362-化 和miR-369-化聯(lián)合檢測（WmiR-16為內(nèi)參）可獲得良好的胃癌診斷價值，miR-190a、 miR-331-5p、miR-362-3p、miR-369-化和miR-16(內(nèi)參）組合可作為胃癌早期診斷和罹患 風(fēng)險評估的生物標(biāo)志物。
[0141]表3 50例胃癌病人和50例健康人（正常對照）的Y值
[0142]
[0143]
[0144]

[0145]目前臨床常用生物標(biāo)志物如CEA、AFP和CA125等用于診斷胃癌的靈敏度 僅為4.7-20.8%，即使聯(lián)合使用其靈敏度也只有69.1%化6〇2,211曰叫皿，^9,6* al.CombineduseofAFP,CEA,CA125andCA19-9improvesthesensitivityforthe diagnosisofgastriccancer.BMCGastroenterol2013. 13:87. )。W上數(shù)據(jù)表明，使 用miRNA聯(lián)合標(biāo)志物診斷胃癌的靈敏度（指相對胃癌病人樣本）能達到84%，高于目前 臨床常用生物標(biāo)志物靈敏度，也高于發(fā)明人前期發(fā)表的利用miR-214作為生物標(biāo)志物的診 斷靈敏度狂hangKC,etal.Hemolysis-freeplasmamiR-214asnovelbiomarkerof gastriccancerandiscorrelatedwithdistantmetastasis.AmJCancerRes2015 ； 5:821-829)。盡管有8名胃癌患者和正常人沒有被此方法檢測出（表3中帶*號數(shù)據(jù)標(biāo) 出），但考慮到腫瘤的異質(zhì)性和個體之間的差異（如臨床中經(jīng)常有如下情況：正常人CEA值 高于正常上限，腫瘤患者CEA值卻在正常范圍內(nèi)），運種結(jié)果符合臨床醫(yī)學(xué)規(guī)律，表明本發(fā) 明標(biāo)志物組合聯(lián)合篩選方法真實、有效，可W被接受和實施。
【主權(quán)項】
1. 胃癌的血漿miRNA生物標(biāo)志物組合，包括以下血漿miRNA:miR-190a、miR-331-5p、 miR-362-3p和miR-369-3p，以及miR-16作為內(nèi)參；其中miR-190a的序列如序列表中SEQ IDNO. 1所示，miR-331-5p的序列如序列表中SEQIDNO. 2所示，miR-362-3p的序列如序 列表中SEQIDNO. 3所示，miR-369-3p的序列如序列表中SEQIDNO. 4所示，miR-16的序 列如序列表中SEQIDNO. 5所示。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的miRNA生物標(biāo)志物組合，在PCR檢測中所述miR-190a、 miR-331-5p、miR-362-3p和miR-369-3p各生物標(biāo)志物聯(lián)合使用按下式系數(shù)分配用于對胃 癌進行判斷： Y- 6. 302XAmiR190a+18. 486XBmiR331 5p+50. 194XCmiR362 3p+16. 113XDmiR3693p 其中，Abiir19Qa是miR-190a在血漿中的表達量（2AagMI)，B_ 331 5p是miR-331-5p在血 漿中的表達量（2aagMI)，Cbiir362 3p是miR-362-3p在血漿中的表達量（2aagMIKDbiir3693p 是miR-369-3p在血漿中的表達量（2A ^值）。3. 權(quán)利要求1或2所述的miRNA生物標(biāo)志物組合在胃腫瘤篩查、輔助胃腫瘤病理鑒定 及胃癌早期臨床診斷中的應(yīng)用。4. 權(quán)利要求1或2所述的miRNA生物標(biāo)志物組合作為胃癌早期聯(lián)合診斷生物標(biāo)志物的 應(yīng)用。5. -種用于胃腫瘤篩查、輔助胃腫瘤病理鑒定及臨床診斷的miRNA檢測試劑盒，包含 與所述miRNA生物標(biāo)志物組合PCR檢測相關(guān)的引物，分別為： miR-190a的RT引物（序列表中SEQIDNO. 6所示）和F端引物（序列表中SEQID NO. 11 所示）； miR-331-5p的RT引物（序列表中SEQIDNO. 7所示）和F端引物（序列表中SEQID NO. 12 所示）； miR-362-3p的RT引物（序列表中SEQIDNO. 8所示）和F端引物（序列表中SEQID NO. 13 所示）； miR-369-3p的RT引物（序列表中SEQIDNO. 