3次；將清洗干凈的容器于二氯甲硅烷含量為5%的氯仿中浸泡I min后進(jìn)行硅化處理；將經(jīng)過(guò)硅化處理過(guò)的容器放置于室溫條件下干燥，待干燥完成后用超純水清洗干凈并于烘箱中37°C進(jìn)行干燥處理，備用。在本試驗(yàn)中所用到的容器干凈與否，最終獲得的膠體金溶液的質(zhì)量有著很大的差別。假如容器存在雜質(zhì)或灰塵，那么它們就能夠在一定程度上影響金顆粒的形成，最終影響膠體金溶液中顆粒的均一性，同時(shí)也會(huì)造成后續(xù)試驗(yàn)中獲得的金標(biāo)抗體的穩(wěn)定性變差，所以容器使用前需經(jīng)過(guò)上述一系列處理。
[0017]實(shí)施例3 性能檢測(cè)
3.1靈敏度測(cè)試
[0018]用pH為7.9的0.01mol/L的PBS溶液將四環(huán)素、金霉素、土霉素的標(biāo)準(zhǔn)品配制為100 Pg/kg、50 Pg/kg、25 Pg/kg、15 Kg/kg等不同的濃度梯度，然后用已經(jīng)組裝好的四環(huán)素類(lèi)藥物膠體金免疫層析試紙條進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示。
[0019]由圖2可知，四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品的含量是15 Pg/L的情況下，通過(guò)肉眼觀察，試紙條的T線(xiàn)處有一條淡淡的紅色，而當(dāng)四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品的含量是20 μ§/1的情況下，試紙條顯一條線(xiàn)(質(zhì)控線(xiàn))，所以試紙條對(duì)于四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)下限是20 Pg/L ;金霉素標(biāo)準(zhǔn)品的含量是15Kg/L的情況下，通過(guò)肉眼觀察，試紙條T線(xiàn)處也有一條淡淡的紅色，比進(jìn)行四環(huán)素檢測(cè)時(shí)要深，而當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為20 μ§/1時(shí)，試紙條顯一條線(xiàn)，所以試紙條對(duì)于金霉素的檢測(cè)靈敏度為20 Pg/L;土霉素標(biāo)準(zhǔn)品的含量是15、20 Pg/L的情況下，通過(guò)肉眼觀察，試紙條顯兩條線(xiàn)，而當(dāng)土霉素標(biāo)準(zhǔn)品的含量是25 Pg/L的情況下，試紙條顯一條線(xiàn)，所以本試驗(yàn)制得的試紙條對(duì)于土霉素的測(cè)定下限是25 Pg/L。
3.2特異性測(cè)試
[0020]用結(jié)構(gòu)與四環(huán)素類(lèi)藥物相類(lèi)似的青霉素、氯霉素、鏈霉素等對(duì)試紙條的特異性進(jìn)行測(cè)試。用pH為7.9的0.01 mol/L的PBS溶液將各標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至不同的濃度梯度，陰性用PBS溶液測(cè)試，用同一批試紙條進(jìn)行測(cè)試，觀察結(jié)果，結(jié)果如圖3所示。
[0021]由圖3可知，試紙條在四環(huán)素濃度大于20 Pg/L、金霉素濃度大于15 Pg/L、土霉素濃度大于25 Pg/L時(shí)均顯陽(yáng)性。而當(dāng)類(lèi)似物濃度小于200 Pg/L時(shí)，四環(huán)素類(lèi)藥物膠體金免疫層析試紙條對(duì)于青霉素、氯霉素、鏈霉素等類(lèi)似物均無(wú)明顯的交叉反應(yīng)，證明制得的試紙條的特異性較好。
3.3穩(wěn)定性測(cè)試
[0022]將組裝好的試紙條放置于不同的塑料袋中(內(nèi)置干燥劑)，封口密閉分別于室溫及37°C條件下進(jìn)行保存，放置15 d后，選用不同放置條件下保存的試紙條用標(biāo)準(zhǔn)品和陰性樣品進(jìn)行測(cè)試，驗(yàn)證四環(huán)素類(lèi)藥物膠體金免疫層析試紙條的穩(wěn)定性，結(jié)果如圖4所示。
