異種移植物模型中的腫瘤大小達(dá)到500皿3或更多時開始施用。將實(shí)驗(yàn)進(jìn)行 總共6周，并且在腫瘤大小達(dá)到2000mm3或更多時停止。
[0251] 通過W下公式計算腫瘤大?。?br>[0252] 腫瘤大小（mm3)=(長徑*短徑*短徑）/2
[0巧3] 經(jīng)由AN0VA分析實(shí)施效力組的測定，并且排除P-值是0. 05或更小的情況。也就 是說，通過AN0VA分析測試如下的假設(shè)，即抗體處理組中腫瘤大小的分布與抗體未處理組 相比沒有改變，其中在P-值是0. 05或更小時，組確定為非效力組，且在P-值超過0. 05時， 組確定為效力組。
[0巧4] 表9中顯示了來自用于L3-lY/IgG2處理的上述小鼠異種移植物模型的響應(yīng)結(jié) 果：
[0巧引【表9】
[0巧6]
[025引在完成上述實(shí)驗(yàn)后自小鼠提取腫瘤組織，它們的一部分制備為僅福爾馬林固定的 經(jīng)石蠟包埋的（FFP巧塊，并且將剩余部分進(jìn)行依照制造商的方案使用QiagenRNeasyMini 試劑盒（產(chǎn)品目錄編號74104)的總RNA提取。
[0巧9] 使用VentanaMET1肥（免疫組織化學(xué)）（Roche;US2013089541A1)依照制造商 的標(biāo)準(zhǔn)方案，使用制備的FFPE塊W測量表面表達(dá)C-MET，并且使用提取的總RNA通過實(shí) 時PCR(RT-PCR)(MET有義引物；CCTTGAACAGAATCACTG(SEQIDN0:272);MET反義引物； CCATGTTTCATGTATGGTA(SEQIDN0:273))測量c-METmRNA表達(dá)。
[0260] 圖lA中顯示了從VentanaMETI肥獲得的結(jié)果。在此測定法中，在MC得分是 2~3時，將樣品確定為效力組。如圖1A中顯示的，甚至LXFA297,LXFA983,和LXFA1041 (其 是非效力組）具有2~3的I肥得分，該指示了I肥測定法沒有提供效力或非效力組的高 準(zhǔn)確選擇（準(zhǔn)確性：約50% )。
[0261] 同時，圖1B中顯示了在圖1A中確定為效力組的6個模型（LXFA297、LXFA983、 LXFA1041、LXFA623、LXFA526 和LXFA1647)的獲得的RT-PCR結(jié)果。在圖 1B中，Y軸是自 RT-PCR測量的Ct值，X軸是上文獲得的I肥得分，"?"指非效力組，而"?"指效力組。如 圖1B中顯示的，依照RT-PCR的結(jié)果，非效力組中的Ct值均是0或更多，且效力組中的Ct 值均是小于0。因此，與先前存在的IHC測定法相比，依照RT-PCR結(jié)果的選擇提供了非效力 或效力組的更準(zhǔn)確選擇（準(zhǔn)確性：約71 %至約93% )。因此，若主要使用RT-PCR結(jié)果并且 額外考慮IHC得分，則可W實(shí)現(xiàn)更準(zhǔn)確的選擇（例如，在RT-PCR的Ct值小于0且IHC得分 是2至3時，可W選擇樣品作為效力組）。
[0262] 實(shí)施例1 ;生物標(biāo)志物的選擇
[0263] 使用參照例2中的異種移植物樣品（14種臨床前樣品）W測試參照例1中制備的 c-Met抗體L3-lY/IgG2的效力，測量L3-lY/IgG2效力和非效力組中的基因表達(dá)水平。使用 獲得的基因表達(dá)水平，測定效力和非效力組之間基因表達(dá)的差異（Alog2 (exp))，并且選 擇在效力和非效力組之間具有高度差異的基因。
[0264] 使用Affymatrix人ul33plus2. 0微陣列實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)（cell文件），并使用由 Affymatrix提供的微陣列分析控制臺測量基因表達(dá)的差異，測量每種探針的log2(探針強(qiáng) 度）值W用作標(biāo)準(zhǔn)值。表10中匯總了使用的探針：
