建1、重組質(zhì)粒pcDNA3-gtfB的構(gòu)建(構(gòu)建流程見圖2)真核表達(dá)載體pcDNA3和目的基因gtfB分別在KpnI和XhoI酶的通用緩沖液中，37℃雙酶切2hr，雙酶切產(chǎn)物經(jīng)1％低熔點瓊脂糖凝膠(TakaRa，大連)電泳后，用小量膠回收試劑盒純化雙酶切產(chǎn)物。用DNA連接試劑盒(TakaRa，大連)，將目的基因gtfB與真核表達(dá)載體pcDNA3在T4 DNA連接酶的作用下，16℃連接3hr。連接產(chǎn)物立即轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞大腸肝菌JM109，用氨芐青霉素抗性LB平板篩選陽性克隆株，得到轉(zhuǎn)化子。
2、重組質(zhì)粒的酶切鑒定和測序?qū)λ弥亟M質(zhì)粒進(jìn)行酶切經(jīng)KpnI、XhonI單酶切為9.0kb的單一片段，經(jīng)KpnI、XhonI雙酶切為3.6kb的gtfB目的基因片段和5.4kb的pcDNA3空載質(zhì)粒片段。結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pcDNA3-gtfB構(gòu)建成功(見圖3)。
經(jīng)DNA測序結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pcDNA3-gtfB中插入基因長36756p，與Shiroza等1986年用雙脫氧鏈終止法測定的變形鏈球菌GS-5的gtfB基因序列完全相同，且插入的方向正確，也沒有改變gtfB基因的閱讀框架，保證了編碼氨基酸序列的正確性。
實施例三 本發(fā)明變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因疫苗的制備1、將實施例二所得的轉(zhuǎn)化子接種于LB液體培養(yǎng)基中，置空氣搖床箱內(nèi)，37℃振搖培養(yǎng)(250rpm)過夜，用質(zhì)粒抽取試劑盒提取重組質(zhì)粒。
2、用常規(guī)方法提純重組質(zhì)粒pcDNA3-gtfB，并將其制備為基因疫苗。
實施例四 本發(fā)明基因疫苗注射劑的制備該注射劑可以通過以下方法制備得到無菌條件下取注射用水，再加入原料重組質(zhì)粒pcDNA3-gtfB，在無菌條件下混合均勻，稀釋到0.1mg/ml，并在無菌條件下混合均勻，加緩沖液調(diào)節(jié)pH值至7.0后無菌過濾分裝成注射劑，低溫保存，即得。
試驗例一 本發(fā)明變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因疫苗在真核細(xì)胞中的表達(dá)用脂質(zhì)體介導(dǎo)本發(fā)明基因疫苗轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，培養(yǎng)一段時間后進(jìn)行各項檢測，以確定本發(fā)明基因疫苗轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞后具有轉(zhuǎn)錄和翻譯活性。
檢測項目及結(jié)果1、用RT-PCR法檢測插入基因gtfB的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在本發(fā)明基因疫苗穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞中提取總RNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后進(jìn)行電泳檢測，在凝膠上可見分子量與gtfB一致的條帶，表明有插入基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
2、用免疫組化LSAB法檢測外源基因gtfB在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)產(chǎn)物實驗結(jié)果顯示，本發(fā)明基因疫苗穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞的胞漿呈棕色，pcDNA3空載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞的胞漿內(nèi)未見明顯棕色著色，表明本發(fā)明基因疫苗穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞的胞內(nèi)有變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶B的表達(dá)。
3、用流式細(xì)胞儀檢測外源基因在細(xì)胞膜上的表達(dá)產(chǎn)物，結(jié)果本發(fā)明基因疫苗穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞的細(xì)胞膜上有變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶B存在。
4、用Western免疫印跡法檢測外源基因在細(xì)胞外上清中的表達(dá)產(chǎn)物，結(jié)果表明本發(fā)明基因疫苗穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞的細(xì)胞外上清中有變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶B表達(dá)。
本發(fā)明變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因疫苗轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞后具有轉(zhuǎn)錄和翻譯活性，表達(dá)的蛋白質(zhì)在胞內(nèi)、胞膜上及胞外具有分布，分子量與預(yù)計相同，并可與相應(yīng)的抗體特異結(jié)合。
