一種用于鑒定蛤蚧的pcr方法及其特異引物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于中藥材鑒定領(lǐng)域，設(shè)及一種用于鑒定始階的PCR方法及其特異引物。
【背景技術(shù)】
[0002] 始階為壁虎科動(dòng)物始階Ge化0geckoLinnaeus的干燥全體，收載于2010年及即 將實(shí)施的2015年版《中國(guó)藥典》。始階具有補(bǔ)肺益腎，納氣定喘，助陽(yáng)益精的功效，在臨床上 主要用于肺腎不足，虛喘氣促，勞嗽咳血，陽(yáng)瘦，遺精等。
[0003] W始階為主要原料的中成藥，如始階精、始階補(bǔ)腎丸、始階定喘丸等應(yīng)用廣泛，用 量甚大。當(dāng)前國(guó)內(nèi)大壁虎的數(shù)量已急劇減少，幾近枯竭，早在1989年1月，林業(yè)部與農(nóng)業(yè)部 聯(lián)合頒布《國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物名錄》中，就已將始階列為國(guó)家II級(jí)保護(hù)動(dòng)物。近年來(lái) 隨著始階資源的縮減，已有始階的偽品出現(xiàn)。據(jù)文獻(xiàn)資料，市場(chǎng)上出現(xiàn)過(guò)的始階偽品多達(dá)18 種，包括東方蝶順、中國(guó)療順、變色樹(shù)姍、無(wú)樸壁虎、多痛壁虎、紅螺痛順、喜山巖姍、青海沙 財(cái)斤、石龍子、變色沙姍等。市場(chǎng)中也存在始階的偽品，Liu等使用分子檢測(cè)技術(shù)對(duì)9批始階 樣品進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)只有3批為正品始階。對(duì)其中一些品種，始階正品與之形態(tài)學(xué)特征差別 細(xì)微，傳統(tǒng)的鑒別方法很難對(duì)始階藥材進(jìn)行鑒定。尤其是經(jīng)過(guò)炮制加工、運(yùn)輸儲(chǔ)藏后，甚至 切片分類后，市場(chǎng)流通的商品始階形態(tài)有所改變，始階及其混偽品的性狀特征消失，難W區(qū) 分。
[0004] 此外，也有研究表明可采用DNA測(cè)序技術(shù)進(jìn)行鑒別，但DNA測(cè)序技術(shù)鑒別結(jié)果不夠 直觀，操作略顯復(fù)雜，不能滿足快速鑒別的需求。為確保藥材市場(chǎng)中始階的質(zhì)量及其臨床療 效，需要建立快速、準(zhǔn)確、科學(xué)性強(qiáng)、使用方便的方法進(jìn)行鑒定。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽(yáng)〇化]本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種用于鑒定或輔助鑒定中藥始階的引物對(duì)。
[0006] 本發(fā)明所提供的用于鑒定或輔助鑒定中藥始階的引物對(duì)，具體為如下（a)或化） 所示的引物對(duì)：
[0007] (a)由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)；
[0008] 化）由將序列表中序列1和序列2經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核巧酸的取代和/或缺失和/ 或添加后所得序列所示的兩條單鏈DNA分子組成的，且與（a)中所述引物對(duì)功能相同的引 物對(duì)。
[0009] 所述引物對(duì)中，兩條單鏈DNA分子既可W分別單獨(dú)包裝，也可W按照摩爾比為1:1 的比例混合后包裝在一起。
[0010] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種用于鑒定或輔助鑒定中藥始階的試劑盒。
[0011] 本發(fā)明所提供的用于鑒定或輔助鑒定中藥始階的試劑盒，具體可含有所述引物 對(duì)、dNTP和DNA聚合酶。
[0012] 根據(jù)需要，所述試劑盒中還可含有巧光染料SYBRGreenI。
[0013]制備所述引物對(duì)的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0014] 制備所述引物對(duì)的方法，具體可包括將組成所述引物對(duì)的兩條單鏈DM分子分別 單獨(dú)包裝的步驟。
[0015] 制備所述試劑盒的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0016] 制備所述試劑盒的方法，具體可包括如下A)或B)的步驟：
[0017] A)將組成所述引物對(duì)的兩條單鏈DNA分子分別單獨(dú)包裝后，與分別單獨(dú)包裝的 dNTP和DNA聚合酶包裝于同一個(gè)試劑盒內(nèi)：
[0018]B)將組成所述引物對(duì)的兩條單鏈DNA分子分別單獨(dú)包裝后，與分別單獨(dú)包裝的 dNTP、DNA聚合酶和SYBRGreenI包裝于同一個(gè)試劑盒內(nèi)。
[0019] 所述引物對(duì)或所述試劑盒在鑒定或輔助鑒定中藥始階中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的 保護(hù)范圍。
[0020] 本發(fā)明的第=個(gè)目的是提供一種利用所述引物對(duì)或所述試劑盒鑒定或輔助鑒定 待測(cè)中藥樣品中是否含有中藥始階的方法。