9所示和F端引物（序列表中SEQID NO. 14 所示）； 內(nèi)參miR-16的RT引物（序列表中SEQIDNO. 10所示）和F端引物（序列表中SEQ IDNO. 15所示）；以及 通用R端引物（序列表中SEQIDNO. 16所示）。miRNA試劑盒，包含與所述miRNA生 物標(biāo)志物組合PCR檢測相關(guān)的引物，分別為： miR-190a的RT引物（序列表中SEQIDNO. 6所示）和F端引物（序列表中SEQID NO. 11 所示）； miR-331-5p的RT引物（序列表中SEQIDNO. 7所示）和F端引物（序列表中SEQID NO. 12 所示）； miR-362-3p的RT引物（序列表中SEQIDNO. 8所示）和F端引物（序列表中SEQID NO. 13 所示）； miR-369-3p的RT引物（序列表中SEQIDNO. 9所示和F端引物（序列表中SEQID NO. 14 所示）； 內(nèi)參miR-16的RT引物（序列表中SEQIDNO. 10所示）和F端引物（序列表中SEQ IDNO. 15所示）；以及 通用R端引物（序列表中SEQIDNO. 16所示）。6. -種用于胃腫瘤篩查、輔助胃腫瘤病理鑒定及臨床診斷的miRNA檢測試劑盒，具體 包括： 1) 用于合成cDNA的逆轉(zhuǎn)錄引物：是Oligo(dT)特異性的RT引物，miR-190a的RT引 物序列如序列表中SEQIDNO. 6所示，miR-331-5p的RT引物序列如序列表中SEQIDNO. 7 所示，miR-362-3p的RT引物序列如序列表中SEQIDNO. 8所示，miR-369-3p的RT引物序 列如序列表中SEQIDNO. 9所示，miR-16的RT引物序列如序列表中SEQIDNO. 10所示； 2) 用于實時熒光定量PCR的引物和TaqMan探針：miR_190a的F端引物（正向引物） 序列如序列表中SEQIDNO. 11所示，R端引物（反向通用引物）序列如序列表中SEQID NO. 16所示，TaqMan探針序列如序列表中SEQIDNO. 17所示；miR-331-5p的F端引物（正 向引物）序列如序列表中SEQIDNO. 12所示，R端引物（反向通用引物）序列如序列表中 SEQIDNO. 16所示，TaqMan探針序列如序列表中SEQIDNO. 18所示；miR-362-3p的F端引 物（正向引物）序列如序列表中SEQIDNO. 13所示，R端引物（反向通用引物）序列如序 列表中SEQIDNO. 16所示，TaqMan探針序列如序列表中SEQIDNO. 19所示；miR-369-3p的 F端引物（正向引物）序列如序列表中SEQIDNO. 14所示，R端引物（反向通用引物）序 列如序列表中SEQIDNO. 16所示，TaqMan探針序列如序列表中SEQIDNO. 20所示；miR-16 的F端引物（正向引物）序列如序列表中SEQIDNO. 15所示，R端引物（反向通用引物） 序列如序列表中SEQIDNO. 16所示，TaqMan探針序列如序列表中SEQIDNO. 21所示。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的miRNA檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括： 用于15yL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系的試劑（檢測100次用）：lmL逆轉(zhuǎn)錄緩沖液（10X)， 100yL脫氧核苷酸（IOOmM)，50yLRNA酶抑制劑（20U/yL)，150yL逆轉(zhuǎn)錄酶（50U/yL); 或/和 用于20yL實時熒光定量PCR反應(yīng)體系的試劑（檢測100次用）：1. 5mlPCR預(yù)混液 (2X)，100yLF端引物液（20yM)，100yLR端引物液（20yM)，20yLTaqman探針引物 (10yM)和2mL無核酸酶水。8. 權(quán)利要求5-7任一所述的miRNA檢測試劑盒用于基于TaqMan探針的實時熒光定量 PCR技術(shù)診斷胃癌時的使用方法，包括： 1) 提取血漿樣本和健康血漿對照的總RNA; 2) 將血漿總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA; 3) 以cDNA為模板，在miR-190a、miR-331-5p、miR-362-3p、miR-369-3p和miR-16 (內(nèi) 參）的特異引物和TaqMan探針的引導(dǎo)下，用基于TaqMan探針的實時熒光定量PCR技術(shù)檢 測miR-190a、miR-331-5p、miR-362-3p、miR-369-3p和miR-16 (內(nèi)參）在待測人血漿和健 康人血漿中的表達量（2〃1直，&(^ = (^目的11111?