試驗例二 本發(fā)明基因疫苗注射劑免疫效果的動物實驗實驗分組及免疫將體重合適的適齡健康大鼠24只隨機(jī)均分為pcDNA3-gtfB注射劑組、變形鏈球菌JBP滅活全菌組、pcDNA3空載體組、PBS組，每組大鼠分別行雙側(cè)頜下腺周注射，每只每次100ul(1ug/ul)，共免疫3次。
隨后，給各組分別接種變形鏈球菌，用致齲食物誘齲至實驗結(jié)束(共90天)。
防齲作用檢測指標(biāo)血清IgG和唾液S-IgA；唾液變形鏈球菌計數(shù)；牙面菌斑指數(shù)；齲齒計分根據(jù)Keyes評分標(biāo)準(zhǔn)計分。
實驗結(jié)果上述功效實驗的實驗結(jié)果表明，本發(fā)明變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因疫苗經(jīng)頜下腺腺周注射免疫大鼠均產(chǎn)生了顯著的的防齲效果，并且應(yīng)用效果與現(xiàn)有的滅菌全菌疫苗基本相當(dāng)。
試驗例三 本發(fā)明基因疫苗注射劑的安全性實驗1、本發(fā)明基因疫苗注射劑對受試大鼠的體重的影響試驗例二的受試結(jié)束后，測量各組大鼠的體重。
滅活全菌組大鼠的體重明顯較其他組輕(P＜0.01)，而本發(fā)明變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因疫苗組與pcDNA3空載體組和PBS組相比無明顯差異，表明本發(fā)明基因疫苗基本無毒性，安全性明顯優(yōu)于現(xiàn)有的滅菌全菌疫苗。
2、本發(fā)明基因疫苗是否整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組的驗證實驗通過PCR實驗對本發(fā)明變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因疫苗整合進(jìn)受試大鼠的基因組的可能性進(jìn)行了檢測。PCR實驗結(jié)果表明，在10000個組織細(xì)胞核中就能檢測出一個pcDNA3-Pac拷貝的檢測水平下進(jìn)行多次實驗，免疫各組中均沒有發(fā)現(xiàn)本發(fā)明基因疫苗整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組，即其整合幾率低于萬分之一。表明本發(fā)明變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因疫苗具有很好的生物安全性。
由以上實例可見，本發(fā)明變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因疫苗制備簡便、成本低廉、免疫效果好、使用安全，具有很好的市場前景。
以上的較優(yōu)的具體實施方式
是對本發(fā)明作進(jìn)一步的舉例說明，但并非對本發(fā)明范圍的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以作出各種變型或改進(jìn)，只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的精神及所附上的權(quán)利要求書定義的范圍之內(nèi)。
變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因疫苗及其制備方法.ST25SEQUENCE LISTING<110>四川大學(xué)<120>變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因疫苗及其制備方法<130>A060038<160>4<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>36<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>PCR引物1<400>1atatggtacc atgaccgaag cgacatctaa gcaaga 36<210>2<211>36<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>PCR引物2<400>2actactcgag ttagaaccat tgaccctgag cattgc 36<210>3<211>4428<212>DNA<213>Streptococcus mutans<400>3atggacaaga aagtgcgtta taaactgcgc aaagttaaaa aaagatgggt gacagtatct 60gttgcatctg ctgtgatgac tttaactaca ctttcgggtg gcttggttaa agcagattct120aatgaatcga aatcccaaat ttctaatgat tctaatacca gtgttgttac tgctaatgaa180gaatctaatg taataaccga agcgacatct aagcaagaag ctgctagtag tcaaactaat240catacagtaa cgacaagcag tagctctact tcggtagtta atcccaaaga ggttgtaagt300aatccttata ctgttgggga aacagcttct aatggtgaaa agcttcaaaa tcaaacaact360acagttgaca aaacttctga agctgctgct aataatatta gtaaacaaac aaccgaagct420gatacagatg ttattgatga tagcaatgca gccaatctac aaatattgga aaaacttccc480aatgtaaaag aaattgatgg taagtattat tattatgaca ataacggcaa agttcgtact540aattttacat taattgctga tggcaaaatt ttacattttg atgaaactgg cgcttatact600gatacatcaa ttgacactgt aaataaagat