一種不同粒徑跨血腦屏障膜熒光二氧化硅納米顆粒的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及不同粒徑跨血腦屏障膜熒光二氧化硅的制備方法，包括熒光3?氨丙基三乙氧基硅烷前體的制備，熒光二氧化硅納米顆粒FSiNPs的制備，F(xiàn)SiNPs?PEG2000?Mal的制備，F(xiàn)SiNPs?PEG2000?CDX的制備。該方法控制反應(yīng)條件制備不同尺寸的熒光二氧化硅納米顆粒，并在其表面選擇性連接跨血腦屏障膜靶向分子。該熒光納米顆粒具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、生物相容性好、熒光信號(hào)強(qiáng)等特點(diǎn)。所得的產(chǎn)物能滿足科研的需求。本發(fā)明中的制備方法工藝簡單，可操作性強(qiáng)，能進(jìn)一步滿足生產(chǎn)和應(yīng)用。
【專利說明】
一種不同粒徑跨血腦屏障膜熒光二氧化硅納米顆粒的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明具體涉及一種以二氧化硅為介質(zhì)，同時(shí)連接熒光分子和血腦屏障靶向分子的制備技術(shù)。本發(fā)明屬于納米生物醫(yī)藥材料領(lǐng)域?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)在2008年的報(bào)道，在全球范圍內(nèi)，腦腫瘤的發(fā)病率大約為 3.5/100，000。在全身腫瘤的發(fā)病率中，其發(fā)病率僅次于胃、子宮、乳腺及食管癌的發(fā)病率。 此外，腦腫瘤病人的中位生存期非常短，僅為16個(gè)月，在不治療的情況下，只有3 %-10 %的病人能活過5年。目前，由于腦腫瘤，尤其是腦膠質(zhì)瘤呈浸潤性生長，與周圍正常腦組織邊界不清，使得手術(shù)完全切除十分困難，從而導(dǎo)致較高的復(fù)發(fā)率。而化療不僅能殺滅尚處于初期的腦腫瘤細(xì)胞，還能對(duì)術(shù)后殘留的腦腫瘤細(xì)胞起到殺傷作用，從而防止腦腫瘤的復(fù)發(fā)。但是，在腦腫瘤化療方面，最為突出的問題就是由于血腦屏障(BBB，blood-brain barrier)的存在，抗癌藥物自身不能進(jìn)入腦內(nèi)，從而對(duì)腦腫瘤治療起到阻礙作用。
[0003]之所以BBB對(duì)化療藥物起著阻礙效果，這還得歸結(jié)于其自身的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。BBB主要是由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)、內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接(TJs)、基膜、周細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞組成。由于TJs的存在，血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)血液中攜帶的分子的通透性十分低。有研究發(fā)現(xiàn)BBB上的膜孔徑大小約為0.4 nm，比非神經(jīng)內(nèi)皮細(xì)胞的孔徑(6-7 nm)要小的多。此外，TJs還使得 BBB有很高的電阻值(1000-2000 Q / cm2)，從而能夠阻止極性以及帶電荷的物質(zhì)進(jìn)入腦內(nèi)。
[0004]如何穿越BBB并對(duì)腦腫瘤進(jìn)行給藥治療，困擾著廣大的科研工作者。隨著納米技術(shù)的出現(xiàn)，利用納米材料進(jìn)行腦腫瘤靶向遞藥取得了極大的發(fā)展。研究人員通常利用納米材料為遞藥載體，通過在載體表面修飾上靶向分子(小分子、寡聚核苷酸、多肽、抗體等)，利用 BBB表面存在的受體，使得藥物載體能夠在受體介導(dǎo)內(nèi)吞機(jī)制的幫助下主動(dòng)穿透BBB屏障膜，從而進(jìn)入腦腫瘤區(qū)域并釋藥，最終達(dá)到治愈腦腫瘤的目的。
