胃癌的血漿miRNA生物標志物組合、其應(yīng)用及胃癌早期診斷試劑盒的制作方法【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
中的miRNA及其應(yīng)用，特別是設(shè)及胃癌的血漿miRNA生物標志物組合及其在胃腫瘤篩查、輔助胃腫瘤病理鑒定及臨床診斷中的應(yīng)用。【
背景技術(shù)：
】[0002]胃癌是常見惡性腫瘤之一，其死亡率位居第=。最近數(shù)據(jù)表明，在我國城市男性惡性腫瘤發(fā)病率和女性惡性腫瘤死亡率排名中，胃癌均位列第二，是嚴重威脅人類健康和制約經(jīng)濟社會發(fā)展的重大公共健康問題。胃癌的早期診斷意味著可W提早干預治療，對患者的預后意義重大。目前，用于胃癌診斷主要依賴于內(nèi)鏡活檢，而運種方法有創(chuàng)，給患者帶來痛苦，且對實施此項技術(shù)的醫(yī)師有較高要求。胃癌的無創(chuàng)檢查方法主要是血清腫瘤標志物，例如癌胚抗原CEAXA199等，但是診斷的靈敏度和特異性較低。因此，尋找具有較高靈敏度和特異性的腫瘤標志物對胃癌患者的早診早治具有重要意義。[0003]微小RNA(microRNA，miRNA)是一類平均長度約22(19-24)個核巧酸的非編碼RNA，它廣泛參與了機體正常生理活動調(diào)節(jié)。miRNA可W同時調(diào)節(jié)眾多祀基因，其在細胞中的異常表達將會導致腫瘤的產(chǎn)生。miRNA不但能在腫瘤組織中檢測到，而且在眾多體液中也能穩(wěn)定存在，能耐受酸堿等極端環(huán)境。不僅如此，有研究指出不同腫瘤患者血漿中miRNA的種類具有特異性，運種特性為利用miRNA作為非侵入性的診斷標志物進行早期胃癌檢測提供了契機。在胃癌檢測中，肖斌等發(fā)明了利用組織中的miR-3化檢測（或診斷）胃癌的試劑盒，利用組織中的miR-3化檢測（或診斷）胃癌具有靈敏度較高（達93.33%)的優(yōu)點，但是此發(fā)明沒有提及miR-3化診斷胃癌的特異性如何，也即區(qū)分正常人群的能力，另一方面，該試劑盒應(yīng)用上受限，運是由于受檢物癌灶組織標本需要經(jīng)侵入性操作取得，況且如果能取得胃癌原發(fā)灶組織，完全可W通過病理來診斷（肖斌，鄒全明，朱恩東，黎伯勝，毛旭虎，李娜，郭剛.一種用于診斷或檢測胃癌的試劑盒[P].重慶：CN102002532A，2011-04-06.)。進一步的，張正東等發(fā)明了利用血漿/血清中miR-148a、miR-142、miR-26a和miR-195四種miRNA中的一種或幾種診斷胃癌的試劑盒（張正東，王美林，康美云，劉桑，儲海燕，全娜，吳冬梅，趙慶洪，薬偉達.檢測胃癌的血清/血漿微小RNA標志物及其應(yīng)用[P].江蘇：CN103773761A，2014-05-07.)，在此種試劑盒中，U6基因作為內(nèi)參，但已有文獻報道U6基因在血漿中表達并不穩(wěn)定，因而WU6基因作為內(nèi)參基因計算W上四種miRNA的含量就有可能產(chǎn)生誤差，進而影響診斷的準確性度enzF,RoderburgC,VargasCD,etal.U6isunsuitablefornormalizationofserummiRNAlevelsinpatientswithsepsisorliverfibrosis.ExpMolMed.2013.45:e42;XiangM,ZengY,YangR,etal.U6isnotasuit曰bleendogenouscontrolforthequ曰ntific曰tionofcircul曰tingmicroRNAs.BiochemBio地ysResCommun.2014.454(1):210-4.)，另外，此發(fā)明是利用四種miRNA中的一種或幾種診斷胃癌，但是，發(fā)明人并沒有說明何時采用一種miRNA診斷，何時采用兩種、=種或四種miRNA聯(lián)合診斷，也沒有說明何時采用血清診斷，何時采用血漿診斷，而且如果當用一種miRNA診斷胃癌的結(jié)果與用多種miRNA聯(lián)合診斷胃癌的結(jié)果不一致時，也就是說若一種miRNA診斷結(jié)果判定為胃癌，而多種miRNA聯(lián)合診斷同一受試者結(jié)果判定為非胃癌時，此時該如何判定診斷結(jié)果，此發(fā)明中均未說明，無疑會給使用者造成困擾。因此，迫切需要一種準確、特異、靈敏的利用miRNA診斷胃癌的方法及其專用引物、探針與試劑盒。【