atcgtcacaa caagaagtaa tctatacaaa660aaatataatc aagtttatga tcgctctgca cagagctttg agcatgttga tcattatttg720acagctgaga gttggtatcg tcctaagtac atcttgaagg atggcaaaac atggacacag780tcaacagaaa aagatttccg tcccttattg atgacatggt ggcctgacca agaaacgcag840cgtcaatatg ttaactacat gaatgcacag cttggcatta acaagactta tgatgataca900agtaatcaat tgcaattaaa tattgcagct gcaactattc aagcaaaaat tgaggccaaa960attacaactt taaagaatac tgattggctg cgtcagacta tttccgcatt tgttaagaca 1020cagtcagctt ggaacagtga cagcgaaaaa ccgtttgatg atcatttaca aaatggagca 1080
變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因疫苗及其制備方法.ST25gtgctttacg ataatgaagg aaaattaacg ccttatgcta attccaacta ccgtatctta1140aatcgcaccc cgaccaatca aaccggaaag aaagatccaa ggtatacagc tgataacact1200atcggcggtt atgaattcct tttggccaac gatgtggata attctaatcc tgtcgtgcag1260gccgaacaat tgaactggct acattttctc atgaactttg gtaacattta tgccaatgat1320ccggatgcta actttgattc cattcgtgtt gatgcggtag ataatgtgga tgctgacttg1380ctccaaattg ctggggatta cctcaaagct gctaagggga tccataaaaa tgataaggct1440gctaatgatc atttgtctat tttagaggca tggagtgaca acgacactcc ttaccttcat1500gatgatggcg acaatatgat taatatggac aataagctgc gtttgtctct attattttca1560ttagctaaac ccttaaatca acgttcaggc atgaatcctc tgatcactaa cagtttggtg1620aatcgtactg atgataatgc tgaaactgcc gcagtccctt cttattcctt catccgtgcc1680catgacagtg aagtgcagga tttgattgct gatatcatca aggcagaaat caatcctaat1740gttgtcgggt attcattcac tatggaggaa atcaagaagg ctttcgagat ttacaacaaa1800gacttattag ctacagagaa gaaatacaca cactataata cggcactttc ttatgccctg1860cttttaacca acaaatccag tgtgccgcgt gtctattatg gggatatgtt tacagatgac1920gggcaataca tggctcataa gacgatcaat tacgaagcca tcgaaaccct gcttaaagct1980cgtattaagt atgtttcagg cggtcaagcc atgcgcaatc aacaggttgg caattctgaa2040atcattacgt ctgtccgcta tggtaaaggt gctttgaaag caacggatac aggggaccgc2100accacacgga cttcaggagt ggccgtgatt gaaggcaata acccttcttt acgtttgaag2160gcttctgatc gcgtggttgt caatatggga gcagcccata agaaccaagc ttaccgacct2220ttactcttga ccacagataa cggtatcaag gcttatcatt ccgatcaaga agcggctggt2280ttggtgcgct acaccaatga cagaggggaa ttgatcttca cagcggctga tattaaaggc2340tatgccaacc ctcaagtttc tggctattta ggtgtctggg ttccagtagg cgctgcgctg2400atcaagatgt tcgcgttgcg gctagcacgg ccccatcaac agatggcaag tgtgcatcaa2460aatgcggccc ttgattcacg cgtcatgttt gaaggtttct ctaatttcca agctttcgcc2520actaaaaaag aggaatatac caatgttgtg attgctaaga atgtggataa gtttgcggaa2580tggggggtca cagactttga aatggcaccg cagtatgtgt cttcaacgga tggttctttc2640ttggattctg tgatccaaaa cggctatgct tttacggacc gttatgattt gggaatttcc2700aaacctaata aatacgggac agccgatgat ttggtgaaag ccatcaaagc gttacacagc2760aagggcatta aggtaatggc tgactgggtg cctgatcaaa tgtatgcttt ccctgaaaaa2820gaagtggtaa ctgcaacccg tgttgataag tatgggactc ctgttgcagg aagtcagatc2880aaaaacaccc tttatgtagt