[0023]試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在常溫條件下保存15 d，試紙條檢測(cè)線(xiàn)與質(zhì)控線(xiàn)的顏色沒(méi)有太大變化。從圖4可以看出，在37 °C條件下保存的試紙條，測(cè)試時(shí)檢測(cè)線(xiàn)與質(zhì)控線(xiàn)的顏色比在常溫條件下存放的要深。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因主要是由于在37 °C條件下保存的試紙條中的抗原抗體在一定時(shí)間段內(nèi)保持著較高的免疫活性并由于溫度的提高獲得了更多的活化能使抗原與抗體的特異性反應(yīng)更容易進(jìn)行。
3.4重復(fù)性測(cè)試
[0024]用同一批次的試紙條檢測(cè)不同批次的樣品；再用不同批次的試紙條對(duì)同一批次的樣品進(jìn)行檢測(cè)，觀察結(jié)果，結(jié)果如圖5所示。
[0025]從圖5中可以看出，同一批次內(nèi)進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)的8條試紙條，2條用于檢測(cè)陰性樣品(包括小于試紙條檢測(cè)限的陽(yáng)性樣品)，試紙條均顯示兩條線(xiàn)，為陰性；6條用于測(cè)定陽(yáng)性樣品，試紙條都只有一條線(xiàn)顯色(只顯示質(zhì)控線(xiàn))，為陽(yáng)性。證明同一批次內(nèi)，試紙條的重復(fù)性較好。
[0026]同時(shí)，采用3批次共計(jì)12條試紙條(每一批次4條)檢測(cè)已知濃度樣品，最終三批的測(cè)定結(jié)果一致，證明不同批次的試紙條的重復(fù)性較好。
[0027]實(shí)施例4樣品測(cè)試
樣品處理:用天平10 g左右已經(jīng)切碎的蝦肉組織樣本，用均質(zhì)機(jī)對(duì)該組織樣本進(jìn)行均質(zhì)，均質(zhì)完成用電子天平取得I g左右，將其放入5 mL離心管中；用移液槍向其中加入2 mLpH為4.0的Mclvaine-EDTA溶液，用漩渦儀渦旋3分鐘后，溫度低于15°C的情況下，用離心機(jī)在4000 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 min ;用移液槍取ImL上述離心后的上清液加入5 mL離心管中，向其中加入0.1 mL 4 mol/L的NaOH溶液，用漩渦儀渦旋2 min，然后向其中加入2 mL正己烷，用漩渦儀渦旋2 min，靜置等其分層后將下層溶液移出等待檢測(cè)。
4.1試紙條測(cè)試
[0028]選取市場(chǎng)上出售的對(duì)蝦作為試驗(yàn)對(duì)象，稱(chēng)取2份10 g左右的該蝦肉組織，標(biāo)號(hào)1、2，兩份樣品作為平行試驗(yàn)，兩份樣品均按照如前所述的樣品處理方法進(jìn)行處理，取提取液用制備的試紙條進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖6所示。
[0029]從圖6可以看出，經(jīng)過(guò)提取得到的樣品原液經(jīng)檢測(cè)顯示為陽(yáng)性，而該試紙條的靈敏度為混標(biāo)時(shí)為10 μ§/1 (即三類(lèi)藥物的含量均為10 Pg/L)，可以初步判定本試驗(yàn)中所使用的蝦肉中的四環(huán)素類(lèi)藥物含量60 Pg/kg以上。為進(jìn)一步確定該樣品中四環(huán)素類(lèi)藥物的含量，對(duì)該樣品原液進(jìn)行了 2倍、4倍、8倍、16倍稀釋?zhuān)瑥膱D6中可以看出當(dāng)稀釋倍數(shù)為16倍時(shí)會(huì)出現(xiàn)明顯的兩條線(xiàn)即此時(shí)的檢測(cè)結(jié)果為陰性。綜上，初步判定該蝦肉的四環(huán)素類(lèi)藥物含量在480?960 Pg/kg附近。