[0265] 【表10】
[0266]
[0268]
[0269]
[0270]
[0271]
[0272] 基于效力組和非效力組之間測量的表達(dá)水平差異，從最大至最小列出基因。
[0273] 表11中匯總了獲得的結(jié)果（在表11中，deltaexp化Id越大指效力和非效力之 間的表達(dá)水平差異越大）：
[0274] 【表11】
[0275]
[0276] 如表11中顯示的，效力和非效力之間的表達(dá)水平差異W如下的次序列出；T服D7A >MET>RAB31 >FAM126A>P肥 1 >CHML>ST8SIA4 >CAV1。
[0277] 選擇8種基因作為用于測定抗c-Met抗體的效力的生物標(biāo)志物。
[027引實(shí)施例2 ;參照標(biāo)志物的選擇
[0279] 使用總共120個肺癌腺癌微陣列數(shù)據(jù)（公共DB-GE0 ;基因表達(dá)全集；ht中：//www. ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，選擇在細(xì)胞間具有低表達(dá)水平變化的基因。
[0280] 對于自GE0獲得的NS化C腫瘤衍生的總RNA，使用affymetrixU13：3plus2. 0微陣 列原始數(shù)據(jù)（cell文件）測量每個探針的log2(int)值，并列出在上述120個樣品間具有 低變異系數(shù)（CV)的基因。然后，選擇與祀基因（實(shí)施例1中選擇的8種生物標(biāo)志物）具有 相似的l〇g2(int)值分布的基因。表12中匯總了使用的引物：
[028U【表12】
[0282]
[0283]
[0284] 圖2A和2B中顯示了獲得的結(jié)果。如圖2A中顯示的，選擇10種基因（其具有低 基因表達(dá)變化），即邸F1A1，RPL23A，TPT1，皿肥 1，MATR3,SRSF3,HNRNPC，SMARCA4,WDR90， 和TUT1作為參照標(biāo)志物。
[0285] 與先前存在的對照基因相比，測量選擇的參照標(biāo)志物的變化和分類性能差異 (OncotypeDXTM;參見圖 2B)。
[0286] 表13和14中匯總了用于選擇的10種參照標(biāo)志物的探針和引物：
[0287]【表13】
[028引
[0289]
種參照標(biāo)志物與對照基因的cv(變異系數(shù)）值的變化。
[0293] 圖3A(對照基因）和3B(選擇的參照標(biāo)志物）中顯示了獲得的結(jié)果。如圖3A和 3B中顯示的，選擇的10種參照標(biāo)志物的平均CV值是11. 770,其與先前存在的對照基因 的ncotypeDX?)的平均CV值（平均CV= 15. 40335)相比降低得相當(dāng)多。在10種參照標(biāo) 志物中，5種基因RPL23A，TPT1，MTR3,SRSF3,和HNRNPC展現(xiàn)出特別低的基因表達(dá)變化巧 種基因的平均CV值=8. 39)。
[0294] 實(shí)施例3 ;使用選擇的生物標(biāo)志物和參照標(biāo)志物選擇抗c-Met抗體的效力組
[0295] 將選擇的生物標(biāo)志物和參照標(biāo)志物應(yīng)用于小鼠異種移植物模型，并且檢查標(biāo)志物 的效力/非效力組選擇準(zhǔn)確性。
[0296] 對此，將自小鼠異種移植物模型的腫瘤組織提取的總RNA進(jìn)行使用表15的探針和 表16的引物在表17的條件下的PCR，獲得8種生物標(biāo)志物和5種參照標(biāo)志物（TPT1、邸F1M、 TUTUMATR3 和SMARCA4)的Ct值。
[0297]【表15】
[0298]
[0299]
[0300] 【表16】
[0301]
[0302]