tgatggtaag agttctggta aagatcaaca agccaagtat2940gggggagctt tcttagagga gctgcaagcg aagtatccgg agctttttgc gagaaaacaa3000atttccacag gggttccgat ggatccttct gttaagatta agcaatggtc tgccaagtac3060tttaatggga caaatatttt agggcgcgga gcaggctatg tcttaaaaga tcaggcaact3120aatacttact ttaatatttc agateataaa gaaataaact tccttcctaa aacattgtta3180aaccaagata gtcaagttgg tttctcttat gacggtaaag gttatgttta ttattcaacg3240agtggttacc aagccaaaaa tactttcatc agcgaaggtg ataaatggta ttattttgat3300aataacggtt atatggtcac tggtgctcaa tcaattaacg gtgttaatta ttatttctta3360tcaaatggcc tacagctcag agatgctatt cttaagaatg aagatggaac ttacgcttat3420
變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因疫苗及其制備方法.ST25tatggaaatg acggtcgccg ttatgaaaat ggttattatc aattcatgag tggtgtatgg3480cgtcacttca ataatggtga aatgagtgtt ggattaactg taattgatgg tcaggttcaa3540tactttgatg aaatgggcta tcaagccaaa ggaaaatttg taacaactgc cgatggtaaa3600ataagatatt ttgataagca atctgggaac atgtaccgta atcgttttat tgaaaacgaa3660gaaggtaaat ggctgtatct cggtgaagat ggtgcagcag tgacaggatc tcaaaccatt3720aacggtcaac acctgtactt tagagcaaac ggtgttcagg tcaagggtga atttgtcact3780gaccaccacg gccgtatcag ctattacgac ggcaattcag gggatcaaat ccgcaaccgc3840tttgtccgca atgctcaggg tcaatggttc tactttgata acaatggcta tgccgtaacc3900ggtgccagaa ccattaacgg tcaactccta tactttagag caaacggtgt tcaggtcaag3960ggtgaatttg tcactgaccg ctacggccgt atcagctatt acgacggcaa ttcaggggat4020caaatccgca accgctttgt ccgcaatgct cagggtcaat ggttctactt tgataacaat4080ggctatgccg taaccggtgc cagaaccatt aacggtcaac acctatactt tagagcaaac4140ggtgttcagg tcaagggtga atttgtcact gaccgccacg gccgtatcag ctattacgac4200ggcaattcag gggatcaaat ccgcaaccgc tttgtccgca atgctcaggg tcaatggttc4260tactttgata acaatggcta tgccgtaacc ggtgccagaa ccattaacgg tcaacaccta4320tactttagag caaacggtgt tcaggtcaag ggtgaatttg tcactgaccg ctacggccgt4380atcagttatt acgatgctaa ctctggagaa cgagttcgga ttaactaa 4428<210>4<211>1475<212>PRT<213>Streptococcus mutans<400>4Met Asp Lys Lys Val Arg Tyr Lys Leu Arg Lys Val Lys Lys Arg Trp1 5 10 15Val Thr Val Ser Val Ala Ser Ala Val Met Thr Leu Thr Thr Leu Ser20 25 30Gly Gly Leu Val Lys Ala Asp Ser Asn Glu Ser Lys Ser Gln Ile Ser35 40 45Asn Asp Ser Asn Thr Ser Val Val Thr Ala Asn Glu Glu Ser Asn Val50 55 60Ile Thr Glu Ala Thr Ser Lys Gln Glu Ala Ala Ser Ser Gln Thr Asn65 70 75 80His Thr Val Thr Thr Ser Ser Ser Ser Thr Ser Val Val Asn Pro Lys85 90 95Glu Val Val Ser Asn Pro Tyr Thr Val Gly Glu Thr Ala Ser Asn Gly100 105 110Glu Lys Leu Gln Asn Gln Thr Thr Thr Val Asp Lys Thr Ser Glu Ala115 120 125Ala Ala Asn Asn Ile Ser Lys Gln Thr Thr Glu Ala Asp Thr Asp Val130 135 140