4.2液質(zhì)聯(lián)用測(cè)試
[0030]按照GB/T 21317-2007動(dòng)物源性食品中四環(huán)素類(lèi)獸藥殘留檢測(cè)方法中液質(zhì)聯(lián)用的前處理方法進(jìn)行處理，上機(jī)時(shí)色譜柱采用Inertsil C8-3，流動(dòng)相采用色譜純的甲醇及
0.2%的甲酸溶液，流速為300 PL/min，柱溫為30 °C，進(jìn)樣量為30 μ?。
[0031]本試驗(yàn)利用液質(zhì)聯(lián)用對(duì)蝦肉中的四環(huán)素類(lèi)藥物殘留進(jìn)行測(cè)試時(shí)，取樣量為I g，提取液使用量是15 mL，加標(biāo)量是混標(biāo)500 Pg/kg，樣品及加標(biāo)試驗(yàn)中的提取液均稀釋4倍，最后定容至2 mL。經(jīng)測(cè)試得知，上機(jī)所用試樣中的含量為38.53 Pg/kg，加標(biāo)回收率為72.1%，經(jīng)過(guò)計(jì)算最終得出樣品中的四環(huán)素類(lèi)藥物的含量為641.3 Pg/kg，與試紙條法測(cè)得的結(jié)果一致。
[0032]本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種檢測(cè)四環(huán)素類(lèi)藥物的膠體金免疫層析試紙條及其制備方法，包括樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素包被膜、吸水墊及PVC底板，所述樣品墊、所述結(jié)合墊、所述硝酸纖維素包被膜及所述吸水墊依次搭接在所述PVC底板上，其特征在于:所述結(jié)合墊包被設(shè)有四環(huán)素類(lèi)單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物；所述硝酸纖維素包被膜上設(shè)有檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)，所述檢測(cè)線(xiàn)包被有四環(huán)素類(lèi)藥物抗原，所述質(zhì)控線(xiàn)包被有羊抗鼠IgG。2.一種檢測(cè)四環(huán)素類(lèi)藥物的膠體金免疫層析試紙條及其制備方法的制備方法，其特征在于:包括以下步驟: 步驟一、膠體金的制備:取I個(gè)250 mL燒杯，加入100 mL 0.01%氯金酸溶液，于恒溫磁力攪拌器上使用溫度檔400 °C對(duì)其進(jìn)行加熱，加熱至沸騰狀態(tài)后，沸騰時(shí)的實(shí)際溫度為100 °C，保持沸騰30 s后，將溫度檔變?yōu)?00 °C，同時(shí)轉(zhuǎn)速檔調(diào)至200 r/min，向燒杯中快速加入500 μ? 4%檸檬酸三鈉溶液，燒杯中的溶液變?yōu)榧t色后再加熱10 min，即制得膠體金; 步驟二、金標(biāo)抗體的制備及純化:取調(diào)好PH為7.9的所述膠體金I mL于1.5 mL離心管中，向離心管中加入9.6 Pg/ml，稀釋倍數(shù)為6的四環(huán)素類(lèi)單克隆抗體，用渦旋儀渦旋2 min后靜置30 min;向離心管中加入100 μ? 10% BSA溶液，用渦旋儀渦旋2 min，靜置30 min,制得金標(biāo)抗體，即四環(huán)素類(lèi)單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物； 同時(shí)，將制得的金標(biāo)抗體溶液于4 0C 2500 r/min，離心20 min，去除下層沉淀，將上清液轉(zhuǎn)到另一離心管中，于4 0C 12000 r/min，離心30 min，去除上清液，將沉淀用膠體金稀釋溶液稀釋至原體積的1/10，于4 ^保存?zhèn)溆茫? 