長鏈非編碼rna基因loc553103在制備鼻咽癌預后制劑上的應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于腫瘤分子生物學領域，具體設及利用長鏈非編碼RNA基因L0巧53103 制備監(jiān)測鼻咽癌復發(fā)轉移和預后預測制劑的方法。
【背景技術】
[0002] 邸病毒巧psteinBarrvirus,邸V)是一種普遍存在的人類瘤疹病毒，可W感染全 球95%左右的成人人口，除偶爾有一小部分人會引起傳染性的單核細胞增多癥外，大部分 被感染者不會出現(xiàn)任何的臨床癥狀，絕大多數(shù)情況下邸V可W在宿主體內長期潛伏感染。 然而，在某些情況下潛伏感染的邸V會導致惡性腫瘤的發(fā)生，包括B細胞來源的伯基特和何 杰金氏淋己瘤，化及上皮細胞來源鼻咽癌和胃癌等。邸V導致惡性腫瘤發(fā)生的機制目前尚未 完全明了，可能與邸V本身編碼一系列基因的表達有關，如邸V編碼的潛伏膜蛋白ULatent MembraneProteinl，LMP1)作為一種致瘤蛋白，能激活許多宿主細胞內癌基因的表達，抑制 抑瘤基因的結構和功能。
[0003] EBV作為雙鏈DNA病毒其基因組大小約為170化，除了可轉錄一系列蛋白編碼基 因外，最近還發(fā)現(xiàn)EBV也可編碼一類微小RNA(microRNA，miRNA)分子。miRNA是一種長約 20~25nt的調控型非編碼RNA，與mRNA不同，miRNA不是DNA和蛋白質之間的"橋梁"，而 是通過與目的基因祀向結合，調控基因的表達水平。邸V是第一個被發(fā)現(xiàn)可編碼miRNA的病 毒，進入宿主后邸V即開始表達產生miRNA,發(fā)揮生物學作用。目前已發(fā)現(xiàn)邸V可編碼25個 miRNAs前體，加工成44個成熟的miRNAs，且EBV編碼的miRNAs在EBV基因組上成簇分布， 可W分為BART和BHRF1兩組。EBV編碼的miRNAs可能通過調控EBV本身編碼的基因或者 宿主細胞內的基因，從而參與了邸V介導的腫瘤惡性轉化，影響包括鼻咽癌、胃癌、淋己瘤 等在內的多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。然而目前對于邸V編碼miRNAs的研究還不是很透徹，44個 成熟的邸VmiRNAs中大部分還沒有功能研究的報道，比如有關邸V編碼的miRNABART6-化 的作用及機制的研究就很少。迄今為止有關BART6-化在鼻咽癌、胃癌等實體瘤發(fā)生發(fā)展中 的作用的關系及其在實體瘤病人的早期篩查、輔助診斷或者療效預測等方面均沒有文獻報 道。
[0004] 我們通過研究表明，BART6-化在鼻咽癌和胃癌組織中的表達均顯著升高，但是非 常有意思的是在鼻咽癌和胃癌組織中BART6-化的表達水平與鼻咽癌和胃癌患者的復發(fā)轉 移呈負相關關系，低表達BART6-化的患者比高表達BART6-化的患者更容易發(fā)生復發(fā)和 轉移，預后更差。運表明盡管邸V是比較明確的致瘤性病毒，但并非邸V編碼的基因全部 都具有促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用，部分基因，包括BART6-化可能具有抑瘤功能，運也表明 邸VmiRNAs的表達水平與腫瘤復發(fā)、轉移預后等臨床表型的關系不能推測，只能通過具體 而細致的實驗研究才能確定。因此，針對BART6-化設計專用原位雜交探針及檢測試劑盒， 或者利用BART6-化特異性引物進行實時巧光定量PCR等技術檢測鼻咽癌和胃癌組織中 BART6-化的表達水平有望為臨床上對腫瘤進行復發(fā)和轉移的預測提供參考。 陽0化]我們在鼻咽癌及胃癌細胞中轉染人工合成的BART6-化，證實在邸V陰性的鼻咽癌 和胃癌細胞中表達BART6-化可W明顯抑制腫瘤細胞的生長增殖W及侵襲轉移能力。因此， BART6-化又可W用于制備抑制腫瘤細胞生長、增殖和預防腫瘤細胞侵襲轉移的制劑。