變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因疫苗及其制備方法.ST25Ile Asp Asp Ser Asn Ala Ala Asn Leu Gln Ile Leu Glu Lys Leu Pro145 150 155 160Asn Val Lys Glu Ile Asp Gly Lys Tyr Tyr Tyr Tyr Asp Asn Asn Gly165 170 175Lys Val Arg Thr Asn Phe Thr Leu Ile Ala Asp Gly Lys Ile Leu His180 185 190Phe Asp Glu Thr Gly Ala Tyr Thr Asp Thr Ser Ile Asp Thr Val Asn195 200 205Lys Asp Ile Val Thr Thr Arg Ser Asn Leu Tyr Lys Lys Tyr Asn Gln210 215 220Val Tyr Asp Arg Ser Ala Gln Ser Phe Glu His Val Asp His Tyr Leu225 230 235 240Thr Ala Glu Ser Trp Tyr Arg Pro Lys Tyr Ile Leu Lys Asp Gly Lys245 250 255Thr Trp Thr Gln Ser Thr Glu Lys Asp Phe Arg Pro Leu Leu Met Thr260 265 270Trp Trp Pro Asp Gln Glu Thr Gln Arg Gln Tyr Val Asn Tyr Met Asn275 280 285Ala Gln Leu Gly Ile Asn Lys Thr Tyr Asp Asp Thr Ser Asn Gln Leu290 295 300Gln Leu Asn Ile Ala Ala Ala Thr Ile Gln Ala Lys Ile Glu Ala Lys305 310 315 320Ile Thr Thr Leu Lys Asn Thr Asp Trp Leu Arg Gln Thr Ile Ser Ala325 330 335Phe Val Lys Thr Gln Ser Ala Trp Asn Ser Asp Ser Glu Lys Pro Phe340 345 350Asp Asp His Leu Gln Asn Gly Ala Val Leu Tyr Asp Asn Glu Gly Lys355 360 365Leu Thr Pro Tyr Ala Asn Ser Asn Tyr Arg Ile Leu Asn Arg Thr Pro370 375 380Thr Asn Gln Thr Gly Lys Lys Asp Pro Arg Tyr Thr Ala Asp Asn Thr385 390 395 400Ile Gly Gly Tyr Glu Phe Leu Leu Ala Asn Asp Val Asp Asn Ser Asn405 410 415Pro Val Val Gln Ala Glu Gln Leu Asn Trp Leu His Phe Leu Met Asn420 425 430Phe Gly Asn Ile Tyr Ala Asn Asp Pro Asp Ala Asn Phe Asp Ser Ile435 440 445Arg Val Asp Ala Val Asp Asn Val Asp Ala Asp Leu Leu Gln Ile Ala450 455 460
變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因疫苗及其制備方法.ST25Gly Asp Tyr Leu Lys Ala Ala Lys Gly Ile His Lys Asn Asp Lys Ala465 470 475 480Ala Asn Asp His Leu Ser Ile Leu Glu Ala Trp Ser Asp Asn Asp Thr485 490 495Pro Tyr Leu His Asp Asp Gly Asp Asn Met Ile Asn Met Asp Asn Lys500 505 510Leu Arg Leu Ser Leu Leu Phe Ser Leu Ala Lys Pro Leu Asn Gln Arg515 520 525Ser Gly Met Asn Pro Leu Ile Thr Asn Ser Leu Val Asn Arg Thr Asp530 535 540Asp Asn Ala Glu Thr Ala Ala Val Pro Ser Tyr Ser Phe Ile Arg Ala545 550 555 560His Asp Ser Glu Val Gln Asp Leu Ile Ala Asp Ile Ile Lys Ala Glu565 570 575Ile Asn Pro Asn Val Val Gly Tyr Ser Phe Thr Met Glu Glu Ile Lys580 585 590Lys Ala Phe Glu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Ala Thr Glu Lys Lys595 600 605Tyr Thr His Tyr Asn Thr Ala Leu Ser Tyr Ala Leu Leu Leu Thr Asn610 615 620Lys Ser Ser Val Pro Arg Val Tyr Tyr Gly Asp Met Phe Thr Asp Asp625 630 635 640Gly Gln Tyr Met Ala His Lys Thr Ile Asn Tyr Glu Ala Ile Glu Thr645 650 655Leu Leu Lys Ala Arg Ile Lys Tyr Val Ser Gly Gly Gln Ala Met Arg660 665 670Asn Gln Gln Val Gly Asn Ser Glu Ile Ile Thr Ser Val Arg Tyr Gly675 680 685Lys Gly Ala Leu Lys Ala Thr Asp Thr Gly Asp Arg Thr Thr Arg Thr690 695 700Ser Gly Val Ala Val Ile Glu Gly Asn Asn Pro Ser Leu Arg Leu Lys705 710 715 720Ala Ser Asp Arg Val Val Val Asn Met Gly Ala Ala His Lys Asn Gln725 730 735Ala Tyr Arg Pro Leu Leu Leu Thr Thr Asp Asn Gly Ile Lys Ala Tyr740 745 750His Ser Asp Gln Glu Ala Ala Gly Leu Val Arg Tyr Thr Asn Asp Arg755 760 765