熟-(^內(nèi)參11111?熟，&&(^=&(^待 測樣本-ACt正常對照，采用2AAet表示待測樣本中目的miRNA表達量相對于正常對照組 變化的倍數(shù)）； 4) 用算式計算Y值： Y- 6. 302XAmiR190a+18. 486XBmiR331 5p+50. 194XCmiR362 3p+16. 113XDmiR3693p 其中，Abiir19Qa是miR-190a在血漿中的表達量（2AagMI)，B_ 331 5p是miR-331-5p在血 漿中的表達量（2aagMI)，Cbiir362 3p是miR-362-3p在血漿中的表達量（2aagMIKdbiir3693p 是miR-369-3p在血漿中的表達量（2A ^值）， AACt= (CtmiRNA-CtmiR-16)Cancer-(CtmiRNA-CtmiR-16)MeanNormal,CtmiRNA和CtmiR-16分別代表用基于TaqMan探針的實時熒光定量PCR技術(shù)檢測到的目的 miRNA(miR-190a、miR-331-5p、miR-362-3p或miR-369-3p)和內(nèi)參miRNA(miR-16)的Ct值， Cancer代表待測人血衆(zhòng)樣本，Nomal代表健康人血衆(zhòng)樣本（正常對照），Meannormal代表 所有健康人血漿樣本（正常對照）的平均值； 5)判斷：當(dāng)Y值大于4.6時判為陽性（患胃癌），反之為陰性（未患胃癌）。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于：所述步驟3)中的15yL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 體系為：5yL總RNA，1.5yL逆轉(zhuǎn)錄緩沖液（IOX)IyL逆轉(zhuǎn)錄酶（50U/yL)，0. 15yL dNTPs(IOOmM)，0? 19yLRNA酶抑制劑（20U/yL)，3yLRT引物（500nM)和 4. 16yL無核酸 酶水；逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：16°C反應(yīng)30min，42°C反應(yīng)30min，85°C反應(yīng)5min，然后置于4°C 保存。10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述步驟4)中的20yL基于TaqMan 探針的實時熒光定量PCR反應(yīng)體系為：1.33yLcDNA，0. 4yLF端引物（20yM)，0. 4yLR 端引物（20yM)，0.IyLTaqMan探針（10yM)，10yL實時定量PCR預(yù)混液（2X)和 7. 77yL 無核酸酶水；基于TaqMan探針的實時熒光定量PCR反應(yīng)條件為：95°C反應(yīng)10min，95°C反應(yīng) 15秒，60 °C反應(yīng)60秒，40個循環(huán)。
【專利摘要】本發(fā)明公開了胃癌的血漿miRNA生物標(biāo)志物組合及其應(yīng)用，包括以下血漿miRNA：miR-190a、miR-331-5p、miR-362-3p和miR-369-3p，以miR-16作為內(nèi)參。對miR-190a、miR-331-5p、miR-362-3p和miR-369-3p聯(lián)合檢測可獲得良好的胃癌診斷價值，可以實現(xiàn)胃腫瘤篩查、輔助胃腫瘤病理鑒定及臨床診斷。以miR-16作為內(nèi)參，極大地提高了對本發(fā)明胃癌血漿miRNA生物標(biāo)志物組合檢測時相對定量的準(zhǔn)確度。以本發(fā)明的生物標(biāo)記物組合為靶標(biāo)開發(fā)的胃癌miRNA檢測試劑盒，檢測快速方便、檢測靈敏度、特異性高、成本低，可以滿足絕大多數(shù)胃腫瘤病人的檢測需求，應(yīng)用范圍廣，經(jīng)臨床驗證預(yù)測準(zhǔn)確率高。
【IPC分類】C12N15/113, C12Q1/68
【公開號】CN105200157
【申請?zhí)枴緾N201510740895
【發(fā)明人】陳凜, 張珂誠, 郗洪慶, 崔建新, 吳曉松, 衛(wèi)勃, 邊識博, 馬連港, 李佶陽
【申請人】中國人民解放軍總醫(yī)院
【公開日】2015年12月30日
【申請日】2015年11月4日