[0305] 依照表18實(shí)施效力或非效力組的測定： [030引【表18】
[0307]
[030引
[0309] 在表18中；
[0310]"參照標(biāo)準(zhǔn)值"對于CAV1，F(xiàn)AM126A，MET,RAB31，ST8SIA4,和T服D7A，數(shù)值= [Min(效力值（ACt))+Max(非效力值（ACt)) ] /2 ;
[03川"參照標(biāo)準(zhǔn)值"對于CMHL和raCl=[Min(非效力值（ACt))+Max(效力值(ACt))]/2 ;
[031引 ACt;5種參照標(biāo)志物（TPT1、EEF1M、TUT1、MATR3和SMARCA)的平均Ct值-每種 生物標(biāo)志物的Ct值）； 陽引引Min(效力值（Act));效力組的最小Act;
[0314] Max(非效力值（Act));非效力組的最大Act; 峽巧]Min(非效力值（Act));非效力組的最小Act;和 [0引引Max(效力值（Act));效力組的最大Act;
[0317] 將對每種生物標(biāo)志物計算的ACt值與表18的數(shù)值比較。在CAV1，F(xiàn)AM126A，MET， RAB31，RAB31，ST8SIA4,和raSD7A的情況中，在單個生物標(biāo)志物的ACt值高于表18的數(shù)值 時，樣品確定為效力組，并且在CMHL和P肥1的情況中，在單個生物標(biāo)志物的Act值低于表 18的數(shù)值時，樣品確定為效力組。
[031引表19中顯示了參照例2的14種小鼠異種移植物模型的效力/非效力組的測定準(zhǔn) 確性和A倍數(shù)數(shù)值。
[0引引【表19】
[0320]
[0321] (準(zhǔn)確性：使用每種生物標(biāo)志物獲得的預(yù)測抗體效力的準(zhǔn)確性，隨著數(shù)值越接近 1 (對應(yīng)于100% )，準(zhǔn)確性越高，且通過W下公式計算：
[0322] 準(zhǔn)確性=KTP+TN)/14}
[032引 （TP;在使用生物標(biāo)志物的效力預(yù)測W及在使用L3-lY^gG2治療的實(shí)際實(shí)驗(yàn)中 (見表9)顯示陽性結(jié)果的樣品數(shù)）
[0324] (TN;在使用生物標(biāo)志物的效力預(yù)測W及在使用L3-lY^gG2治療的實(shí)際實(shí)驗(yàn)中 (見表9)顯示陰性結(jié)果的樣品數(shù)）
[03幼 A倍數(shù)；效力和非效力組之間的deltaCt(對照基因（參照標(biāo)志物）Ct(如果參 照標(biāo)志物的數(shù)目是兩種或更多種，則其意為"參照標(biāo)志物的平均Ct值-祀基因（生物標(biāo) 志物）Ct)的差異，指示能夠區(qū)別效力和非效力組的mRNA表達(dá)范圍）。
[0326] 如表19中顯示的，選擇的生物標(biāo)志物和參照標(biāo)志物可W實(shí)現(xiàn)抗c-Met抗體的效力 和非效力組的高度準(zhǔn)確測定，準(zhǔn)確性為至少約60%，例如至少約80%。
[0327] 應(yīng)當(dāng)理解，應(yīng)當(dāng)僅W描述性意義而非為了限制目的考慮本文中描述的例示性實(shí)施 方案。每個實(shí)施方案內(nèi)的特征或方面的描述應(yīng)當(dāng)通常認(rèn)為可用于其它實(shí)施方案中的其它類 似的特征或方面。