變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因疫苗及其制備方法.ST25Gly Glu Leu Ile Phe Thr Ala Ala Asp Ile Lys Gly Tyr Ala Asn Pro770 775 780Gln Val Ser Gly Tyr Leu Gly Val Trp Val Pro Val Gly Ala Ala Leu785 790 795 800Ile Lys Met Phe Ala Leu Arg Leu Ala Arg Pro His Gln Gln Met Ala805 810 815Ser Val His Gln Asn Ala Ala Leu Asp Ser Arg Val Met Phe Glu Gly820 825 830Phe Ser Asn Phe Gln Ala Phe Ala Thr Lys Lys Glu Glu Tyr Thr Asn835 840 845Val Val Ile Ala Lys Asn Val Asp Lys Phe Ala Glu Trp Gly Val Thr850 855 860Asp Phe Glu Met Ala Pro Gln Tyr Val Ser Ser Thr Asp Gly Ser Phe865 870 875 880Leu Asp Ser Val Ile Gln Asn Gly Tyr Ala Phe Thr Asp Arg Tyr Asp885 890 895Leu Gly Ile Ser Lys Pro Asn Lys Tyr Gly Thr Ala Asp Asp Leu Val900 905 910Lys Ala Ile Lys Ala Leu His Ser Lys Gly Ile Lys Val Met Ala Asp915 920 925Trp Val Pro Asp Gln Met Tyr Ala Phe Pro Glu Lys Glu Val Val Thr930 935 940Ala Thr Arg Val Asp Lys Tyr Gly Thr Pro Val Ala Gly Ser Gln Ile945 950 955 960Lys Asn Thr Leu Tyr Val Val Asp Gly Lys Ser Ser Gly Lys Asp Gln965 970 975Gln Ala Lys Tyr Gly Gly Ala Phe Leu Glu Glu Leu Gln Ala Lys Tyr980 985 990Pro Glu Leu Phe Ala Arg Lys Gln Ile Ser Thr Gly Val Pro Met Asp995 10001005Pro Ser Val Lys Ile Lys Gln Trp Ser Ala Lys Tyr Phe Asn Gly101010151020Thr Asn Ile Leu Gly Arg Gly Ala Gly Tyr Val Leu Lys Asp Gln102510301035Ala Thr Asn Thr Tyr Phe Asn Ile Ser Asp Asn Lys Glu Ile Asn104010451050Phe Leu Pro Lys Thr Leu Leu Asn Gln Asp Ser Gln Val Gly Phe105510601065Ser Tyr Asp Gly Lys Gly Tyr Val Tyr Tyr Ser Thr Ser Gly Tyr107010751080
變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因疫苗及其制備方法.ST25Gln Ala Lys Asn Thr Phe Ile Ser Glu Gly Asp Lys Trp Tyr Tyr108510901095Phe Asp Asn Asn Gly Tyr Met Val Thr Gly Ala Gln Ser Ile Asn110011051110Gly Val Asn Tyr Tyr Phe Leu Ser Asn Gly Leu Gln Leu Arg Asp111511201125Ala Ile Leu Lys Asn Glu Asp Gly Thr Tyr Ala Tyr Tyr Gly Asn113011351140Asp Gly Arg Arg Tyr Glu Asn Gly Tyr Tyr Gln Phe Met Ser Gly114511501155Val Trp Arg His Phe Asn Asn Gly Glu Met Ser Val Gly Leu Thr116011651170Val Ile Asp Gly Gln Val Gln Tyr Phe Asp Glu Met Gly Tyr Gln117511801185Ala Lys Gly Lys Phe Val Thr Thr Ala Asp Gly Lys Ile Arg Tyr119011951200Phe Asp Lys Gln Ser Gly Asn Met Tyr Arg Asn Arg Phe Ile Glu120512101215Asn Glu Glu Gly Lys Trp Leu Tyr Leu Gly Glu Asp Gly Ala Ala122012251230Val Thr Gly Ser Gln Thr Ile Asn Gly Gln His Leu Tyr Phe Arg123512401245Ala Asn Gly Val Gln Val Lys Gly Glu Phe Val