[0005]盡管在腦腫瘤靶向遞藥上取得了一些成果，但目前腦腫瘤靶向遞藥仍然存在靶向性低的問題，具體表現(xiàn)為遞藥載體穿越BBB的能力較低，從而對(duì)治療效果造成較大的影響。 針對(duì)這一問題，我們認(rèn)為藥物載體的粒徑大小很可能是影響靶向效果的重要因素。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種不同粒徑跨血腦屏障膜熒光二氧化硅的制備方法。為實(shí)現(xiàn)這樣的目的，在本發(fā)明的技術(shù)方案中，我們首先用3-氨丙基三乙氧基硅烷 (APTES)對(duì)得到的熒光二氧化硅納米顆粒(FSiNPs)進(jìn)行表面修飾，使其表面修飾上氨基基團(tuán)，為后續(xù)聚乙二醇(PEG)的嫁接提供了可能。接著我們利用NHS( N-羥基琥珀酰亞胺)和氨基的特異性反應(yīng)，將NHS-PEG2(xx)-Mal修飾至FSiNPs表面。為了構(gòu)建有靶分子的FSiNPs，通過 Mai (馬來酰亞胺)基團(tuán)和巰基(-SH)的特異性反應(yīng)，CDX(乙酰膽堿受體介導(dǎo)腦靶向多肽)被修飾至SiNPs-PEG2_上。
[0007] —種不同粒徑跨血腦屏障膜熒光二氧化硅納米顆粒的制備方法，其特征在于，包括如下步驟:(1)熒光3-氨丙基三乙氧基硅烷前體的制備取2.0 mg含羧基的熒光分子，分散在1.0 mL乙醇中，超聲一小段時(shí)間，待溶液澄清后， 在磁力攪拌器的作用下，加入80yL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，避光反應(yīng)24小時(shí)，制備得到熒光APTES前體；(2)熒光二氧化硅納米顆粒FSiNPs的制備依次將0.5 mL TE0S和0.1 mL熒光APTES前體溶解在乙醇/水的混合溶劑中，乙醇:水= 0.5:1-2:1，然后與0.1-1.〇11^25%濃氨水混合，攪拌反應(yīng)24小時(shí)，隨后依次用乙醇和水洗滌3遍，最后4攝氏度保存二甲基甲酰胺(DMH中，制備得到FSiNPs;(3)FSiNPs-PEG2_-Mal 的制備將1.6微升三乙胺加入到上述FSiNPs的DMF溶液中，攪拌均勻，加入20 mg NHS-PEG2Q()()-Mal，室溫下反應(yīng)2小時(shí)；分別用DMF以及水離心洗滌，保存在1.0 mL 10 mM roS(磷酸緩沖鹽溶液，pH 7.4)中；(4)FSiNPs-PEG2_-CDX 的制備稱取1.0 mg SH-⑶X，將其加入到上述roS中，過夜攪拌反應(yīng);反應(yīng)液用roS、水離心洗滌，最后4攝氏度保存在水相中，1.0 mL。[00〇8]所述的含羧基的熒光分子為6-羧基熒光素、5-羧基熒光素、熒光素cy3、熒光素 cy5.5、6_羧基四甲基羅丹明的一種。
[0009]該方法控制反應(yīng)條件制備不同尺寸的熒光二氧化硅納米顆粒，并在其表面選擇性連接跨血腦屏障膜靶向分子。該熒光納米顆粒具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、生物相容性好、熒光信號(hào)強(qiáng)等特點(diǎn)。所得的產(chǎn)物能滿足科研的需求。
[0010]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:(1)本發(fā)明以熒光二氧化硅為介質(zhì)，通過偶聯(lián)的方法將血腦屏障膜靶向分子嫁接其上， 所用原料生物安全性高。
[0011](2)本發(fā)明制備的熒光納米顆粒具有良好的物理化學(xué)穩(wěn)定性、發(fā)光性能和血腦屏障膜靶向性能。
