一種二元超兩親性納米粒子溶液及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】一種二元超兩親性納米粒子溶液及其制備方法和應(yīng)用，所述納米粒子的構(gòu)筑單元是以全甲基咪唑陽離子取代的β?環(huán)糊精為主體，以金剛烷的某一種衍生物為客體，通過主?客體疏水鍵合作用構(gòu)筑了超兩親納米組裝體；本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：該二元超兩親性納米粒子溶液制備簡便，主、客體原料用量很少；制備的超兩親性納米粒子生物相容性較好且具有很好的穩(wěn)定性；該二元超兩親性納米粒子溶液因其離子表面帶有正電荷而可用于選擇性凝聚DNA和siRNA I，因此該納米組裝體在基因傳遞和基因控制表達(dá)等領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用價值。
【專利說明】
一種二元超兩親性納米粒子溶液及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于超分子納米材料技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種超兩親性納米粒子的制備方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]基因治療是利用特定的遺傳基因(DNA或RNA)代替?zhèn)鹘y(tǒng)藥物進(jìn)行疾病治療的一種方法，基因治療必須將目標(biāo)基因通過某種方式導(dǎo)入到患者的細(xì)胞內(nèi)，并實現(xiàn)成功表達(dá)。而裸露的基因很難被細(xì)胞高效吸收且易被血液中的一些酶所降解，因此，尋找高效安全的基因載體成為科學(xué)家研究的重點(diǎn)，參見:I )C.Sheridan,Nat.B1technol.2011,29,121-128 ； 2)
C.0rtizMellet,J.M.Garcia Fernandez,J.M.Benito ,Chem.Soc.Rev.2011,40,1586-1608；3)T.Takahashi,K.Kono,T.1toh,N.Emi,T.Takagishi,B1conjugate Chem.2003,14,764;4)H.K.Bayele,T.Sakthivel，M.0_DonelI，K.J.Pasi,A.F.Wilderspin，C.A.Lee,1.Toth ,A.T.Florence, J.Pharm.Sc1.2005,94,446。相比于傳統(tǒng)的病毒、脂質(zhì)體、聚合物等常見的基因載體，超兩親性分子載體具有兩方面的優(yōu)勢:一是超兩親性分子制備方法簡單方便，易于通過非共價鍵作用來調(diào)節(jié)分子的兩親性來改變納米粒子的形貌;二是由于超兩親性分子涉及到多種建筑模塊和非共價作用，所以對于外界的光照、溫度、氧化還原、PH值和酶等刺激具有響應(yīng)性，利用超兩未性分子構(gòu)筑具有基因治療功能的超分子納米材料，是超分子化學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一，參見:I )T.Takahashi , C.Kojima, A.Harada,K.Kono ,B1conjugate Chem.2007,18,1349；2)A.Barnard,P.Posocco,S.Pricl,M.Calderon,R.Haag，M.E.Hwang,V.ff.Shum,D.ff.Pack,D.K.Smith,J.Am.Chem.Soc.2011,133,20288；3)S.P.Jones，N.P.Gabrielson,C.H.ffong,H.F.Chow,D.ff.Pack,P.Posocco，M.Fermeglia，S.Pricl，D.K.Smith ,Mol.Pharm.2011,8，416。因此，構(gòu)筑具有特定功能的超分子納米材料，且構(gòu)筑環(huán)糊精衍生物超兩親性納米粒子基因載體具有重大意義和廣闊應(yīng)用前景，參見:I)
D.Zhao,Y.Chen,Y.Liu.Chem.AsianJ.,2014,9,1895-1903；2)P.Hu,Y.Chen,and Y.Liu,Chem.Commun.,2015,51,10839-10842。
