一種何首烏中順式和反式二苯乙烯苷對照品的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種何首烏中順式和反式二苯乙烯苷對照品的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 何首烏為寥科植物何首烏Polygonum multiflorum Thunb.的干燥塊根，解毒，消 癰，截瘧，潤腸通便。用于瘡癰，瘰疬，風(fēng)疹瘙癢，久瘧體虛，腸燥便秘。二苯乙烯苷（2,3,5， 4'-四羥基二苯乙烯-2-0-β-D-葡萄糖苷）是何首烏中的主要活性物質(zhì)之一，《中國藥典》 規(guī)定其含量生首烏不應(yīng)低于1%，制首烏不應(yīng)低于0.7%。二苯乙烯苷存在順反異構(gòu)體，光 照條件下何首烏中的反式-二苯乙烯苷（如結(jié)構(gòu)式B所示）部分轉(zhuǎn)化成順式結(jié)構(gòu)（如結(jié)構(gòu) 式A所示），但總含量不變。
[0003]
[0004] 在自然條件下，主要以反式-二苯乙烯苷形式存在，對其藥理作用研究也較多，具 有抗氧化、降血脂、抑制骨質(zhì)疏松、抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞過度增生、神經(jīng)保護(hù)、心肌保護(hù)、改善 動(dòng)脈硬化及加速血流等作用。藥理研究表明，順式二苯乙烯苷對正常小鼠和急性高血脂小 鼠的降血脂作用與反式基本相同，但對慢性高血脂小鼠血漿中總膽固醇、甘油三酯的降低 作用明顯強(qiáng)于反式二苯乙烯苷。長期以來，對何首烏中二苯乙烯苷的研究以反式-二苯乙 烯苷為主，忽視了何首烏中順式-二苯乙烯苷的存在及其藥理作用，因此，為進(jìn)一步研究順 式-二苯乙烯苷藥理活性，急需建立高純度順式-二苯乙烯苷的制備方法。近年來，國內(nèi)外 專家學(xué)者對何首烏中THSG的研究頗為關(guān)注，相關(guān)提取分離方法報(bào)道很多，但是精制方法多 限制于大孔吸附樹脂方法、聚酰胺吸附法等，操作繁瑣，周期長。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種何首烏中順式和反式二苯乙 烯苷對照品的制備方法，通過制備型高效液相色譜法進(jìn)行分離純化，得到高純度反式-二 苯乙烯苷和順式-二苯乙烯苷單體，為研究反式和順式-二苯乙烯苷的生理活性試驗(yàn)提供 純品，為二者的大量制備生產(chǎn)提供理論依據(jù)。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：
[0007] -種何首烏中順式和反式二苯乙烯苷對照品的制備方法，包括以下步驟：
[0008] (1)將何首烏藥材干燥，粉碎，加入體積濃度為60-80 %的乙醇溶液提取，乙醇溶 液的加入體積與何首烏藥材的質(zhì)量比為lg: (6-10)ml，提取液過濾，濾液濃縮至無醇味，得 濃縮液；
[0009] (2)向步驟⑴制得的濃縮液中加入石油醚萃取，萃取后的水相調(diào)節(jié)pH至9-11， 加入乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯相濃縮，得提取物；
[0010] (3)將步驟（2)的提取物采用半制備高效液相色譜進(jìn)行分離純化，色譜條件為：色 譜柱為 Shim-pack PREP-ODS 柱（20mmX250mm，15 μπι)，流動(dòng)相為乙腈-水，體積比 25:75， 檢測波長為320nm，收集色譜峰，檢測其純度，合并相同餾分，即分離得到順式和反式二苯乙 烯苷對照品。
[0011] 需要說明的是，由于順式和反式二苯乙烯苷結(jié)構(gòu)相近，因此順式和反式二苯乙烯 苷的出峰時(shí)間比較接近，二者在進(jìn)行液相分離制備時(shí)難度較大，選擇合適的色譜柱和色譜 分離條件尤為關(guān)鍵，本發(fā)明以多個(gè)溶劑體系作為流動(dòng)相進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)不同溶劑體系的 出峰時(shí)間和分離度有明顯的區(qū)別，即使相同的溶劑體系，體系間不同溶劑的配比關(guān)系也會(huì) 影響制備產(chǎn)物的分離度。經(jīng)多次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用本發(fā)明的乙腈-水，體積比25:75,作為流動(dòng) 相，順式和反式二苯乙烯苷的出峰時(shí)間合適，而且分離度較好，能夠?qū)崿F(xiàn)將順式和反式二苯 乙烯苷的有效分離。
[0012] 優(yōu)選的，步驟（1)中，提取方式為超聲提取，提取次數(shù)為2-4次，每次0. 5-1小時(shí)。
[0013] 步驟（2)中，石油醚的加入量與濃縮液的體積比為1 : (1-2)。加入石油醚的目的 是除去何首烏的乙醇提取物中低極性的雜質(zhì)，石油醚的加入量會(huì)影響除雜的效果，加入量 過少，則除雜不完全，加入量過多，一是增加了生產(chǎn)成本，二是增加了后續(xù)濃縮處理的負(fù)擔(dān)。