[0012](3)本發(fā)明中的制備方法工藝簡單，可操作性強(qiáng)，能進(jìn)一步滿足生產(chǎn)和應(yīng)用?！靖綀D說明】[0〇13]圖1為實(shí)施例1所制備的30 nm熒光二氧化硅納米顆粒的透射電子顯微鏡圖。[〇〇14]圖2為實(shí)施例2所制備的50 nm熒光二氧化硅納米顆粒的透射電子顯微鏡圖。[〇〇15]圖3為實(shí)施例3所制備的100 nm熒光二氧化硅納米顆粒的透射電子顯微鏡圖。[〇〇16]圖4為實(shí)施例4所制備的200 nm熒光二氧化硅納米顆粒的透射電子顯微鏡圖?！揪唧w實(shí)施方式】[〇〇17]以下通過具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步描述。以下的實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不限制本發(fā)明的范圍。
[0018]實(shí)施例1:1.熒光APTES前體的制備取2.0 mg 6-羧基熒光素，分散在1.0 mL乙醇中，超聲一小段時(shí)間，待溶液澄清后，在磁力攪拌器的作用下，加入80微升APTES，避光反應(yīng)24小時(shí)，制備得到熒光APTES前體。
[0019]2.FSiNPs的制備依次將0.5 mL TE0S和0.1 mL熒光APTES前體溶解在乙醇/水的混合溶劑中(乙醇:水= 0.5:1)，然后與0.1 mL 25%濃氨水混合，攪拌反應(yīng)24小時(shí)。隨后依次用乙醇和水洗滌3遍， 最后4攝氏度保存DMF中，制備得到FSiNPs。
[0020]3.FSiNPs-PEG2QQ()-Mal的制備將1.6微升三乙胺加入到上述FSiNPs的DMF溶液中，攪拌均勻，加入20 mg NHS-PEG2Q(x)-Mal，室溫下反應(yīng)2小時(shí)。分別用DMF以及水離心洗滌，保存在1.0 mL 10 mM roS (磷酸緩沖鹽溶液，pH 7.4)中。
[0021]4.FSiNPs-PEG2_-CDX的制備稱取1.0 mg SH-⑶X，將其加入到上述roS中，過夜攪拌反應(yīng)。反應(yīng)液用roS、水離心洗滌，最后4攝氏度保存在水相中(1.0 mL)。[〇〇22]圖1為所制備的粒徑為30 nm熒光二氧化硅納米顆粒的透射電子顯微鏡圖。[〇〇23]實(shí)施例2:1.熒光APTES前體的制備取2.0 mg熒光素cy3,分散在1.0 mL乙醇中，超聲一小段時(shí)間，待溶液澄清后，在磁力攪拌器的作用下，加入80微升APTES，避光反應(yīng)24小時(shí)，制備得到熒光APTES前體。
[0024]2.FSiNPs的制備依次將0.5 mL TE0S和0.1 mL熒光APTES前體溶解在乙醇/水的混合溶劑中(乙醇:水= 1:1)，然后與0.2 mL 25%濃氨水混合，攪拌反應(yīng)24小時(shí)。隨后依次用乙醇和水洗滌3遍，最后4攝氏度保存DMF中，制備得到FSiNPs。
[0025]3.FSiNPs-PEG2QQ()-Mal的制備將1.6微升三乙胺加入到上述FSiNPs的DMF溶液中，攪拌均勻，加入20 mg NHS-PEG2Q(x)-Mal，室溫下反應(yīng)2小時(shí)。分別用DMF以及水離心洗滌，保存在1.0 mL 10 mM roS (磷酸緩沖鹽溶液，pH 7.4)中。
[0026]4.FSiNPs-PEG2_-CDX的制備稱取1.0 mg SH-⑶X，將其加入到上述roS中，過夜攪拌反應(yīng)。反應(yīng)液用roS、水離心洗滌，最后4攝氏度保存在水相中(1.0 mL)。[〇〇27]圖2為所制備的粒徑為50 nm熒光二氧化硅納米顆粒的透射電子顯微鏡圖。[〇〇28]實(shí)施例3:1.熒光APTES前體的制備取2.0 mg熒光素cy5.5,分散在1.0 mL乙醇中，超聲一小段時(shí)間，待溶液澄清后，在磁力攪拌器的作用下，加入80微升APTES，避光反應(yīng)24小時(shí)，制備得到熒光APTES前體。
[0029]2.FSiNPs的制備依次將0.5 mL TE0S和0.1 mL熒光APTES前體溶解在乙醇/水的混合溶劑中(乙醇:水= 1.5:1)，然后與0.5 mL 25%濃氨水混合，攪拌反應(yīng)24小時(shí)。隨后依次用乙醇和水洗滌3遍，最后4攝氏度保存DMF中，制備得到FSiNPs。
[0030]3.FSiNPs-PEG2_-Mal的制備將1.6微升三乙胺加入到上述FSiNPs的DMF溶液中，攪拌均勻，加入20 mg NHS-PEG2Q(x)-Mal，室溫下反應(yīng)2小時(shí)。分別用DMF以及水離心洗滌，保存在1.0 mL 10 mM roS (磷酸緩沖鹽溶液，pH 7.4)中。
