一種輔助檢測肉乳兼用牛胴體組成性狀的方法及試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明提供一種輔助檢測肉乳兼用牛禍體組成性狀的方法，同時還提供了其專用 試劑盒，用于牛PSAP基因作為輔助選擇標記的篩查體系和條件，屬于檢測試劑盒領域。
【背景技術】
[0002] 中國西口塔爾牛是我國于20世紀五十年代引進后自主培育的大型肉乳兼用品 種，W其獨特的生產(chǎn)性能和良好的肉用特點在中國平原、草原、山區(qū)等地區(qū)被廣泛推廣，并 表現(xiàn)出其作為新的肉乳兼用型牛品種的巨大優(yōu)勢和發(fā)展?jié)摿Γ蔀閲鴥?nèi)飼養(yǎng)最多，范圍最 廣的兼用牛品種，是目前我國肉牛產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中的主導品種。隨著人們生活水平的提高，對 牛的產(chǎn)肉性能的要求越來越高，對優(yōu)質高檔牛肉的需求也越來越大，因此優(yōu)質牛肉帶來的 可觀經(jīng)濟效益決定了肉牛育種中肉質性狀選擇的重要性。禍體性狀作為由微效多基因控制 的數(shù)量性狀，由于無法活體測定而且受到傳統(tǒng)育種方法的限制，因此從基因水平，利用新分 子遺傳標記篩查應用對肉乳兼用牛禍體組成性狀進行研究成為主要技術手段，實現(xiàn)對優(yōu)良 種牛選育和改良目的。
[0003] 銷脂激活蛋白原（prosaposin，PSA巧基因含有15個外顯子，編碼4個W串聯(lián)形式 排列，處于同一通讀框中的4種銷脂激活蛋白：saposinA、saposinB、saposinC、saposinD。 在小鼠、大鼠和人中均存在=種PSAPmRNA的剪接本：不含外顯子8、含化p的外顯子8和 含9bP完整的外顯子8。而牛的機體中僅存在兩種PSAPmRNA的剪接本：不含外顯子8和 含完整外顯子8。PSAP基因的選擇性剪接具有組織特異性，不同形式的剪接體存在于不同 的組織中。PSAP蛋白通過水解酶加工形成四種saposin蛋白，后者主要作用于溶酶體區(qū)室， 促進銷脂的分解代謝。另外在神經(jīng)W及其它質膜上也有分布，細胞質膜上的銷脂分解產(chǎn)生 親脂性中間體，中間體參與把細胞外信號傳入細胞內(nèi)的調控過程。PSAP蛋白在生命活動中 發(fā)揮重要功能，因此PSAP基因的遺傳標記可能作為肉牛育肥前篩選優(yōu)良禍體組成性狀的 分子標記。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了一種輔助檢測肉乳兼用牛禍體組成性狀的方法及試劑盒，解決當前 對肉牛禍體性狀和肉質性狀相關的重要分子遺傳標記篩查的難題。
[0005] 本發(fā)明所述的一種輔助檢測肉乳兼用牛禍體組成性狀的方法，解決方案如下： W中國西口塔爾牛PSAP基因特異性SNP位點設計一對引物，進行嚴格的PCR反應體系 進行樣品的PCR擴增和電泳，并根據(jù)測序結果篩查出SNPs遺傳標記，進行單倍型分析，判定 出陽性個體。
[0006] 本發(fā)明所述的一種輔助檢測肉乳兼用牛禍體組成性狀的的方法，其特征在于中國 西口塔爾牛特異性SNPs位點為： 如核巧酸序列如序列表SeqIDNO. 1所示，在序列表SeqIDNO. 1第132bp處的SNP位點G〉A(rs42143937)，第 229bp處的SNP位點C〉T(rs381104888)，第:Mlbp處的 C〉T (rs385887193)，第380bp處的SNP位點C〉T (rs209315330)，第480 bp處的SNP位點C〉T(rs432651539)，第486 bp處的SNP位點C〉G(rsl3：M41330)。