[0006] 我們還設計了一系列的實驗檢測了BART6-化在鼻咽癌和胃癌細胞中發(fā)揮生物學 功能的分子機制，我們發(fā)現(xiàn)BART6-化可抑制細胞內一個長鏈非編碼RNA(longnon-coding RNA，IncRNA)基因L0C553103 的表達巧eferenceSequence:NR_110997)，我們設計了針對 L0C553103的RNA干擾序列（siRNA)轉染鼻咽癌和胃癌細胞，抑制L0巧53103的表達后，細 胞出現(xiàn)類似轉染BART6-化的細胞生物學表型，即抑制腫瘤細胞生長和增殖W及抑制腫瘤 細胞侵襲與轉移能力。因此，針對L0巧53103的RNA干擾序列（siRNA)也可W用于制備抑 制腫瘤細胞生長、增殖和預防腫瘤細胞侵襲轉移的制劑。此前，有關L0巧53103的功能未見 任何文獻報道。
[0007] 細胞骨架是真核細胞中由微管、微絲和中間纖維=種蛋白纖維搭建而成的存在于 胞漿內的網(wǎng)絡結構，=種成分高度協(xié)調分布，將胞核、質膜、各細胞器連在一起，構成了細胞 形態(tài)維持和運動協(xié)調的支持系統(tǒng)。近年來的研究表明腫瘤細胞運動遷移和侵襲能力與細胞 骨架的動態(tài)調控密切相關，祀向細胞骨架的藥物也可W誘導腫瘤細胞調亡抑制腫瘤細胞的 增殖。我們通過系列實驗證實了BART6-化可通過祀向抑制宿主細胞中L0巧53103的表達， 影響腫瘤細胞中微管微絲的組裝，調控細胞骨架的重構，最終導致腫瘤細胞生長、增殖、侵 襲、轉移等表型的變化。因此，BART6-化和針對L0巧53103的RNA干擾序列（siRNA)還可 W用于制備抑制腫瘤細胞骨架組裝和重構的制劑。
[0008] 另外，我們又在鼻咽癌和胃癌的臨床樣本中檢測L0巧53103的表達狀況，發(fā)現(xiàn)其 在癌旁對照組織中高表達，而在大部分腫瘤組織中低表達，且與BART6-化的表達呈負相 關，L0C553103的表達可W作為患者預后的指標，因此，針對L0巧53103設計專用的實時巧 光定量PCR引物及檢測試劑盒或原位雜交探針及檢測試劑盒，用于檢測鼻咽癌和胃癌組織 L0C553103的表達水平有望為臨床上對運兩種腫瘤進行復發(fā)轉移及預后預測提供參考。
[0009] 總之，我們的研究掲示了BART6-化及一個新的IncRNA基因L0C553103在鼻咽癌 和胃癌等惡性腫瘤發(fā)病過程中的功能，為BART6-化和L0巧53103的應用方法提供了實證。

【發(fā)明內容】

[0010] 本發(fā)明的目的在于提供一種長鏈非編碼RNA基因L0C553103的應用方法，具體是 利用基因L0巧53103的序列制備用于監(jiān)測鼻咽癌復發(fā)轉移和預后預測的制劑，包括：實時 巧光定量PCR引物及試劑、原位雜交探針及原位雜交檢測試劑盒等。
[0011] 長鏈非編碼RNA基因L0C553103的應用方法，L0C553103用于制備監(jiān)測鼻咽癌復 發(fā)轉移和預后預測的制劑；鼻咽癌組織中L0C553103的表達水平與鼻咽癌的復發(fā)轉移呈正 相關關系，且與鼻咽癌患者的不良預后密切相關；該基因在NCBI中的序列號：NR_110997。
[0012] 所述的監(jiān)測鼻咽癌復發(fā)轉移和預后預測的制劑為實時巧光定量PCR檢測制劑或 原位雜交檢測制劑。 陽01引所述的實時巧光定量PCR檢測制劑包括：
[0014] L0C553103正向引物：5' -ACAGTAGTGCGATCAAGGCT-3'；
[0015] L0C553103反向引物：5, -TCACCACCTCCCTGTTCTTC-3,。
[0016] 所述的實時巧光定量PCR檢測制劑還包括：內參基因GAPDH特異性PCR引物：
[0017]正向引物 5 ' -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 ' 陽01 引 反向引物 5, -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3,。
[0019] 所述的原位雜交檢測制劑包括：
[0020] L0C553103 探針序列-1 :5' -CAGAAAAUAAAGUCACAGAGCUCCUGGAAC-3'
[0021] L0C553103 探針序列-2 :5' -ACUGUUUCCUCUCUGCCUUGAUUGAAAUUC-3'
[0022] L0C553103 探針序列-3 :5' -ACACUUUGAAAUUUUUGUCACCUCCCUUGA-3'。
[0023] 所述的原位雜交檢測制劑還包括：陽性對照探針：