[0003]雖然大環(huán)分子在構(gòu)筑超兩親分子功能材料領(lǐng)域已經(jīng)有了很多的研究與文獻(xiàn)報道，參見:I)K.Wang，D.S.Guo，X.Wang，Liu,Y.ACSNan0.2011,5,2880-2894;2)Y.Cao,Y.X.Wang,D.S.Guo，Y.Liu.Sc1.China Chem.2014，57，371-378。但是，目前對于環(huán)糊精的研究卻多限于未修飾的天然環(huán)糊精上，由于天然的環(huán)糊精在水等溶劑中的溶解度不高且在組裝體中的構(gòu)筑功能非常有限，極大地限制了天然環(huán)糊精在生物和醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用，所以天然環(huán)糊精的衍生物在構(gòu)筑超兩親分子功能材料領(lǐng)域的研究報道并不多見，參見:I )T.Bo jinova，Y.Coppel,N.Lauth-de Viguerie,A.Milius, 1.Rico-Lattes,A.Lattes.Langmuir.2003,19,5233-5239；2)Y.ffang,N.Ma,Z.Wang,X.Zhang.Angew.Chem.1nt.Ed.2007，46，2823-2826。因此，通過環(huán)糊精的衍生化可以極大的改善環(huán)糊精的性能，利用非共價作用構(gòu)成超兩親性納米粒子，進(jìn)而實現(xiàn)很多天然環(huán)糊精不能或難以實現(xiàn)的組裝模式和運(yùn)輸功能，為環(huán)糊精及其衍生物在基因治療領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是針對上述技術(shù)分析和存在問題，提供一種二元超兩親性納米粒子溶液及其制備方法和應(yīng)用，該超兩親性納米粒子基于6位全取代的β-環(huán)糊精的環(huán)糊精空腔對金剛烷某一衍生物的包結(jié)作用而形成一種兩親性的構(gòu)筑單元，最終構(gòu)筑成數(shù)百納米尺度的超分子聚集體;該超兩親性納米粒子具有良好的穩(wěn)定性，并可對DNA和RNA進(jìn)行凝聚，因此該納米組裝體在基因傳遞和基因控制表達(dá)等領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用價值。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案:
[0006]—種二元超兩親性納米粒子溶液，所述二元超兩親性納米粒子的構(gòu)筑單元是以全甲基咪唑陽離子取代的環(huán)糊精為主體，以金剛烷某一衍生物為客體，通過主-客體疏水作用構(gòu)筑了該超兩親納米組裝體。
[0007]進(jìn)一步的，所述二元超兩親性納米粒子基于6位全取代的β_環(huán)糊精的環(huán)糊精空腔對該金剛烷衍生物的包結(jié)作用而形成一種兩親性的構(gòu)筑單元，最終構(gòu)筑成數(shù)百納米尺度的超分子聚集體。
[0008]進(jìn)一步的，所述全甲基咪唑陽離子取代的β-環(huán)糊精和金剛烷衍生物的濃度均為0.05mMo
[0009]—種二元超兩親性納米粒子溶液的制備方法，具體方法為:將全甲基咪唑陽離子取代的環(huán)糊精溶解于水中，將金剛烷衍生物溶解于乙醇溶液中，于40°C超聲的條件下將客體溶液緩慢滴加入主體的水溶液中，超聲混合30min后便得到二元超兩親性納米粒子溶液。所述二元超兩親性納米粒子溶液中全甲基咪唑陽離子取代的環(huán)糊精和金剛烷衍生物的濃度均為0.05mM。
[0010]一種二元超兩親性納米粒子溶液的應(yīng)用，所述二元超兩親性納米粒子溶液用于凝聚pBR 322DNA和siRNAI，方法是將pBR 322DNA或siRNAI加入到二元超兩親性納米粒子溶液中監(jiān)測其凝聚效果，以pBR 322DNA和siRNAI為凝聚對象，利用組裝體納米粒子表面的正電荷與DNA及siRNAI的電荷作用而對其進(jìn)行凝聚，所述二元超兩親性納米粒子溶液中全甲基咪唑陽離子取代的β-環(huán)糊精和金剛烷衍生物的濃度均為0.05mM。