[0007] 本發(fā)明所述的一種輔助檢測肉乳兼用牛禍體組成性狀的的方法，其特征在于中國 西口塔爾牛PSAP基因的特異性引物為： 正向引物F:5'-TTACTGCGAGGTGTGCGAGTT-3'; 反向引物R:5' -CCTCGGCATCACACGGACT-3'。
[0008] 本發(fā)明還公開了一種牛禍體和肉質性狀選擇的的分子檢測試劑盒，本試劑盒包括 上述一對特異性引物和PCR擴增引物及與牛禍體性狀高度相關的單倍型判定標準。
[0009] 本發(fā)明的積極效果在于：可用于種用肉牛早期選擇，進行針對乳肉兼用牛禍體性 狀的遺傳標記篩選。只需要采集少量牛血液或組織(尾部亦可)，進行基因組DNA提取，使用 該分子檢測試劑盒檢測，測序后可鑒定肉牛樣本群體中禍體和肉質性狀的SNPs遺傳標記， 進行單倍型分析后，PSAP基因功能作用區(qū)域的6個SNPs位點及其單倍型組合可W作為一 種輔助檢測肉乳兼用牛禍體性狀的有效分子遺傳標記。PSAP基因引物片段及SNPs位點單 倍型組合Hap2和Hap6能夠作為檢測和預示乳肉兼用牛禍體組成性狀的專用試劑盒?？蒞 作為肉乳兼用牛種質資源創(chuàng)制中優(yōu)良個體的早期選擇和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中入欄前育肥牛的篩 查和生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0010] 圖1為中國西口塔爾牛PSAP基因引物對PCR擴增產(chǎn)物電泳圖； 圖2為本中國西口塔爾牛資源群體測序獲得的PSAP基因SNPs。
【具體實施方式】
[0011] 通過W下實施例進一步舉例描述本發(fā)明，并不W任何方式限制本發(fā)明，在不背離 本發(fā)明的技術解決方案的前提下，對本發(fā)明所作的本領域普通技術人員容易實現(xiàn)的任何改 動或改變都將落入本發(fā)明的權利要求范圍之內(nèi)。
[001引 實施例1 中國西口塔爾牛PSAP基因片段的獲得及功能區(qū)域多態(tài)性檢測方法的建立。
[0013] 1. 1試驗材料：380頭28月齡中國西n塔爾牛公牛來自內(nèi)蒙古通迂市寶龍山肉牛 育肥場。頸靜脈采血，所采血樣均為10mL/頭，用ACD抗凝劑抗凝，-20°c凍存。用血液基 因組DNA提取試劑盒(天根生化公司）從血樣中提取基因組DNA。
[0014] 1.2弓I物設計及PCR擴增：選擇中國西口塔爾牛為試驗材料，為了盡可能多的檢 巧。SNPs位點，選取SNP密度較高的片段，根據(jù)選取的牛PSAP基因序列設計W下引物對： P正向引物F: 5'-TTACTGCGAGGTGTGCGAGTT-3'， P反向引物R:5' -CCTCGGCATCACACGGACT-3'; 用上述引物對在中國西口塔爾?；蚪M中進行PCR擴增。PCR擴增反應為50iiL體系， 包括：上、下游引物（10ymol/L)lyL;Mix(天根）25yL;DNA模板（50ng/yL)2 化； 超純水21yL。PCR擴增反應程序：94°C變性5min;94°C變性30S，63°C退火30s，72°C 延伸40S，進行30個循環(huán)；最后72°C延伸10min。
[0015]PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后獲得目的基因片段，長度為683bp(圖1 示)。凝膠回收、純化目的片段進行測序和序列比對分析。PSAP基因共包含6個SNPs位點：I10-65G〉A、I10-162OT、I10-274OT、I10-313OT、E11-870T、E