檢測(cè)四環(huán)素類藥物的膠體金免疫層析試紙條及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及水產(chǎn)品檢測(cè)的技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測(cè)四環(huán)素類藥物的膠體金免疫層析試紙條及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]我國(guó)是一個(gè)海洋與淡水資源比較豐富的國(guó)家，水產(chǎn)品也就自然而然的成為我國(guó)居民日常生活中不可缺少的食物。由于我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，我國(guó)的水產(chǎn)品對(duì)外貿(mào)易額也逐年增加。然而，最近幾年，我國(guó)水產(chǎn)品的年均出口增長(zhǎng)率卻表現(xiàn)為忽高忽低。在2002年，歐盟更是禁止進(jìn)口我國(guó)的動(dòng)物源性食品，使我國(guó)遭受了近I億元人民幣的經(jīng)濟(jì)損失，宄其原因，主要是藥物殘留超標(biāo)。
[0003]近年來，隨著各方面技術(shù)的發(fā)展，越來越多的藥物被應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖，嚴(yán)重威脅著消費(fèi)者的身體健康，也限制著我國(guó)在水產(chǎn)品等方面的出口貿(mào)易，建立健全并提高相關(guān)方面的檢測(cè)手段與方法就顯得格外重要。在被廣泛應(yīng)用在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面的各類藥物中，抗生素的使用量就超過了總量的一半。在我國(guó)，四環(huán)素類藥物的使用量占抗生素總使用量的57%。同時(shí)，一些發(fā)達(dá)國(guó)家四環(huán)素類藥物的使用一樣比較普遍。例如美國(guó)，所有獸藥的使用總量中有一半就是四環(huán)素類藥物。四環(huán)素類藥物能被普遍使用主要由于它自身具有廣譜高效的殺菌功效、價(jià)格便宜，并且既能夠用來預(yù)防和治療水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中動(dòng)物所患疾病，又能作為促進(jìn)養(yǎng)殖動(dòng)物生長(zhǎng)的飼料添加劑。然而，使用者在使用該類藥物時(shí)，又存在著大量使用該類藥物、長(zhǎng)時(shí)間使用該類藥物等一系列濫用現(xiàn)象，造成了嚴(yán)重的藥物殘留。
[0004]現(xiàn)階段，國(guó)內(nèi)外主要利用高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、微生物法、酶聯(lián)免疫法、電化學(xué)分析法等來對(duì)四環(huán)素類藥物等進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。高效液相色譜法具有較強(qiáng)的自動(dòng)化程度程度、精確度也相對(duì)較高，但也存在著儀器價(jià)格高昂、前處理過程復(fù)雜、專業(yè)性要求高等不利于廣泛使用的缺點(diǎn)；毛細(xì)管電泳法操作簡(jiǎn)便、分析速度快但實(shí)驗(yàn)過程中所使用的儀器設(shè)備和試劑藥品較多，對(duì)環(huán)境要求也較高，不適用于現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試等；微生物法對(duì)樣品本身的要求不高但卻存在著特異性差、易受其它藥物影響的缺點(diǎn)；酶聯(lián)免疫法一次性可以處理多個(gè)樣品、特異性強(qiáng)、靈敏度高但對(duì)操作者本身的專業(yè)性要求較高，不適于普及使用；化學(xué)發(fā)光法的檢測(cè)靈敏度高、容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化但卻存在著對(duì)環(huán)境要求高的缺點(diǎn)，不適于現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試。針對(duì)目前各類方法的缺點(diǎn)，急需一種能夠快速準(zhǔn)確適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)并對(duì)環(huán)境和操作者本身要求較低的四環(huán)素類藥物殘留的檢測(cè)方法。
[0005]有鑒于此，本發(fā)明人研宄和設(shè)計(jì)了一種檢測(cè)四環(huán)素類藥物的膠體金免疫層析試紙條及其制備方法，本案由此產(chǎn)生。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)快速、準(zhǔn)確并適合現(xiàn)場(chǎng)使用的專門檢測(cè)四環(huán)素類藥物的膠體金免疫層析試紙條及其制備方法，填補(bǔ)目前尚未有水產(chǎn)品中四環(huán)素類藥物的膠體金免疫層析試紙條的空白。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明解決其技術(shù)問題的技術(shù)方案是:
一種檢測(cè)四環(huán)素類藥物的膠體金免疫層析試紙條及其制備方法，包括樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素包被膜、吸水墊及PVC底板，所述樣品墊、所述結(jié)合墊、所述硝酸纖維素包被膜及所述吸水墊依次搭接在所述PVC底板上，所述結(jié)合墊包被設(shè)有四環(huán)素類單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物；所述硝酸纖維素包被膜上設(shè)有檢測(cè)線和質(zhì)控線，所述檢測(cè)線包被有四環(huán)素類藥物抗原，所述質(zhì)控線包被有羊抗鼠IgG。
[0008]一種檢測(cè)四環(huán)素類藥物的膠體金免疫層析試紙條及其制備方法的制備方法，包括以下步驟:
步驟一、膠體金的制備:取I個(gè)250 mL燒杯，加入100 mL 0.01%氯金酸溶液，于恒溫磁力攪拌器上使用溫度檔400 °C對(duì)其進(jìn)行加熱，加熱至沸騰狀態(tài)后，沸騰時(shí)的實(shí)際溫度為100 °C，保持沸騰30 s后，將溫度檔變?yōu)?00 °C，同時(shí)轉(zhuǎn)速檔調(diào)至200 r/min，向燒杯中快速加入500 μ? 4%檸檬酸三鈉溶液，燒杯中的溶液變?yōu)榧t色后再加熱10 min，即制得膠體金;
步驟二、金標(biāo)抗體的制備及純化:取調(diào)好PH為7.9的所述膠體金I mL于1.5 mL離心管中，向離心管中加入9.6 Pg/ml，稀釋倍數(shù)為6的四環(huán)素類單克隆抗體，用渦旋儀渦旋2 min后靜置30 min;向離心管中加入100 μ? 10% BSA溶液，用渦旋儀渦旋2 min，靜置30 min,制得金標(biāo)抗體，即四環(huán)素類單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物；
同時(shí)，將制得的金標(biāo)抗體溶液于4 0C 2500 r/min，離心20 min，去除下層沉淀，將上清液轉(zhuǎn)到另一離心管中，于4 0C 12000 r/min，離心30 min，去除上清液，將沉淀用膠體金稀釋溶液稀釋至原體積的1/10，于4 ^保存?zhèn)溆茫?br> 步驟三、試紙條的組裝:(I)將硝酸纖維素包被膜，即NC膜，和吸水墊分別貼于PVC底板上，吸水墊壓住NC膜上方1-2 mm ; (2)將粘貼好NC膜和吸水墊的PVC底板在切條機(jī)上切割成4 _寬的試紙條；(3)將樣品墊和結(jié)合墊切成4 mm寬的條，同時(shí)將結(jié)合墊浸泡金標(biāo)抗體溶液中，并于37°C烘干，制得金標(biāo)墊；(4)烘干后的金標(biāo)墊剪成I cm長(zhǎng)的小塊并貼于PVC底板上，金標(biāo)墊壓住NC膜下方1-2 mm，同時(shí)用樣品墊壓住金標(biāo)墊下方1-2 mm，根據(jù)試紙條長(zhǎng)度修剪樣品墊；(5)在結(jié)合墊和吸收墊之間的NC膜上依次包被四環(huán)素類藥物抗原和羊抗鼠IgG，分別作為檢測(cè)線和控制線，其中，四環(huán)素類藥物抗原包被濃度為1.0 mg/mL ;羊抗鼠IgG包被濃度為0.75 mg/mL。
[0009]作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，在所述步驟三(3)中，還包括對(duì)樣品墊和金標(biāo)墊進(jìn)行前處理的步驟，即將樣品墊與金標(biāo)結(jié)合墊用切條機(jī)分別切成4 mm寬的長(zhǎng)條，用含有5%的蔗糖、5% BSA和終體積濃度為0.1%的pH為7.9的0.01 mo I/L的PBS溶液進(jìn)行浸泡，浸泡后將溶液瀝干，在37 °C條件下烘干12 h備用。
[0010]作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，還包括步驟一之前對(duì)試驗(yàn)所用容器的清洗:首先將試驗(yàn)所用容器在重鉻酸鉀洗液中浸泡24 h，取出后用自來水進(jìn)行若干次清洗，再用超純水清洗3次；將清洗干凈的容器于二氯甲硅烷含量為5%的氯仿中浸泡I min后進(jìn)行硅化處理；將經(jīng)過硅化處理過的容器放置于室溫條件下干燥，待干燥完成后用超純水清洗干凈并于烘箱中37 °C進(jìn)行干燥處理，備用。
[0011]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有下列優(yōu)點(diǎn):
1、本發(fā)明的檢測(cè)水產(chǎn)品中四環(huán)素類藥物的膠體金免疫層析試紙條，具有特異性強(qiáng)，靈敏度高，檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)；
2、本發(fā)明的檢測(cè)試紙條不需要任何特殊儀器、設(shè)備，可現(xiàn)場(chǎng)操作，檢測(cè)成本低；
3、本發(fā)明的檢測(cè)試紙條操作簡(jiǎn)便，不需要專業(yè)人員操作；
4、本發(fā)明對(duì)樣品墊與金標(biāo)墊進(jìn)行了前處理，使得樣品墊與金標(biāo)墊具有優(yōu)異的吸水能力及釋放能力，進(jìn)而大大提尚了檢測(cè)能力；