[0024] GAP畑探針序列-1 :5' -CCACUUUACCAGAGUUAAAAGCAGCCCUGG-3' 陽02引 GAP畑探針序列-2 :5' -CAGUAGAGGCAGGGAUGAUGUUCUGGAGAG-3,
[0026] GAP畑探針序列-3 :5' -GUCAGAGGAGACCACCUGGUGCUCAGUGUA-3'。
[0027] 所述的原位雜交檢測試劑為試劑盒。
[0028] 試劑盒還包括：
[0029] 地高辛寡核巧酸加尾試劑、抗地高辛-辣根過氧化物酶復合物檢測試劑、DAB染色 試劑；
[0030] 其它常規(guī)生物化學試劑，包括20xSSC，硫酸葡聚糖，去離子甲酯胺，多聚腺巧 酸，多聚脫氧腺巧酸，變性剪切的娃精DNA，酵母轉運RNA，二硫蘇糖醇，50址enhar化s'S solution,PBSbuffer,胃蛋白酶K，牛血清白蛋白，S乙醇胺，醋酸酢，
[0031] TNB緩沖液：pH7.5的0.1MTris-Cl+0.15M化Cl+0.5%阻斷試劑；
[0032]TNT緩沖液：pH7. 5 的 0. 1MTris-Cl+0. 15MNaCl+0. 05%Tween20。
[0033] 我們通過實時巧光定量PCR檢測，W及原位雜交在存檔的鼻咽癌石蠟組織標本中 發(fā)現(xiàn)L0巧53103的表達與鼻咽癌患者的預后密切相關，在鼻咽癌組織中檢測到L0巧53103 的表達水平與鼻咽癌患者的轉移呈正相關關系，L0C553103表達高的患者生存時間更短，提 示基因L0巧53103可作為監(jiān)測鼻咽癌復發(fā)轉移和預后預測的分子標志。本發(fā)明為鼻咽癌的 輔助診斷和預后預測提供了強有力的分子生物學工具，具有深遠的臨床意義和重要的推廣 應用前景。
【附圖說明】
[0034] 圖1為實時巧光定量PCR技術檢測BART6-化在鼻咽癌和正常鼻咽上皮中的表達 情況， 陽03引 BART6-化在鼻咽癌燈）中的表達比正常鼻咽上皮㈱中顯著提高（P<0. 001)。
[0036] 圖2為原位雜交檢測BART6-化在鼻咽癌及正常鼻咽上皮中的表達情況， W37] 左邊為一例鼻咽癌活檢標本，BART6-化在癌組織中高表達，而在癌旁 (Adjacency)正常鼻咽上皮中低表達；右邊為另一例癌旁正常鼻咽上皮標本，BART6-化在 癌旁組織中基本檢測不到。
[0038] 圖3為鼻咽癌及癌旁上皮中BART6-化原位雜交數(shù)據(jù)的統(tǒng)計結果，
[0039] 在40例鼻咽癌癌旁正常上皮（Adjacen巧ofNPC)中有34例BART6-化的表達低， 甚至基本檢測不到（negative),而在115例鼻咽癌（NPC)中57例檢測到有BART6-化的高 表達化i曲），其余58例為低表達（low)，P<0. 001。
[0040]圖4為BART6-化的表達與鼻咽癌遠處轉移的相關性，
[OOW在115例鼻咽癌標本中，92例發(fā)生了復發(fā)轉移，其中31例為原位復發(fā)（local relapse)，61例為遠處轉移（distanceMetastasis)，從統(tǒng)計結果中可W看出遠處轉移的患 者中BART6-化高表達的比例更低（P<0. 05)，表明BART6-化的表達與腫瘤復發(fā)轉移呈負相 關。
[0042] 圖5為BART6-化的表達與鼻咽癌患者預后的關系，
[0043] 鼻咽癌中BART6-化的表達與鼻咽癌患者的預后密切相關，即BART6-化高表達 化i曲）的患者生存時間要明顯長于BART6-化低表達化OW)的患者（P<0. 05)。
[0044] 圖6為原位雜交檢測BART6-化在胃癌及癌旁上皮中的表達情況，
[0045] 左邊為一例胃癌活檢標本，BART6-化在癌組織中高表達；右邊為癌旁正常組織標 本，BART6-化在癌旁組織中基本檢測不到。
[0046] 圖7為BART6-化的表達與胃癌患者預后的關系，
[0047]BART6-化的表達與胃癌患者的預后密切相關，即BART6-化高表達化i曲）的患者 生存時間要明顯長于BART6-化低表達化OW)的患者（P= 0. 04)。 W4引 圖8為在邸V陰性的鼻咽癌細胞5-8F、H肥2和胃癌細胞AGS中導入BART6-化寡 核巧酸序列，BART6-化在腫瘤細胞中的表達顯著升高，
[0049] 在邸V陰性的鼻咽癌細胞5-8F、H肥2和胃癌