[0031]4.FSiNPs-PEG2_-CDX的制備稱取1.0 mg SH-⑶X，將其加入到上述roS中，過夜攪拌反應(yīng)。反應(yīng)液用roS、水離心洗滌，最后4攝氏度保存在水相中(1.0 mL)。[〇〇32]圖3為所制備的粒徑為100 nm熒光二氧化硅納米顆粒的透射電子顯微鏡圖。[〇〇33]實(shí)施例4:1.熒光APTES前體的制備取2.0 mg6-羧基四甲基羅丹明，分散在1.0 mL乙醇中，超聲一小段時(shí)間，待溶液澄清后，在磁力攪拌器的作用下，加入80微升APTES，避光反應(yīng)24小時(shí)，制備得到熒光APTES前體。
[0034]2.FSiNPs的制備依次將0.5 mL TE0S和0.1 mL熒光APTES前體溶解在乙醇/水的混合溶劑中(乙醇:水= 2:1)，然后與1 mL 25%濃氨水混合，攪拌反應(yīng)24小時(shí)。隨后依次用乙醇和水洗滌3遍，最后4 攝氏度保存DMF中，制備得到FSiNPs。
[0035]3.FSiNPs-PEG2_-Mal的制備將1.6微升三乙胺加入到上述FSiNPs的DMF溶液中，攪拌均勻，加入20 mg NHS-PEG2Q(x)-Mal，室溫下反應(yīng)2小時(shí)。分別用DMF以及水離心洗滌，保存在1.0 mL 10 mM roS (磷酸緩沖鹽溶液，pH 7.4)中。
[0036]4.FSiNPs-PEG2Q〇()-CDX的制備稱取1.0 mg SH-⑶X，將其加入到上述roS中，過夜攪拌反應(yīng)。反應(yīng)液用roS、水離心洗滌，最后4攝氏度保存在水相中(1.0 mL)。[〇〇37]圖4為所制備的粒徑為200 nm熒光二氧化硅納米顆粒的透射電子顯微鏡圖。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種不同粒徑跨血腦屏障膜熒光二氧化硅納米顆粒的制備方法，其特征在于，包括 如下步驟:(1)熒光3-氨丙基三乙氧基硅烷前體的制備取2.0 mg含羧基的熒光分子，分散在1.0 mL乙醇中，超聲一小段時(shí)間，待溶液澄清后， 在磁力攪拌器的作用下，加入80yL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，避光反應(yīng)24小時(shí)，制備 得到熒光APTES前體；(2)熒光二氧化硅納米顆粒FSiNPs的制備依次將0.5 mL TEOS和0.1 mL熒光APTES前體溶解在乙醇/水的混合溶劑中，乙醇:水= 0.5:1-2:1，然后與0.1-1.〇11^25%濃氨水混合，攪拌反應(yīng)24小時(shí)，隨后依次用乙醇和水洗 滌3遍，最后4攝氏度保存二甲基甲酰胺(DMH中，制備得到FSiNPs;(3 )FSiNPs-PEG2_-Mal 的制備將1.6微升三乙胺加入到上述FSiNPs的DMF溶液中，攪拌均勻，加入20 mg NHS-PEG2000-Mal，室溫下反應(yīng)2小時(shí);分別用DMF以及水離心洗滌，保存在1.0 mL 10 mM roS(磷酸緩沖鹽 溶液，pH 7.4)中；(4)FSiNPs-PEG2_-CDX的制備稱取1.0 mg SH-⑶X，將其加入到上述PBS中，過夜攪拌反應(yīng)；反應(yīng)液用roS、水離心洗 滌，最后4攝氏度保存在水相中，1.0 mL。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種不同粒徑跨血腦屏障膜熒光二氧化硅納米顆粒的制備方 法，其特征在于，所述的含羧基的熒光分子為6-羧基熒光素、5-羧基熒光素、熒光素cy3、熒 光素cy5.5、6-羧基四甲基羅丹明的一種。
【文檔編號(hào)】A61K49/00GK105999296SQ201610398081
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年6月7日
【發(fā)明人】何丹農(nóng), 張鵬, 王萍, 金彩虹
【申請(qǐng)人】上海納米技術(shù)及應(yīng)用國家工程研究中心有限公司