一種快速檢測(cè)番茄潰瘍病菌的lamp引物組、試劑盒及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及植物病害的檢測(cè)方法，具體涉及一種利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)快速檢測(cè)番茄潰瘍病菌的引物組、試劑盒和檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]番前細(xì)菌性潰瘍病(Bacterial canker of tomato)是由密執(zhí)安棒形桿菌密執(zhí)安亞種(C/aKiAacter michiganensis subsp.引起的一種維管束病害，經(jīng)種子和土壤傳播。自1909年首次在美國(guó)密執(zhí)安州的溫室番茄上發(fā)現(xiàn)以來(lái)，現(xiàn)已廣泛分布于全球60多個(gè)國(guó)家和地區(qū)，在我國(guó)北京、黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古等地均發(fā)生嚴(yán)重，近年來(lái)發(fā)病呈上升趨勢(shì)，成為番茄生產(chǎn)上的一種毀滅性的病害，造成的產(chǎn)量損失高達(dá)80%以上。我國(guó)1995年將該病原菌列入《全國(guó)植物檢疫對(duì)象名單》，2007年列入《中華人民共和國(guó)進(jìn)境植物檢疫有害生物名錄》。
[0003]通過(guò)種子檢疫和早期病害檢測(cè)能對(duì)該病害起到較好的防控作用。目前對(duì)番茄細(xì)菌性潰瘍病菌檢測(cè)的方法主要有生理生化反應(yīng)、ELISA、PCR、基因芯片和測(cè)序比對(duì)等。在上述方法中，PCR方法應(yīng)用最為廣泛，但基于PCR技術(shù)的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法需要PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)等專業(yè)儀器設(shè)備，且擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)(約3~4 h)，難以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，因此，在實(shí)際工作中需要一種更加便捷、準(zhǔn)確、且適用于現(xiàn)場(chǎng)操作的檢測(cè)新技術(shù)。
[0004]LAMP技術(shù)是由日本榮研化學(xué)株式會(huì)社在2000年開發(fā)的一種新的基因擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)的基本特點(diǎn)是:①恒溫?cái)U(kuò)增:整個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)在恒溫條件(60~65°C)進(jìn)行，不需要特殊儀器設(shè)備；②快速高效:整個(gè)擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測(cè)可在I h內(nèi)完成；③高特異性:針對(duì)靶標(biāo)序列的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條檢測(cè)引物，擴(kuò)增特異性高；④高靈敏度:檢測(cè)極限可低至10個(gè)拷貝或更低；⑤鑒定簡(jiǎn)便:擴(kuò)增產(chǎn)物有多種鑒定方法，如肉眼觀察或利用濁度儀觀察反應(yīng)管內(nèi)沉淀的濁度變化、加入染料觀察顏色變化等。
[0005]目前雖有報(bào)道利用LAMP技術(shù)檢測(cè)番茄細(xì)菌性潰瘍病菌的檢測(cè)方法和試劑盒，但采用的檢測(cè)引物大多根據(jù)番茄潰瘍病菌ITS序列進(jìn)行設(shè)計(jì)的，且沒(méi)有設(shè)計(jì)環(huán)引物。本發(fā)明以番茄潰瘍病菌的特異性基因TomA為檢測(cè)靶標(biāo)對(duì)象，設(shè)計(jì)了 2條內(nèi)引物、2條外引物和2條環(huán)引物，能在60分鐘內(nèi)、63~65°C的反應(yīng)條件下，通過(guò)顯色反應(yīng)對(duì)番茄潰瘍病菌特異性檢出。檢測(cè)特異性更強(qiáng)、靈敏度更高、時(shí)間更短、方法更簡(jiǎn)單。在進(jìn)出口檢疫部門和基層植保部門，本發(fā)明具有廣闊的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的一個(gè)目的在于公開番茄潰瘍病菌T0Iil4基因的LAMP檢測(cè)引物組。
[0007]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于公開番茄潰瘍病菌T0Iil4基因的LAMP檢測(cè)試劑盒。
[0008]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于公開一種基于上述引物組和試劑盒檢測(cè)番茄潰瘍病菌的LAMP檢測(cè)方法。
[0009]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下:
根據(jù)番茄潰瘍病菌的T0iil4基因的核苷酸序列，設(shè)計(jì)TomA基因的LAMP檢測(cè)引物組，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1~6 ;確定LAMP檢測(cè)方法的技術(shù)參數(shù)，并對(duì)檢測(cè)方法的特異性進(jìn)行驗(yàn)證。
[0010]番茄潰瘍病菌中Ton^S因的LAMP檢測(cè)引物組，包括外引物1、外引物2、內(nèi)引物1、內(nèi)引物2、環(huán)引物I和環(huán)引物2，其核苷酸序列分別如下所示:
外引物 1:CGCTGGGCTTGACCGA (SEQ ID NO:I)；
外引物 2:CCCACCGATCGATCCTTCC (SEQ ID NO:2)；
內(nèi)引物 1:TACTCCGGATCGCAGCAGCTAGAGCACGACATGGCGG (SEQ ID NO:3);
內(nèi)引物 2:CGTGACCTCGATCACGGATGCGTAACGCTCCATCACAGTGG (SEQ ID NO:4);
環(huán)引物 1:GGAGATCAGACCATGGCCCTTTA (SEQ ID NO:5)；
環(huán)引物 2:GCGGCGATGACAGAGCA (SEQ ID NO:6)。
[0011]番茄潰瘍病菌中TomA基因的LAMP檢測(cè)試劑盒，包括以下組分:
(1)檢測(cè)引物溶液:由權(quán)利要求1所述的6條引物配制的檢測(cè)引物溶液，外引物1、外引物2、內(nèi)引物1、內(nèi)引物2、環(huán)引物I和環(huán)引物2的濃度依次為4~6 MmoI/L^4-6 Mmol/L、32~48Mmol/L、32~48 Mmol/L、4~6 Mmol/L、4~6 Mmol/L ；
(2)具有鏈置換活性的DNA聚合酶:濃度為7?9U/ μ L ;
(3)1X 反應(yīng)緩沖液:200 mmol/L Tris-HCl、pH 8.8，100 mmol/L KCl, 100 mmol/L(NH4)2SO4,40-100 mmol/L MgSO4,6-14 mol/L 甜菜堿；
(4)dNTPs溶液，由濃度分別為10 mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四種脫氧核糖核苷酸溶液等體積混合而成；
(5)顯色齊IJ:1000XSYBR GREEN I 熒光染料。
[0012]優(yōu)選的，所述的檢測(cè)引物溶液中含有5 Mmol/L外引物1、5 Mmol/L外引物2、40Mmol/L內(nèi)引物1、40 Mmol/L內(nèi)引物2、5 Mmol/L環(huán)引物1、5 Mmol/L環(huán)引物2。
[0013]優(yōu)選的，所述的具有鏈置換活性的DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶，濃度為8 U/μ L0
[0014]優(yōu)選的，所述的10Χ反應(yīng)緩沖液中MgSO4、甜菜堿的濃度分別為80 mmol/L和8mol/L。
[0015]利用以上所述的試劑盒檢測(cè)番茄潰瘍病菌的方法，包括如下步驟:
(1)提取番茄潰瘍病菌基因組DNA:按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取番茄潰瘍病菌基因組DNA ；
(2)配制待測(cè)樣品的LAMP檢測(cè)反應(yīng)體系:在200μ L反應(yīng)管內(nèi)加入模板DNA 2~5 μ L、檢測(cè)引物溶液I μ L、Bst DNA聚合酶I yL、10X反應(yīng)緩沖液2.5 μ UdNTPs溶液2~5 μ L，用滅菌去離子水或超純水補(bǔ)齊至總體積為25 μ L ;
(3)運(yùn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng):63~65°C孵育30~60min，80°C孵育5min終止反應(yīng)；
(4)LAMP擴(kuò)增結(jié)果的鑒定:在反應(yīng)管中加入1~2μ L顯色劑，通過(guò)肉眼觀察顯色結(jié)果來(lái)判斷擴(kuò)增結(jié)果。
[0016]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的TomA基因的LAMP檢測(cè)引物組、試劑盒及檢測(cè)方法具有快速高效、操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，能夠快速準(zhǔn)確鑒定番茄潰瘍病菌。
【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1為實(shí)施例2中進(jìn)行LAMP特異性檢測(cè)的結(jié)果圖，I為番茄潰瘍病菌，2為番茄青枯假單胞菌，3為茄青枯假單胞菌、4為馬鈴薯環(huán)腐病菌、5為黃瓜角斑病菌、6為西瓜果斑病菌、7為馬鈴薯瘡痂病菌、8為空白對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0019]實(shí)施例1試劑盒及其檢測(cè)方法。
[0020]按下列配方制備番茄潰瘍病菌中TbW基因的LAMP檢測(cè)試劑盒，每個(gè)試劑盒的規(guī)格為100次反應(yīng):
(1)檢測(cè)引物溶液:合成外引物1、外引物2、內(nèi)引物1、內(nèi)引物2、環(huán)引物1、環(huán)引物2，將引物干粉用滅菌去離子水或超純水分別配成濃度為100 ym