[0014] 步驟（2)中，乙酸乙酯的加入量與濃縮液的體積比為1 : (1-2)。加入乙酸乙酯的 目的是對何首烏乙醇提取物的中高極性物質(zhì)進(jìn)行萃取。
[0015] 步驟（2)中，萃取后的水相中加入氨水進(jìn)行pH調(diào)節(jié)。加入氨水進(jìn)行pH調(diào)節(jié)的目 的是：與乙酸乙酯萃取物中的蒽醌類化合物進(jìn)行結(jié)合，在堿性環(huán)境下，將酸性的蒽醌類化合 物中和成鹽，使之溶于水相，進(jìn)而排除蒽醌類化合物的干擾。
[0016] 二苯乙烯苷類物質(zhì)為糖苷類化合物，具有較高的極性，易溶于醇類溶劑、丙酮、乙 酸乙酯等，難溶于低極性有機(jī)溶劑。本發(fā)明經(jīng)多次優(yōu)選，采用乙醇溶液作為提取溶劑，利用 石油醚去除何首烏中低極性雜質(zhì)；同時(shí)何首烏中含有較多中高極性的蒽醌類化合物，當(dāng)采 用乙酸乙酯萃取時(shí)，易同時(shí)萃取出蒽醌類和二苯乙烯苷類化合物，結(jié)合蒽醌類化合物含有 酚羥基，具有一定酸性，在堿性環(huán)境中成鹽溶于水相，乙酸乙酯萃取得到雜質(zhì)較少的二苯乙 烯苷類組分，從而排除蒽醌類化合物的干擾，使制備的二苯乙烯苷類組分純度相對較高。
[0017] 步驟（3)中，在采用半制備高效液相色譜進(jìn)行分離純化前，將步驟（2)制備的提取 物用甲醇溶解，再用微孔濾膜進(jìn)行過濾，制得樣品液。
[0018] 步驟（3)中，純度檢測采用的方法是高效液相色譜法，色譜條件為：色譜柱為 YMC-PackC18色譜柱（4. 6mmX 250mm，5 μ m)，流動(dòng)相為乙腈-水，體積比25:75，流速為 1.0 mL/min，檢測波長為 320nm。
[0019] 本發(fā)明的有益效果：
[0020] 本發(fā)明考察了甲醇-水、甲醇-乙腈-水、乙腈-水等多個(gè)溶劑條件對何首烏中 二苯乙烯苷粗提物進(jìn)行高效液相色譜分析，結(jié)果表明乙腈-水體系出峰時(shí)間合適，反式和 順式-二苯乙烯苷具有較好的分離度；利用本發(fā)明的乙腈-水體系進(jìn)行半制備液相色譜分 離，較為合適，最終制備出順式-二苯乙烯苷和反式-二苯乙烯苷，純度分別為98. 90%和 99. 66%，得到高純度反式-二苯乙烯苷和順式-二苯乙烯苷單體，為研究反式和順式-二 苯乙烯苷的生理活性試驗(yàn)提供純品，為二者的大量制備生產(chǎn)提供理論依據(jù)。
【附圖說明】
[0021] 圖Ia為本發(fā)明的何首烏藥材中二苯乙烯苷提取物的分析液相色譜圖；
[0022] 圖Ib為順式二苯乙烯苷的液相色譜圖；
[0023] 圖Ic為反式二苯乙烯苷的液相色譜圖；
[0024] 圖2為二苯乙烯苷提取物的半制備液相色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，應(yīng)該說明的是，下述說明僅是為了解 釋本發(fā)明，并不對其內(nèi)容進(jìn)行限定。
[0026] 實(shí)驗(yàn)中所使用的儀器及試劑為：試驗(yàn)用95%乙醇、石油醚、乙酸乙酯、甲醇、鹽酸 均為分析純（天津廣成化學(xué)試劑有限公司），所用水為蒸餾水；液相色譜用乙腈為色譜純 (美國天地公司），所用水為純凈水；何首烏藥材購自濟(jì)南建聯(lián)中藥店，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué) 李佳教授鑒定為寥科植物何首烏Polygonum multiflorum Thunb.的正品藥材。
[0027] 實(shí)施例1 :液相條件的考察
[0028] 在高效液相色譜分析中，理論塔板數(shù)、分離度、拖尾因子是分離檢測效果的重要指 標(biāo)，體現(xiàn)在色譜圖中色譜峰之間的相對位置和峰形上。從色譜圖的直觀分析來看，峰窄而不 同峰的峰間距大的分離是令人滿意的。
[0029] 本發(fā)明中以分離度為考察指標(biāo)，對色譜分析中用到的極性和非極性溶劑的種類、 溶劑的比例進(jìn)行了試驗(yàn)篩選。具體過程如下：
[0030] 將甲醇-水、甲醇-乙腈-水、乙腈-水按不同的體積比配制成一系列流動(dòng)相溶液。
[0031] 供試品和對照品溶液的配制：按常規(guī)方法用流動(dòng)相溶解何首烏中二苯乙烯苷粗提 物，配制成4mg/ml的供試品溶液；用流動(dòng)相溶解分別配制成4 μ g/ml的順式-二苯乙烯苷 和反式-二苯乙烯苷對照品溶液。
[0032] 色譜條件的選擇：色譜柱為YMC-Pack C18色譜柱（4. 6mmX 250mm，5 μ m);檢測波 長為320nm(檢測波長是根據(jù)二苯乙烯苷紫外吸收特征波長在試驗(yàn)中反復(fù)微調(diào)的結(jié)果）；流 動(dòng)相的流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為10 μ 1。
[0033] 將配制好的一系列流動(dòng)相溶液，在上述色譜條件下，對供試品進(jìn)行分離檢測，測定 分離度，結(jié)果見表1。
[0034] 表1不同流動(dòng)相及分離度
[0035]