[032引本文中引用的所有參考文獻(xiàn)，包括出版物，專利申請，和專利在此通過提及并入， 其程度就像每篇參考文獻(xiàn)單獨(dú)且明確指示為通過提及并入并且在本文中完整列出一樣。 [0329] 在描述本發(fā)明的背景中（尤其在所附權(quán)利要求書的背景中）使用術(shù)語"一個"和 "一種"及"所述/該"和"至少一個/種"及類似的指示物應(yīng)當(dāng)解釋為覆蓋單數(shù)和復(fù)數(shù)兩者， 除非本文中另有指示或上下文明顯矛盾。術(shù)語"至少一個/種"及伴隨的一批一個或多個 項（例如，"A和B中的至少一種"）的使用應(yīng)當(dāng)解釋為意指選自列出項的一項（A或B)或兩 種或更多種列出項的任何組合（A和B)，除非本文中另有指示或上下文明顯矛盾。術(shù)語"包 含"、"具有"、"包括"和"含有"應(yīng)當(dāng)解釋為開放式術(shù)語（即意味著"包括但不限于"），除非 另有記錄。本文中數(shù)值范圍的敘述僅意圖充當(dāng)單獨(dú)提及落入范圍內(nèi)的每個分開數(shù)值的簡寫 方法，除非本文中另有指示，并且每個分開數(shù)值就像其單獨(dú)在本文中敘述一樣并入說明書。 可任何合適的次序?qū)嵤┍疚闹忻枋龅乃蟹椒?，除非本文中另有指示或上下文另外?顯矛盾。本文中提供的任何和所有例子，或例示性語言（例如"諸如"）的使用僅意圖更好 闡明本發(fā)明，并且不對本發(fā)明的范圍造成限制，除非另有要求。說明書中的語言不應(yīng)解釋為 指示任何不要求保護(hù)的要素為本發(fā)明的實(shí)踐必需的。
[0330] 本文中描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，包括用于實(shí)施本發(fā)明的發(fā)明人已知的最佳 模式。那些優(yōu)選的實(shí)施方案的變型在閱讀前述描述后對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會變得顯而 易見。發(fā)明人預(yù)期熟練技術(shù)人員在適當(dāng)時采用此類變型，并且發(fā)明人意圖本發(fā)明W與本文 中的明確描述不同的方式實(shí)施。因而，本發(fā)明包括可適用法律容許的所附權(quán)利要求書中敘 述的主題的所有修改和等同方案。此外，本發(fā)明涵蓋其所有可能變型中的上文描述的要素 的任何組合，除非本文中另有指示或上下文另外明顯矛盾。
【主權(quán)項】
1. 用于檢測生物標(biāo)志物的分子或試劑在制備一種用于預(yù)測抗c-Met抗體或其抗原結(jié) 合片段的效力或?yàn)槭┯每筩-Met抗體或其抗原結(jié)合片段選擇受試者的組合物中的用途，其 中所述生物標(biāo)志物包含選自下組的至少一種：THSD7A，MET，RAB31，F(xiàn)AM126A，PHC1，CHML， ST8SIA4,和 CAV1。2. 權(quán)利要求1的用途，其中所述生物標(biāo)志物包含 THSD7A，或 THSD7A 和選自下組的至少一種的組合：MET，RAB31，F(xiàn)AM126A，PHC1，CHML，ST8SIA4,和 CAVlo3. 權(quán)利要求1的用途，其中所述生物標(biāo)志物包含 MET ;或 MET 和選自下組的至少一種的組合：THSD7A，RAB31，F(xiàn)AM126A，PHC1，CHML，ST8SIA4,和 CAVlo4. 權(quán)利要求1的用途，其中所述生物標(biāo)志物包含： RAB31 ;或 RAB31 和選自下組的至少一種的組合：THSD7A，MET，F(xiàn)AM126A，PHC1，CHML，ST8SIA4,和 CAVlo5. 權(quán)利要求1的用途，其中所述生物標(biāo)志物包含： FAM126A ;或 FAM126A 和選自下組的至少一種的組合：THSD7A，MET，RAB31，PHC1，CHML，ST8SIA4,和 CAVlo6. 權(quán)利要求1的用途，其中所述生物標(biāo)志物包含選自下組的至少兩種：THSD7A，MET， RAB31和 FAM126A。7. 