[0011]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:該二元超兩親性納米粒子溶液制備方法簡便，主、客體原料用量很少；制備的超兩親性納米粒子生物相容性很好且具有較好的穩(wěn)定性;該二元超兩親性納米粒子溶液可凝聚DNA和siRNA I，在基因傳遞和基因控制表達(dá)等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值。
【附圖說明】
[0012]圖1為主體化合物全甲基咪唑陽離子取代的β-環(huán)糊精(上)與包合物(下)的1HNMR圖譜對比圖。
[0013]圖2為主體化合物全甲基咪唑陽離子取代的β-環(huán)糊精與模型分子的核磁滴定圖及所求的主客體鍵合比圖。
[0014]圖3為全甲基咪唑陽離子取代的β-環(huán)糊精、金剛烷衍生物、兩者混合物及所形成的包合物的X射線粉末衍射圖出峰對照圖。
[0015]圖4為單獨(dú)的全甲基咪唑陽離子取代的β-環(huán)糊精的冷場掃描電子顯微鏡圖(SEM)。
[0016]圖5為單獨(dú)的金剛烷衍生物的冷場掃描電子顯微鏡圖(SEM)。
[0017]圖6為該二元超兩親性納米粒子組裝體的冷場掃描電子顯微鏡圖(SEM)。
[0018]圖7為該二元超兩親性納米粒子組裝體的高分辨透射電子顯微鏡圖(TEM)。
[0019]圖8該二元超兩親性納米粒子溶液的動態(tài)光散射圖。
[°02°]圖9為該二元超兩親性納米粒子溶液的zeta電位圖。
[0021 ]圖10為該二元超兩親性納米粒子溶液的臨界聚集濃度圖(CAC)。
[0022]圖11為該二元超兩親性納米粒子溶液在450nm波長處透過率隨時間變化的曲線圖。
[0023]圖12為該二元超兩親性納米粒子溶液及單獨(dú)的全甲基咪唑陽離子取代的β-環(huán)糊精對pBR 322DNA凝聚的瓊脂糖凝膠電泳實驗照片對比圖。
[0024]圖13為該二元超兩親性納米粒子溶液分別對SiRNAKaWPpBR 322DNA(b)凝聚的瓊脂糖凝膠電泳實驗照片。
[0025]圖14為該二元超兩親性納米粒子溶液對pBR322DNA及siRNAI凝聚效果的瓊脂糖凝膠電泳實驗對比照片。
【具體實施方式】
[0026]實施例:
[0027]—種二元超兩親性納米粒子溶液，所述二元超兩親性納米粒子的構(gòu)筑單元是以全甲基咪唑陽離子取代的環(huán)糊精為主體，以金剛烷某一衍生物(如圖1)為客體，通過主-客體疏水作用構(gòu)筑了一種超兩親納米組裝體。
[0028]—種所述二元超兩親性納米粒子溶液的制備方法，將全甲基咪唑陽離子取代的β-環(huán)糊精溶解于水中，將該金剛烷衍生物溶解于乙醇溶液中，于40°C超聲的條件下將客體溶液緩慢滴加入主體的水溶液中，超聲混合30min后便得到二元超兩親性納米粒子溶液。所述二元超兩親性納米粒子溶液中全甲基咪唑陽離子取代的環(huán)糊精和金剛烷衍生物的濃度均為 0.05mM。
[0029]包合物的證明:
[0030]圖1為主體化合物全甲基咪唑陽離子取代的β-環(huán)糊精(上)與包合物(下)的1HNMR圖譜對比圖。圖中表明:包合物的環(huán)糊精與單獨(dú)的全甲基咪唑陽離子取代的β-環(huán)糊精的H3和抱位移發(fā)生了變化，且包合物的環(huán)糊精的質(zhì)子峰均有一定程度的寬化，說明主客間存在著相互作用，即形成了包合物。
[0031]圖2為主體化合物全甲基咪唑陽離子取代的β-環(huán)糊精與模型分子的核磁滴定圖及所求的主客體鍵合比圖。圖中表明:金剛烷分子上的氫以及全甲基咪唑陽離子取代的環(huán)糊精上的出和抱都有了明顯的位移，證明該主體化合物可包接金剛烷分子，且其鍵和比為1:1，從而也證明本實驗所用的金剛烷衍生物也可以通過疏水作用進(jìn)入環(huán)糊精空腔而形成兩親性超分子單體，進(jìn)而形成一種超兩親納米組裝體。
[0032]圖3為全甲基咪唑陽離子取代的β-環(huán)糊精、金剛烷衍生物、兩者混合物及所形成的包合物的X射線粉末衍射圖出峰對照圖。圖中表明:兩者混合物的出峰位置與單獨(dú)的主體和客體能很好重合，而包合物有明顯的新峰位置，表明有新的物相產(chǎn)生。
[0033]該二元超兩親性納米粒子的粒徑和形貌，分別通過動態(tài)光散射、ZETA電位以及高分辨透射電子顯微鏡進(jìn)行表征，以進(jìn)一步證明包合物的形成。
[0034]圖4為單獨(dú)的全甲基咪唑陽離子取代的β-環(huán)糊精的冷場掃描電子顯微鏡圖(SEM)。圖中表明:單獨(dú)的主體的結(jié)構(gòu)為明顯的晶體。