步驟三、試紙條的組裝:(I)將硝酸纖維素包被膜，即NC膜，和吸水墊分別貼于PVC底板上，吸水墊壓住NC膜上方1-2 mm ; (2)將粘貼好NC膜和吸水墊的PVC底板在切條機(jī)上切割成4 _寬的試紙條；(3)將樣品墊和結(jié)合墊切成4 mm寬的條，同時(shí)將結(jié)合墊浸泡金標(biāo)抗體溶液中，并于37°C烘干，制得金標(biāo)墊；(4)烘干后的金標(biāo)墊剪成I cm長(zhǎng)的小塊并貼于PVC底板上，金標(biāo)墊壓住NC膜下方1-2 mm，同時(shí)用樣品墊壓住金標(biāo)墊下方1-2 mm，根據(jù)試紙條長(zhǎng)度修剪樣品墊；(5)在結(jié)合墊和吸收墊之間的NC膜上依次包被四環(huán)素類(lèi)藥物抗原和羊抗鼠IgG，分別作為檢測(cè)線(xiàn)和控制線(xiàn)，其中，四環(huán)素類(lèi)藥物抗原包被濃度為1.0 mg/mL ;羊抗鼠IgG包被濃度為0.75 mg/mL。3.如權(quán)利要求2所述的一種檢測(cè)四環(huán)素類(lèi)藥物的膠體金免疫層析試紙條及其制備方法的制備方法，其特征在于:在所述步驟三(3)中，還包括對(duì)樣品墊和金標(biāo)墊進(jìn)行前處理的步驟，即將樣品墊與金標(biāo)結(jié)合墊用切條機(jī)分別切成4 mm寬的長(zhǎng)條，用含有5%的蔗糖、5%BSA和終體積濃度為0.1%的pH為7.9的0.01 mo I/L的PBS溶液進(jìn)行浸泡，浸泡后將溶液瀝干，在37 °C條件下烘干12 h備用。4.如權(quán)利要求2所述的一種檢測(cè)四環(huán)素類(lèi)藥物的膠體金免疫層析試紙條及其制備方法的制備方法，其特征在于:還包括步驟一之前對(duì)試驗(yàn)所用容器的清洗:首先將試驗(yàn)所用容器在重鉻酸鉀洗液中浸泡24 h，取出后用自來(lái)水進(jìn)行若干次清洗，再用超純水清洗3次；將清洗干凈的容器于二氯甲硅烷含量為5%的氯仿中浸泡I min后進(jìn)行硅化處理；將經(jīng)過(guò)硅化處理過(guò)的容器放置于室溫條件下干燥，待干燥完成后用超純水清洗干凈并于烘箱中37°C進(jìn)行干燥處理，備用。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)四環(huán)素類(lèi)藥物的膠體金免疫層析試紙條及其制備方法，包括樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素包被膜、吸水墊及PVC底板，所述樣品墊、所述結(jié)合墊、所述硝酸纖維素包被膜及所述吸水墊依次搭接在所述PVC底板上，所述結(jié)合墊包被設(shè)有四環(huán)素類(lèi)單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物；所述硝酸纖維素包被膜上設(shè)有檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)，所述檢測(cè)線(xiàn)包被有四環(huán)素類(lèi)藥物抗原，所述質(zhì)控線(xiàn)包被有羊抗鼠IgG；本發(fā)明同時(shí)公開(kāi)了上述膠體金免疫層析試紙條的制備方法，包括膠體金的制備、金標(biāo)抗體的制備及純化及試紙條的組裝步驟。本發(fā)明的膠體金免疫層析試紙條具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)快速、準(zhǔn)確并適合現(xiàn)場(chǎng)使用的特點(diǎn)。
【IPC分類(lèi)】G01N33/558
【公開(kāi)號(hào)】CN104977407
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510257683
【發(fā)明人】蘇國(guó)成, 蘇文金, 周常義, 李健, 郭然
【申請(qǐng)人】集美大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年10月14日
【申請(qǐng)日】2015年5月20日