[0021] 本發(fā)明所提供的利用所述引物對(duì)或所述試劑盒鑒定或輔助鑒定待測(cè)中藥樣品中 是否含有中藥始階的方法，具體可包括如下步驟： 陽(yáng)0巧 （a)從待測(cè)中藥樣品中提取基因組DNA作為模板，采用所述引物對(duì)（序列1和序列 2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 陽(yáng)〇2引化）為如下化1)或化。：
[0024]化1)根據(jù)步驟（a)所得PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法確定待測(cè)中藥樣品中是否 含有中藥始階：若PCR產(chǎn)物中含有250-5(K)bp(如400-45化P)的DNA片段，則所述待測(cè)中藥 樣品中含有或候選含有中藥始階；若PCR產(chǎn)物中不含有250-5(K)bp(如400-45化P)的DNA 片段，則所述待測(cè)中藥樣品中不含有或候選不含有中藥始階； 陽(yáng)02引 化。向步驟（a)擴(kuò)增后的反應(yīng)體系中加入巧光染料SYBRGreenI，得到含有巧光 染料的體系，按照如下方法確定待測(cè)中藥樣品中是否含有中藥始階：若觀察到所述含有巧 光染料的體系產(chǎn)生綠色巧光，則所述待測(cè)中藥樣品中含有或候選含有中藥始階；若觀察不 到所述含有巧光染料的體系產(chǎn)生綠色巧光，則所述待測(cè)中藥樣品不含有或候選不含有中藥 始階。
[00%] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種利用所述引物對(duì)或所述試劑盒鑒定或輔助鑒定 待測(cè)中藥樣品為始階正品還是始階偽品的方法。
[0027] 本發(fā)明所提供的利用所述引物對(duì)或所述試劑盒鑒定或輔助鑒定待測(cè)中藥樣品為 始階正品還是始階偽品的方法，具體可包括如下步驟：
[00測(cè) （a)從待測(cè)樣品中提取基因組DNA作為模板，采用所述引物對(duì)（序列1和序列2) 進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0029] 化）為如下化1)或化。：
[0030] 化1)根據(jù)步驟（a)所得PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法確定所述待測(cè)中藥樣品為 始階正品還是始階偽品：若PCR產(chǎn)物中含有250-50化P(如400-45化P)的DNA片段，則所述 待測(cè)中藥樣品為或候選為始階正品；若PCR產(chǎn)物中不含有250-50化P(如400-45化P)的DNA 片段，則所述待測(cè)中藥樣品為或候選為始階偽品； 陽(yáng)03U 化。向步驟（a)擴(kuò)增后的反應(yīng)體系中加入巧光染料SYBR Green I，按照如下方法 確定待測(cè)中藥樣品為始階正品還是始階偽品：若觀察到所述反應(yīng)體系產(chǎn)生綠色巧光，則所 述待測(cè)中藥樣品為或候選為始階正品；若觀察不到所述反應(yīng)體系產(chǎn)生綠色巧光，則所述待 測(cè)中藥樣品為或候選為始階偽品；
[0032] 所述待測(cè)中藥樣品為始階正品或始階偽品；所述始階正品為中藥始階；所述始階 偽品選自變色樹(shù)姍、變色沙姍、麗斑麻姍、紅螺痛順、中國(guó)石龍子和無(wú)樸壁虎的任一種或任 幾種。 W33] 在上述兩種方法的步驟（a)中，進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增時(shí)采用的退火溫度可為 60-68°C(如 65°C)。
[0034] 在本發(fā)明中，進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增時(shí)采用的具體反應(yīng)條件如下：95°CImin;95°C5s、 65°C5s，30 個(gè)循環(huán)。
[0035] 在所述方法的步驟（a)中，在進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中，所述引物對(duì)中每條 單鏈DNA分子的終濃度均為80nmol/L。
[0036] 在本發(fā)明中，進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增時(shí)采用的具體反應(yīng)體系如下：10XPCR緩沖液 2. 5yLdNTP(2. 5mmol ?Li)lyLl'aq DNA聚合酶（抓吃1)0. 2yL和模板DNA lyL(30ng)， 上下游鑒別引物（lOymol -Li)各0.2yL滅菌蒸饋水補(bǔ)足至25yL。 W37] 在實(shí)際應(yīng)用中，判斷所述PCR產(chǎn)物中是否含有250-50化P(如400-45化P)的DNA片段，可通過(guò)將所述PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，若電泳結(jié)果顯示有 250-500bp(如400-450bp)目的條帶，則所述PCR產(chǎn)物中含有250-500bp(如400-450bp)的 DNA片段；反之，則不含有250-50化P(如400-45化P)的DNA片段。當(dāng)然也通過(guò)測(cè)序的方法 判定所述PCR產(chǎn)物中是否含有250-50化P(如400-45化P)的DNA片段。
[0038] 在上述兩種方法的步驟化2)中，