[0035]圖5為單獨(dú)的金剛烷衍生物的冷場掃描電子顯微鏡圖(SEM)。圖中表明:單獨(dú)的客體是粒徑大約為80nm的無規(guī)則的小顆粒。
[0036]圖6為該二元超兩親性納米粒子組裝體的冷場掃描電子顯微鏡圖(SEM)。圖中表明:形成了較為均勻的納米粒子，且粒徑大約為200nm左右，與動態(tài)光散射結(jié)果能很好符合。
[0037]圖7為該二元超兩親性納米粒子組裝體的高分辨透射電子顯微鏡圖(TEM)。圖中表明:形成了較為均勻的納米粒子，且粒徑大約為200nm左右。
[0038]圖8該二元超兩親性納米粒子溶液的動態(tài)光散射圖。圖中表明:該納米粒子具有較小的分散性，其平均粒徑為265.33nm。所用全甲基咪唑陽離子取代的β-環(huán)糊精與金剛烷衍生物的濃度均為0.05mM。
[0039]圖9為該二元超兩親性納米粒子溶液的zeta電位圖。圖中表明:納米粒子表面電位為+24.81mV，表明該超分子兩親納米粒子表面帶有正電荷。所用全甲基咪唑陽離子取代的
環(huán)糊精與金剛烷衍生物的濃度均為0.05mM。
[0040]然后利用紫外分光光度法對組裝體的進(jìn)行表征:
[0041]圖10該二元超兩親性納米粒子溶液的臨界聚集濃度圖(CAC)。圖中表明:該二元超兩親性納米粒子溶液的臨界聚集濃度為0.02507mM。
[0042]圖11該二元超兩親性納米粒子溶液在450nm波長處透過率隨時間變化的曲線圖。圖中顯示:該二元超分子納米粒子組裝體在450nm波長處的透過率隨時間基本不發(fā)生變化，表明該超分子納米粒子具有很好的穩(wěn)定性，所用甲基咪唑陽離子取代的環(huán)糊精與金剛烷衍生物的濃度均為0.03mM。
[0043]一種所制備的二元超兩親性納米粒子溶液的應(yīng)用，將pBR 322DNA或siRNA I加入到二元超兩親性納米粒子溶液中監(jiān)測其凝聚效果。其中pBR 322DNA、siRNAI的濃度均為lOng/yL，而全甲基咪唑陽離子取代的β-環(huán)糊精和金剛烷衍生物的濃度在瓊脂糖凝膠電泳實驗中均有標(biāo)注。此工作中WpBR 322DNA和siRNA I為凝聚對象，利用組裝體納米粒子表面的正電荷與pBR 322DNA及siRNAI的電荷作用而對其進(jìn)行凝聚。
[0044]瓊脂糖凝膠電泳實驗:
[0045]實驗方法是:將pBR 322DNA或者siRNAI溶液加入到含有全甲基咪唑陽離子取代的環(huán)糊精和所述金剛烷衍生物的二元超分子兩親納米粒子溶液中，其中pBR 322DNA、
s iRNAI的濃度均為I OngAiL，而全甲基咪唑陽離子取代的β_環(huán)糊精和金剛烷衍生物的濃度在瓊脂糖凝膠電泳實驗中均有標(biāo)注。最后將配好的溶液進(jìn)行跑膠，染色以及拍照，從而對比該二元超兩親性納米粒子溶液對PBR322DNA及s iRNAI的凝聚效果。
[0046]圖12瓊脂糖凝膠電泳照片，pBR322DNA( 10ng/yL)。(a)泳帶從左到右依次為:[I ]= 0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10πιΜ; [2]=0、0.01、0.02、
0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.101111。(13)泳帶從左到右依次為:[1]=0、0.03、
0.05、0.08、0.10、0.03、0.05、0.08、0.10mM;[2]=0、0、0、0、0、0.03、0.05、0.08、0.10mM。圖片表明:加入I或1/2后，pBR 322DNA都進(jìn)行了凝聚，表明該二元超兩親性納米粒子表面的電荷可用于凝聚pBR 322DNA，因此所制備的二元超兩親性納米粒子溶液具有很好的凝聚pBR322DNA 功能。
[0047]圖13為該二元超兩親性納米粒子溶液瓊脂糖凝膠電泳實驗照片，(a)siRNAI(10叫/^1^)。泳帶從左到右依次為:[1]=0、0.005、0.008、0.01、0.015、0.02、0.03、0.05、0.06、0.08、0.1mM;[2]=0、0.005、0.008、0.01、0.015、0.02、0.03、0.05、0.06、0.08、
0.10mMo(b)pBR 322DNA( lOng/yL)。泳帶從左到右依次為:[I ] =0、0.005、0.008、0.01、
