系和反應(yīng)條件同實施例1 步驟=1。實驗同時設(shè)置W水替代模板的空白對照，W中國食品藥品檢定研究院提供的中藥 始階作為陽性對照品。實驗重復(fù)=次。
[0078] 反應(yīng)結(jié)束后，一方面，按照實施例1中步驟=2 (1)的方法對待測樣品進行鑒定。另 一方面，按照實施例1中步驟=2 (2)的方法對待測樣品進行鑒定。
[0079] 結(jié)果顯示，利用本發(fā)明的引物對（引物GeJie-1和GeJie-2)對表1中所有的78 個已知始階類中藥樣品進行檢測，始階都能夠擴增出片段大小約為41^p的目的條帶（測 序后序列正為序列表中序列3)。而始階外的其他樣品均未擴增出4^bp目的條帶。圖1、 圖2為部分始階類樣品的特異性PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果。另外，巧光檢測結(jié)果表明，始階均 顯示出明亮綠色巧光，而始階外的其他樣品均不發(fā)綠色巧光。圖3為部分始階類樣品的特 異性PCR巧光檢測結(jié)果?？梢?，采用本發(fā)明的引物對（引物GeJie-1和GeJie-2)鑒定中藥 始階，可通過巧光染色的方法對結(jié)果進行直接判定，操作簡便，且檢測準(zhǔn)確率高達100 %。
[0080] 實施例3、采用實施例1制備的試劑盒鑒定中藥始階的靈敏度分析
[0081] 待測樣品：中藥始階（毫州）。符合中國藥典（2010年版）一部正文各藥材項下 的有關(guān)規(guī)定。通過鑒定，藥材實物與名稱相符，質(zhì)量符合標(biāo)準(zhǔn)。
[0082] 對照樣品：變色樹姍；變色沙姍；麗斑麻姍；紅螺痛順；中國石龍子；無樸壁虎符 合中國藥典（2010年版）一部正文各藥材項下的有關(guān)規(guī)定。通過鑒定，藥材實物與名稱相 符，質(zhì)量符合標(biāo)準(zhǔn)。 陽08引一、從待測樣品中提取基因組DNA
[0084] 分別取約50mg干燥樣品，用CTAB法提取總DNA。具體參照實施例2步驟一進行。 陽0化]二、PCR擴增
[0086] 將步驟一從中藥始階和其他對照樣品中分別提取的基因組DNA進行倍比稀釋，得 到基因組DNA模板濃度分別為l(K)ng/yl、20ng/yl、4ng/y1、Ing/y1的系列稀釋液，W各 稀釋液分別為模板，采用實施例1步驟一設(shè)計的引物對（引物GeJie-1和GeJie-2)進行 PCR擴增。具體的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同實施例1步驟S1。實驗同時設(shè)置W雙蒸水為模 板作為陰性對照。實驗重復(fù)=次。
[0087] 反應(yīng)結(jié)束后，按照實施例1中步驟=2的方法對待測樣品和對照樣品進行鑒定。 陽08引結(jié)果如圖4所示，從圖中可W看出：
[0089]利用本發(fā)明的引物對（引物GeJie-1和GeJie-2)對中藥始階進行檢測，當(dāng)模板濃 度為4ng/y1時仍能夠檢測到大小約為4^bp的目的條帶。將大小約為4^bp的目的條帶 回收測序，其序列正為序列表中序列3。而對其他對照樣品的均為檢測到大小約為412bp的 目的條帶。
【主權(quán)項】
1. 用于鑒定或輔助鑒定中藥蛤蚧的引物對，為如下（a)或（b)所示的引物對： (a) 由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對； (b) 由將序列表中序列1和序列2經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添 加后所得序列所示的兩條單鏈DNA分子組成的，且與（a)中所述引物對功能相同的引物對。2. 用于鑒定或輔助鑒定中藥蛤蚧的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒中含有權(quán)利要求 1所述的引物對、dNTP和DNA聚合酶。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒中還含有熒光染料SYBR Green1〇4. 制備權(quán)利要求1所述引物對的方法，包括將組成所述引物對的兩條單鏈DNA分子分 別單獨包裝的步驟。5. 制備權(quán)利要求2或3所述試劑盒的方法，包括如下A)或B)的步驟： A) 將組成所述引物對的兩條單鏈DNA分子分別單獨包裝后，與分別單獨包裝的dNTP和 DNA聚合酶包裝于同一個試劑盒內(nèi)： B) 將組成所述引物對的兩條單鏈DNA分子分別單獨包裝后，與分別單獨包裝的dNTP、 DNA聚合酶和SYBRGreenI包裝于同一個試劑盒內(nèi)。6. 權(quán)利要求1所述的引物對或權(quán)利要求2或3所述的試劑盒在鑒定或輔助鑒定中藥蛤 蚧中的應(yīng)用。