權(quán)利要求1至6中任一項的用途，其特征在于確定所述抗c-Met抗體或其抗原結(jié)合 片段在如下情況時會有效或所述受試者適合應(yīng)用所述抗c-Met抗體或其抗原結(jié)合片段： 在〇4￥1，？4111264，]\^1'，狀831，5了85從4，和/或1'批074的情況中，所述生物標(biāo)志物在來 自所述受試者的生物學(xué)樣品中的水平高于所述參照標(biāo)志物或參照樣品的水平；或 在CMHL和/或PHCl的情況中，所述生物標(biāo)志物在來自所述受試者的生物學(xué)樣品中的 水平低于所述參照標(biāo)志物或參照樣品的水平， 其中所述參照標(biāo)志物是選自下組的至少一種：EEF1A1，RPL23A，TPT1，HUWE1，MATR3， SRSF3, HNRNPC，SMARCA4, WDR90,和TUT1，且所述參照樣品是其中所述抗c-Met抗體或其抗 原結(jié)合片段沒有效力的樣品。8. 權(quán)利要求1至6中任一項的用途，其中所述抗c-Met抗體或其抗原結(jié)合片段特異性 結(jié)合具有選自SEQ ID NO:71的氨基酸序列且包含SEQ ID NO:73的5至19個連續(xù)氨基酸 的表位。9. 權(quán)利要求8的用途，其中所述抗c-Met抗體或其抗原結(jié)合片段包含： 至少一種選自下組的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)（⑶R) :(a)⑶R-H1，其包含SEQ ID N0:4;(b) CDR-H2,其包含SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 2,或包含SEQ ID NO: 2的8-19個連續(xù)氨基酸且 包含SEQ ID NO: 2的第3至第10位的氨基酸序列；和（c) CDR-H3,其包含SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 85,或包含SEQ ID NO: 85的6-13個連續(xù)氨基酸且包含SEQ ID NO: 85的第1至第6 位的氨基酸序列； 至少一種選自下組的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)：（a)CDR-Ll，其包含SEQ ID N0:7,（b)CDR-L2,其 包含 SEQ ID NO: 8,和（c) CDR-L3,其包含 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 86,或包 含SEQ ID N0:89的9-17個連續(xù)氨基酸且包含SEQ ID N0:89的第1至第9位的氨基酸序 列；或 其組合。10.權(quán)利要求1至6中任一項的用途，其中所述用于檢測生物標(biāo)志物或參照標(biāo)志物的分 子或試劑包含選自SEQ ID NO: 109-259的至少一種探針，選自SEQ ID NO:270-285的至少 一對引物，或其組合。 11?選自 EEFlAl、RPL23A、TPTl、HUWEl、MATR3、SRSF3、HNRNPC、SMARCA4、WDR90 和 TUTl 的至少一種作為參照標(biāo)志物用于測定靶基因的表達(dá)水平的用途。
【專利摘要】提供了預(yù)測抗c-Met抗體的效果和/或?yàn)榭筩-Met抗體應(yīng)用選擇受試者的方法，其包括測量生物學(xué)樣品中生物標(biāo)志物的水平。KCLRF-BP-0022020091006
【IPC分類】G01N33/68, G01N33/577
【公開號】CN104977416
【申請?zhí)枴緾N201510156233
【發(fā)明人】鄭鐘石, 安兌臻, 孫大淳, 李恩真
【申請人】三星電子株式會社
【公開日】2015年10月14日
【申請日】2015年4月3日
【公告號】EP2937421A2, US20150284808