5、本發(fā)明對(duì)試驗(yàn)所用容器都進(jìn)行清洗，最終增強(qiáng)了金標(biāo)抗體的穩(wěn)定性。
[0012]說明書附圖
圖1為本發(fā)明膠體金免疫層析試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖；
圖2為本發(fā)明實(shí)施例3性能檢測(cè)的靈敏度測(cè)試結(jié)果圖；
圖3為本發(fā)明實(shí)施例3性能檢測(cè)的特異性測(cè)試結(jié)果圖；其中，從左至右分別為四環(huán)素、金霉素、土霉素、青霉素、氯霉素、鏈霉素測(cè)試；
圖4為本發(fā)明實(shí)施例3性能檢測(cè)的穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果圖；其中，I號(hào)為在常溫下保存，2號(hào)為在37°C條件下保存；
圖5為本發(fā)明實(shí)施例3性能檢測(cè)的重復(fù)性測(cè)試結(jié)果圖；
圖6為本發(fā)明實(shí)施例4樣本測(cè)試的試紙條測(cè)試結(jié)果圖；其中，圖中從左至右分別為原樣、2倍稀釋、4倍稀釋、8倍稀釋、16倍稀釋。
【具體實(shí)施方式】
[0013]實(shí)施例1
如圖1所示，本發(fā)明揭示了一種檢測(cè)四環(huán)素類藥物的膠體金免疫層析試紙條及其制備方法，包括樣品墊1、結(jié)合墊2、硝酸纖維素包被膜3、吸水墊4及PVC底板5，所述樣品墊1、所述結(jié)合墊2、所述硝酸纖維素包被膜3及所述吸水墊4依次搭接在所述PVC底板5上:所述結(jié)合墊2包被設(shè)有四環(huán)素類單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物；所述硝酸纖維素包被膜3上設(shè)有檢測(cè)線31和質(zhì)控線32，所述檢測(cè)線31包被有四環(huán)素類藥物抗原，所述質(zhì)控線32包被有羊抗鼠IgG。
[0014]實(shí)施例2
一種檢測(cè)四環(huán)素類藥物的膠體金免疫層析試紙條及其制備方法的制備方法，包括以下步驟:
步驟一、膠體金的制備:取I個(gè)250 mL燒杯，加入100 mL 0.01%氯金酸溶液，于恒溫磁力攪拌器上使用溫度檔400 °C對(duì)其進(jìn)行加熱，加熱至沸騰狀態(tài)后，沸騰時(shí)的實(shí)際溫度為100 °C，保持沸騰30 s后，將溫度檔變?yōu)?00 °C，同時(shí)轉(zhuǎn)速檔調(diào)至200 r/min，向燒杯中快速加入500 μ? 4%檸檬酸三鈉溶液，燒杯中的溶液變?yōu)榧t色后再加熱10 min，即制得膠體金;
步驟二、金標(biāo)抗體的制備及純化:取調(diào)好PH為7.9的所述膠體金I mL于1.5 mL離心管中，向離心管中加入9.6 Pg/ml，稀釋倍數(shù)為6的四環(huán)素類單克隆抗體，用渦旋儀渦旋2 min后靜置30 min;向離心管中加入100 μ? 10% BSA溶液，用渦旋儀渦旋2 min，靜置30 min,制得金標(biāo)抗體，即四環(huán)素類單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物；
同時(shí)，將制得的金標(biāo)抗體溶液于4 0C 2500 r/min，離心20 min，去除下層沉淀，將上清液轉(zhuǎn)到另一離心管中，于4 0C 12000 r/min，離心30 min，去除上清液，將沉淀用膠體金稀釋溶液稀釋至原體積的1/10，于4 ^保存?zhèn)溆茫?br> 步驟三、試紙條的組裝:(I)將硝酸纖維素包被膜，即NC膜，和吸水墊分別貼于PVC底板上，吸水墊壓住NC膜上方1-2 mm ; (2)將粘貼好NC膜和吸水墊的PVC底板在切條機(jī)上切割成4 _寬的試紙條；(3)將樣品墊和結(jié)合墊切成4 mm寬的條，同時(shí)將結(jié)合墊浸泡金標(biāo)抗體溶液中，并于37°C烘干，制得金標(biāo)墊；(4)烘干后的金標(biāo)墊剪成I cm長(zhǎng)的小塊并貼于PVC底板上，金標(biāo)墊壓住NC膜下方1-2 mm，同時(shí)用樣品墊壓住金標(biāo)墊下方1-2 mm，根據(jù)試紙條長(zhǎng)度修剪樣品墊；(5)在結(jié)合墊和吸收墊之間的NC膜上依次包被四環(huán)素類藥物抗原和羊抗鼠IgG，分別作為檢測(cè)線和控制線，其中，四環(huán)素類藥物抗原包被濃度為1.0 mg/mL ;羊抗鼠IgG包被濃度為0.75 mg/mL。
[0015]作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，在所述步驟三(3)中，還包括對(duì)樣品墊和金標(biāo)墊進(jìn)行前處理的步驟，即將樣品墊與金標(biāo)結(jié)合墊用切條機(jī)分別切成4 mm寬的長(zhǎng)條，用含有5%的蔗糖、5% BSA和終體積濃度為0.1%的pH為7.9的0.01 mo I/L的PBS溶液進(jìn)行浸泡，浸泡后將溶液瀝干，在37 °C條件下烘干12 h備用。
[0016]作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，還包括步驟一之前對(duì)試驗(yàn)所用容器的清洗:首先將試驗(yàn)所用容器在重鉻酸鉀洗液中浸泡24 h，取出后用自來水進(jìn)行若干次清洗，再用超純水清洗