0.015、0.02、0.03、0.05、0.06、0.08、0.10mM;[2]=0、0.005、0.008、0.01、0.015、0.02、
0.03、0.05、0.06、0.08、0.10mM。圖片表明:當(dāng)該二元超兩親性納米粒子溶液濃度不大于
0.03mM時，對siRNAI不能進(jìn)行很好的凝聚，而當(dāng)其濃度大于0.03mM時，該二元超兩親性納米粒子溶液可較好地凝聚s iRNAI。
[0048]圖14為該二元超兩親性納米粒子溶液瓊脂糖凝膠電泳實驗照片，瓊脂糖凝膠電泳照片，pBR 322DNA( 10ng/yL)，siRNAI(10ng/yL) ,1/2(0.02mM)。泳帶1: [RNA]；泳帶2: 1/2+[RNA];泳帶3: [DNA]；泳帶4: l/2+[DNA]；泳帶5: l/2+[RNA] + [DNA]；泳帶6: [RNA] + [DNA]。圖片表明:通過泳帶I?4，當(dāng)濃度為0.02mM時，該二元超兩親性納米粒子溶液可以凝聚pBR322DNA，但不能凝聚siRNAI;而通過泳帶4?5，在并存的pBR 322DNA和siRNAI溶液中，該二元超兩親性納米粒子溶液可選擇性凝聚pBR 322DNA而不能凝聚siRNAI。
[0049]以上實驗表明此超兩親性納米粒子具有一定穩(wěn)定性，可很好地凝聚pBR 322DNA和siRNAI，而且當(dāng)該二元超兩親性納米粒子溶液濃度不大于0.03mM時，該二元超兩親性納米粒子溶液可選擇性凝聚pBR 322DNA，而不能凝聚siRNA I。
[0050]需要說明的是，上述對實施例的描述是為便于該技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能理解和應(yīng)用本發(fā)明，因此，本發(fā)明不限于這里的實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的揭示，對于本發(fā)明做出的改進(jìn)和修飾都應(yīng)該在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種二元超兩親性納米粒子溶液，其特征在于:所述二元超兩親性納米粒子的構(gòu)筑單元是以全甲基咪唑陽離子取代的β-環(huán)糊精為主體，以金剛烷的某一衍生物為客體，通過主-客體疏水作用構(gòu)筑了該超兩親納米組裝體。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的二元超兩親性納米粒子溶液，其特征在于:所述二元超兩親性納米粒子基于6位全取代的β-環(huán)糊精的環(huán)糊精空腔對該金剛烷衍生物的包結(jié)作用而形成一種兩親性的構(gòu)筑單元，最終構(gòu)筑成數(shù)百納米尺度的超分子聚集體。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的二元超兩親性納米粒子溶液，其特征在于:所述全甲基咪唑陽離子取代的β-環(huán)糊精和該金剛烷衍生物的濃度均為0.05mM。4.一種如權(quán)利要求1所述二元超兩親性納米粒子溶液的制備方法，具體方法為:將全甲基咪唑陽離子取代的環(huán)糊精溶解于水中，將該金剛烷衍生物溶解于乙醇溶液中，于400C超聲的條件下將客體溶液緩慢滴加入主體的水溶液中，超聲混合30min后便得到二元超兩親性納米粒子溶液，所述二元超兩親性納米粒子溶液中全甲基咪唑陽離子取代的環(huán)糊精和所述金剛烷衍生物的濃度均為0.05mM。5.—種如權(quán)利要求1所述二元超兩親性納米粒子溶液的應(yīng)用，其特征在于:所述二元超兩親性納米粒子溶液用于凝聚pBR 322DNA和siRNAI，方法是將pBR 322DNA或siRNAI加入到二元超兩親性納米粒子溶液中監(jiān)測其凝聚效果，以pBR 322DNA和siRNAI為凝聚對象，利用組裝體納米粒子表面的正電荷與DNA及siRNAI的電荷作用而對其進(jìn)行凝聚，所述二元超兩親性納米粒子溶液中全甲基咪唑陽離子取代的β-環(huán)糊精和金剛烷衍生物的濃度均為.0.05mm.
【文檔編號】A61K47/48GK105999289SQ201610204732
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年4月1日
【發(fā)明人】劉育, 石瑞娟, 陳湧, 王麗華
【申請人】南開大學(xué)