發(fā)明內(nèi)容】[0004]本發(fā)明的一個目的是提供一組用于胃癌早期診斷和罹患風險評估的血漿miRNA標志物組合，利用該血漿miRNA生物標志物組合可用于診斷受試者是否罹患胃癌并進行罹患風險評估。[0005]本發(fā)明所提供的胃癌的血漿miRNA生物標志物組合，包括W下血漿miRNA:miR-190a、miR-331-5p、miR-362-化和miR-369-化，W及miR-16作為內(nèi)參。其中，miR-190a的序列如序列表中SEQIDNO.1所示，miR-331-5p的序列如序列表中SEQIDNO.2所示，miR-362-化的序列如序列表中SEQIDNO.3所示，miR-369-化的序列如序列表中SEQIDNO.4所示，miR-16的序列如序列表中SEQIDNO.5所示。[0006]本發(fā)明的miRNA生物標志物組合能在血漿中穩(wěn)定存在，其在正常人血漿、胃良性病變患者血漿和胃惡性腫瘤患者血漿中的表達量具有差異性，因此，能用于胃腫瘤篩查、輔助胃腫瘤病理鑒定及臨床診斷。因此，本發(fā)明的miRNA生物標志物組合在胃腫瘤篩查、輔助胃腫瘤病理鑒定及胃癌早期臨床診斷中的應(yīng)用也屬于本【
發(fā)明內(nèi)容】。[0007]W上述血漿miRNA生物標志物組合為祀標，用基于化qMan探針的實時巧光定量PCR技術(shù)可用于診斷胃癌。[0008]因此，上述血漿miRNA組合作為胃癌早期聯(lián)合診斷生物標志物的應(yīng)用也是本
發(fā)明內(nèi)容。[0009]在所述PCR檢測中所述miR-190a、miR-331-5p、miR-362-化和miR-369-化各生物標志物聯(lián)合使用按下式系數(shù)分配用于對胃癌進行判斷：[0010]Y-6.302XAmiR1903+18.486XBmiR331Sp+50.194XCmiR3623P+16.113XDmiR3腳化[0011]其中，AmiKigOa是miR-igOa在血漿中的表達量（2&&G準），BmiK33i日p是miR-33l-5p在血漿中的表達量（2&值），CmiK3日23P是miR-362-化在血漿中的表達量（2值），DmiR3693P是miR-369-化在血漿中的表達量（2&值）。[0012]本發(fā)明的另一目的是提供一種用于胃腫瘤篩查、輔助胃腫瘤病理鑒定及臨床診斷的miRNA試劑盒。[0013]本發(fā)明所提供的miRNA試劑盒，包含與所述miRNA生物標志物組合PCR檢測相關(guān)的引物，分別為：[0014]miR-190a的RT引物（序列表中SEQIDNO.6所示）和F端引物（序列表中SEQIDNO.11所示）；[0015]miR-331-5p的RT引物（序列表中SEQIDNO.7所示）和F端引物（序列表中SEQIDNO.12所示）；[0016]miR-362-化的RT引物（序列表中SEQIDNO.8所示）和F端引物（序列表中SEQIDNO.13所示）；[0017]miR-369-化的RT引物（序列表中SEQIDNO.9所示和F端引物（序列表中SEQIDNO.14所示）；[001引內(nèi)參miR-16的RT引物（序列表中SEQIDNO.10所示）和F端引物（序列表中沈QIDNO.15所示）；W及[0019]通用R端引物（序列表中SEQIDNO.16所示）。[0020]上述試劑盒具體可包括W下引物和探針：[002。1)用于合成cDNA的逆轉(zhuǎn)錄引物：是特異性的RT莖環(huán)引物，miR-190a的RT引物序列如序列表中SEQIDNO.6所示，miR-331-5p的RT引物序列如序列表中SEQIDNO.7所示，miR-362-化的RT引物序列如序列表中SEQIDNO.8所示，miR-369-化的RT引物序列如序列表中SEQIDNO.9所示，miR-16的RT引物序列如序列表中SEQIDNO.10所示；[002引。