7. 利用權(quán)利要求1所述的引物對或權(quán)利要求2或3所述的試劑盒鑒定或輔助鑒定待測 中藥樣品中是否含有中藥蛤蚧的方法，包括如下步驟： (a) 從待測中藥樣品中提取基因組DNA作為模板，采用權(quán)利要求1所述的引物對進行 PCR擴增； (b) 為如下（bl)或（b2): (bl)根據(jù)步驟（a)所得PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法確定待測中藥樣品中是否含有 中藥蛤蚧：若PCR產(chǎn)物中含有250-500bp的DNA片段，則所述待測中藥樣品中含有或候選含 有中藥蛤蚧；若PCR產(chǎn)物中不含有250-500bp的DNA片段，則所述待測中藥樣品中不含有或 候選不含有中藥蛤蚧； (b2)向步驟（a)擴增后的反應(yīng)體系中加入熒光染料SYBRGreenI，得到含有熒光染 料的體系，按照如下方法確定待測中藥樣品中是否含有中藥蛤蚧：若觀察到所述含有熒光 染料的體系產(chǎn)生綠色熒光，則所述待測中藥樣品中含有或候選含有中藥蛤蚧；若觀察不到 所述含有熒光染料的體系產(chǎn)生綠色熒光，則所述待測中藥樣品不含有或候選不含有中藥蛤 蚧。8. 利用權(quán)利要求1所述的引物對或權(quán)利要求2或3所述的試劑盒鑒定或輔助鑒定待測 中藥樣品為蛤蚧正品還是蛤蚧偽品的方法，包括如下步驟： (a) 從待測樣品中提取基因組DNA作為模板，采用權(quán)利要求1所述的引物對進行PCR擴 增； (b) 為如下（bl)或（b2): (bl)根據(jù)步驟（a)所得PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法確定所述待測中藥樣品為蛤蚧 正品還是蛤蚧偽品：若PCR產(chǎn)物中含有250-500bp的DNA片段，則所述待測中藥樣品為或候 選為蛤蚧正品；若PCR產(chǎn)物中不含有250-500bp的DNA片段，則所述待測中藥樣品為或候選 為始蟻偽品； (b2)向步驟（a)擴增后的反應(yīng)體系中加入熒光染料SYBRGreenI，按照如下方法確定 待測中藥樣品為蛤蚧正品還是蛤蚧偽品：若觀察到所述反應(yīng)體系產(chǎn)生綠色熒光，則所述待 測中藥樣品為或候選為蛤蚧正品；若觀察不到所述反應(yīng)體系產(chǎn)生綠色熒光，則所述待測中 藥樣品為或候選為蛤蚧偽品； 所述待測中藥樣品為蛤蚧正品或蛤蚧偽品；所述蛤蚧正品為中藥蛤蚧；所述蛤蚧偽品 選自變色樹蜥、變色沙蜥、麗斑麻蜥、紅螺疣螈、中國石龍子和無蹼壁虎的任一種或任幾種。9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于：在步驟（a)中，進行所述PCR擴增時 采用的退火溫度為60-68°C;或 在步驟（b2)中，確定所述含有熒光染料的體系是否產(chǎn)生綠色熒光是在365nm紫外波長 下進行檢測的。10. 根據(jù)權(quán)利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于：所述250-500bp的DNA片段為 412bp的DNA片段； 所述412bp的DNA片段具體為序列表中序列3所示的DNA片段。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于鑒定蛤蚧的PCR方法及其特異引物。本發(fā)明所提供的用于鑒定或輔助鑒定中藥蛤蚧的引物對，具體為如下(a)或(b)所示的引物對：(a)由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對；(b)由將序列表中序列1和序列2經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的兩條單鏈DNA分子組成的，且與(a)中所述引物對功能相同的引物對。本發(fā)明通過分析蛤蚧與其混偽品的細(xì)胞色素c氧化酶I基因序列，獲得蛤蚧高特異性區(qū)域，設(shè)計鑒別引物，采用特異性PCR技術(shù)實現(xiàn)了蛤蚧及其混偽品的準(zhǔn)確鑒別，并引入了熒光染料法對真?zhèn)舞b別結(jié)果進行檢測，為實現(xiàn)藥材分子鑒別的現(xiàn)場運用提供技術(shù)支撐。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN105200140
【申請?zhí)枴緾N201510662612
【發(fā)明人】黃璐琦, 袁媛, 蔣超, 趙玉洋
【申請人】中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所
【公開日】2015年12月30日
【申請日】2015年10月14日