Thr Asp His His125012551260Gly Arg Ile Ser Tyr Tyr Asp Gly Asn Ser Gly Asp Gln Ile Arg126512701275Asn Arg Phe Val Arg Asn Ala Gln Gly Gln Trp Phe Tyr Phe Asp128012851290Asn Asn Gly Tyr Ala Val Thr Gly Ala Arg Thr Ile Asn Gly Gln129513001305Leu Leu Tyr Phe Arg Ala Asn Gly Val Gln Val Lys Gly Glu Phe131013151320Val Thr Asp Arg Tyr Gly Arg Ile Ser Tyr Tyr Asp Gly Asn Ser132513301335Gly Asp Gln Ile Arg Asn Arg Phe Val Arg Asn Ala Gln Gly Gln134013451350Trp Phe Tyr Phe Asp Asn Asn Gly Tyr Ala Val Thr Gly Ala Arg135513601365
變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因疫苗及其制備方法.ST25Thr Ile Asn Gly Gln His Leu Tyr Phe Arg Ala Asn Gly Val Gln137013751380Val Lys Gly Glu Phe Val Thr Asp Arg His Gly Arg Ile Ser Tyr138513901395Tyr Asp Gly Asn Ser Gly Asp Gln Ile Arg Asn Arg Phe Val Arg140014051410Asn Ala Gln Gly Gln Trp Phe Tyr Phe Asp Asn Asn Gly Tyr Ala141514201425Val Thr Gly Ala Arg Thr Ile Asn Gly Gln His Leu Tyr Phe Arg143014351440Ala Asn Gly Val Gln Val Lys Gly Glu Phe Val Thr Asp Arg Tyr144514501455Gly Arg Ile Ser Tyr Tyr Asp Ala Asn Ser Gly Glu Arg Val Arg146014651470Ile Asn147權(quán)利要求
1.一種治療和預(yù)防變形鏈球菌相關(guān)疾病的疫苗，其特征在于含有序列SEQ IDNo.3所示的的變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶B編碼基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于所述的變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶B編碼cDNA裝載于表達(dá)載體上。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的疫苗，其特征在于所述的表達(dá)載體為真核表達(dá)載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的疫苗，其特征在于所述的真核表達(dá)載體為質(zhì)粒。
5.根據(jù)權(quán)利要求1～4所述的疫苗，其特征在于所述的變形鏈球菌相關(guān)疾病為齲病。
6.一種制備權(quán)利要求2所述的疫苗的方法，其特征在于包括以下步驟a、設(shè)計合成序列SEQ ID No.1所示的特異性上游引物和序列SEQ ID No.2所示的特異性下游引物，用這對引物從變鏈菌基因組DNA中擴(kuò)增制備變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶B編碼基因；b、將所得變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶B編碼基因轉(zhuǎn)載在表達(dá)載體上。
7.一種藥物組合物，其特征在于含有權(quán)利要求1～5任一項所述的疫苗以及藥學(xué)上可以接受的載體和賦形劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其特征在于還含有免疫佐劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的藥物組合物，其特征在于所述的免疫佐劑是氫氧化鋁、脂質(zhì)體或霍亂毒素B亞單位。
10.根據(jù)權(quán)利要求7～9任一項所述的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物的劑型是口服制劑、口含制劑或注射劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因疫苗及其制備方法。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，該藥物組合物含有本發(fā)明疫苗以及藥學(xué)上可以接受的載體和賦形劑。功效實驗證明了本發(fā)明基因疫苗能夠持續(xù)高水平的誘導(dǎo)針對變形鏈球菌表面蛋白的免疫反應(yīng)，對齲病等變形鏈球菌相關(guān)疾病具有明顯的療效，并且經(jīng)檢測不會整合進(jìn)宿主細(xì)胞的基因組，也不會對受試者造成體重降低等其他不良影響。具有很好的安全性，符合用藥要求，市場前景很好。
文檔編號A61P31/00GK101036791SQ20061002050
公開日2007年9月19日 申請日期2006年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月17日
發(fā)明者劉天佳, 楊錦波, 劉建國, 郭麗宏, 楊德琴, 曹福嫻, 賈文祥, 李繼遙, 周學(xué)東, 譚紅 申請人:四川大學(xué)