用于實時巧光定量PCR的引物和化qMan探針：miR-190a的F端引物（正向引物）序列如序列表中SEQIDNO.11所示，R端引物（反向通用引物）序列如序列表中SEQIDNO.16所示，haMan探針序列如序列表中SEQIDNO.17所示；miR-331-5p的F端引物（正向引物）序列如序列表中SEQIDNO.12所示，R端引物（反向通用引物）序列如序列表中沈QIDNO.16所示，TaqMan探針序列如序列表中沈QIDNO.18所示；miR-362-化的F端引物（正向引物）序列如序列表中SEQIDNO.13所示，R端引物（反向通用引物）序列如序列表中SEQIDNO.16所示，TaqMan探針序列如序列表中SEQIDNO.19所示；miR-369-化的F端引物（正向引物）序列如序列表中SEQIDNO.14所示，R端引物（反向通用引物）序列如序列表中SEQIDNO.16所示，TaqMan探針序列如序列表中SEQIDNO.20所示；miR-16的F端引物（正向引物）序列如序列表中SEQIDNO.15所示，R端引物（反向通用引物）序列如序列表中SEQIDNO.16所示，TaqMan探針序列如序列表中SEQIDNO.21所示。[0023]所述化qMan探針為經(jīng)過巧光標記的，其5'端標記有報告巧光基團，如肥X、FAM等，優(yōu)選為FAM，其3'端標記有澤滅巧光基團，如ECLIPSE、TAMRA、MGB等，優(yōu)選為MGB。[0024]所述試劑盒還包括W下用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系的試劑（可檢測100次）：lmL逆轉(zhuǎn)錄緩沖液（10X)，100yL脫氧核巧酸（lOOmM)，50yLRNA酶抑制劑（20U/yL)，150yL逆轉(zhuǎn)錄酶巧0U/yL)。[00巧]所述試劑盒還包括W下用于實時巧光定量PCR反應(yīng)體系的試劑（可檢測100次）：1.5mlPCR預混液（2X)，100yLF端引物液（20yM)，100yLR端引物液（20yM)，20yl；raqman探針引物（10yM)和2血無核酸酶水。[0026]W上述血漿miRNA生物標志物組合為祀標，使用上述miRNA試劑盒基于化qMan探針的實時巧光定量PCR技術(shù)診斷胃癌的方法，可進行W下操作：[0027]1)制備待測人血漿樣本，W健康人血漿樣本作為正常對照；[002引。提取血漿總RNA;[0029]3)將血漿總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA;[0030]4)WcDNA為模板，在miR-190a、miR-331-5p、miR-362-3p、miR-369-3p和miR-16(內(nèi)參）的特異引物和化qMan探針的引導下，用基于化qMan探針的實時巧光定量PCR技術(shù)檢測11111?-190日、11111?-331-59、11111?-362-化、11111?-369-化和11111?-16(內(nèi)參）在待測人血漿和健康人血漿中的表達量采用2表示待測樣本中目的miRNA表達量相對于正常對照組變化的倍數(shù)：[00引]2&&ct值中，Act=Ct目的miRNA-Ct內(nèi)參miRNA，[003引AACt=ACt待巧U樣本-ACt正常對照；[003引W采用2相對定量法分析數(shù)據(jù)，Logistic回歸方程（判斷公式）：Y=6.302XAmiRI90a+18.486XBmiR3315p+S0.igAXCmiR3623p+lG.llSXDmiR3693p，其中，AmiR190a是miR-190a在血漿中的表達量（2準），BmiK33i5p是miR-331-5p在血漿中的表達量（2值），CmiR3623P是miR-362-化在血漿中的表達量（2值），DmiR3693P是miR-369-化在血漿中的表達量（2值），AAct=(CtmiRNA-CtmiR-16)Cancer-(CtmiRNA-CtmiR-16)MeanNormal，CtmiRNA和CtmiR-16分別代表用基于化qMan探針的實時巧光定量PCR技術(shù)檢測到的目的mi當前第1頁1 2 3 4