循環(huán)血miR-34a作為輻射生物標(biāo)志物在輻射監(jiān)控中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及福射監(jiān)控技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及循環(huán)血miR-34a作為福射生物標(biāo)志物在 福射監(jiān)控中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，福射的監(jiān)控通常都使用物理劑量計(jì)，但在有些情況下，單純使用物理劑量計(jì) 進(jìn)行監(jiān)測難W全面準(zhǔn)確地反映福射對每個(gè)個(gè)體的影響。如動(dòng)物福照實(shí)驗(yàn)研究中，為了減少 操作人員接觸福射環(huán)境的機(jī)會(huì)，同時(shí)提高照射效率，通常都會(huì)使用動(dòng)物自動(dòng)傳輸裝置。有時(shí) 傳輸?shù)膭?dòng)物會(huì)偏離照射中屯、，發(fā)生非均勻照射甚至是脫祀照射的情況，如果采用動(dòng)物自身 攜帶的生物分子來確認(rèn)是否受到照射，不僅可W減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的廢棄，而且可W增加實(shí)驗(yàn) 研究結(jié)果的可靠性。此外，在意外照射發(fā)生時(shí)，由于事件的突發(fā)性和不確定性，很難準(zhǔn)確評 估實(shí)際照射情況，此時(shí)，如果能采用方便、靈敏的福射生物標(biāo)志物來判斷每個(gè)個(gè)體是否受到 照射及福射損傷的程度，對于福射風(fēng)險(xiǎn)的準(zhǔn)確評估并及時(shí)采取適當(dāng)?shù)拇胧╋@得尤其重要。
[0003] 作為重要的遺傳物質(zhì)，DNA的損傷方式和損傷程度與福射的種類和劑量密切相關(guān)， 是比較理想的能反映個(gè)體受照射程度的生物標(biāo)志物。因此，淋己細(xì)胞染色體崎變、細(xì)胞微核 等方法都可W用于福射監(jiān)測。此外，劑量相關(guān)的循環(huán)系統(tǒng)中粒細(xì)胞和淋己細(xì)胞減少、福射敏 感蛋白如淀粉酶、C-反應(yīng)蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子等也可W作為福射生物標(biāo)志物。但是該些檢 測方法都有各自的不足之處，在及時(shí)性、便捷性、穩(wěn)定性和靈敏性上不夠理想，如淋己細(xì)胞 染色體崎變的觀察程序復(fù)雜、需要時(shí)間較長(一般為2化W上);粒細(xì)胞和淋己細(xì)胞容易受感 染、炎癥等因素的影響；福射敏感蛋白受轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，個(gè)體差異大、重復(fù)性不好。
[0004] microRNA(miRNA)是一類廣泛存在于生物體中、長度約18~25nt的非編碼小分 子RNA。它們通過與祀基因的信使RNA(mRNA)序列互補(bǔ)結(jié)合來實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，參與 生物體的生長、發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞調(diào)亡等一系列重要的生命過程。循環(huán)血中含有豐富的 miRNA,由于分子量小且常常包裹在囊泡里，循環(huán)血miRNA很難被RNA酶降解，耐反復(fù)凍融及 酸堿環(huán)境變化，保證了其能準(zhǔn)確反映原初表達(dá)水平的可能性。因此，無論在血液中還是在提 取及檢測的過程中，miRNA都能穩(wěn)定存在，從而保證了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，該些是淋己細(xì)胞、 福射敏感蛋白及其它核酸類分子所不能比擬的優(yōu)點(diǎn)。另外，miRNA在不同物種間具有高度 的保守性，W動(dòng)物模型得出的研究結(jié)果也適宜于人體的借鑒和參考。
[0005] 作為重要的基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控因子，miRNA積極響應(yīng)于外界環(huán)境的改變，在機(jī)體 受到外源福射時(shí)，其表達(dá)也會(huì)發(fā)生顯著改變。如化cob等人的研究（PL0S0肥，2013,8 (2): G57603)發(fā)現(xiàn)，小鼠循環(huán)血中的miR-150在受到X射線和丫射線全身照射后呈現(xiàn)出明顯的 降低趨勢，并隨劑量和時(shí)間的變化呈現(xiàn)出一定規(guī)律，該些結(jié)果為尋找可作為福射標(biāo)志物的 循環(huán)血miRNA提供了實(shí)驗(yàn)和理論支持。值得注意的是，他們選取的照射劑量偏大（l-8Gy)， 且僅限于常見的電磁福射，應(yīng)用于福射監(jiān)測在靈敏性和廣泛性上還有很大的局限。前期研 究表明，小鼠循環(huán)血中與福照相關(guān)的miRNA有一百多種，因而有望從該些福射敏感的miRNA 中獲得理想的新福射生物標(biāo)志物，并應(yīng)用于福射環(huán)境下每個(gè)個(gè)體受照射情況的監(jiān)控。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種循環(huán)血miR-34a作為福射生物標(biāo)志物在 福射監(jiān)控中的應(yīng)用。
[0007] 為解決上述問題，本發(fā)明所述的循環(huán)血miR-34a作為福射生物標(biāo)志物在福射監(jiān)控 中的應(yīng)用，其特征在于：該循環(huán)血miR-34a是指按常規(guī)方法從動(dòng)物或人的血清中提取獲得， 其用于非均勻照射或意外照射大于化的條件下判斷照射及福射對動(dòng)物或人的損傷程度。 [000引本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有W下優(yōu)點(diǎn)： 1、本發(fā)明W對福射比較敏感的血液系統(tǒng)為切入點(diǎn)，充分利用miRNA的生物學(xué)特點(diǎn)，通 過microRNAPCRArray等方法在循環(huán)血中逐步篩查福射相關(guān)的miRNA，最終獲得了理想 的新福射生物標(biāo)志物miR-34a。該福射生物標(biāo)志物在受到不同類型福射的照射后，循環(huán)血 miR-34a表達(dá)水平明顯上升，并且隨著照射劑量的增加呈現(xiàn)上升的趨勢，與淋己細(xì)胞染色體 崎變、粒細(xì)胞和淋己細(xì)胞減少、福射敏感蛋白等福射生物標(biāo)志物相比，在及時(shí)性、便捷性、穩(wěn) 定性和靈敏性上都更為優(yōu)越。
[0009] 采取的福射源為化xitronR650型X射線儀產(chǎn)生的X射線和蘭州重離子加速器冷 卻儲(chǔ)存環(huán)（HIRFkCSR)生物福照終端產(chǎn)生的碳離子束（1古6+)。
[0010] (1)福射相關(guān)miRNA的篩查；W能量為300MeV/u的碳離子束全身貫穿照射6~8周 的清潔級(jí)雄性昆明小鼠（蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供)，照射劑量為0.5Gy和2.0Gy，每個(gè)處理組 6只小鼠，并W未照射小鼠作為對照。照射后24小時(shí)取血，提取血清并分離、純化總RNA，用 miRCURYLNA?UniversalRTmicroRNAPCRArray(Exqion)巧片檢測 360 種血清miRNA 的表達(dá)變化水平，結(jié)果表明；福射處理后表達(dá)上升和下降的miRNA總共有一百多種，其中 0. 5Gy處理組表達(dá)變化超過2倍的miRNA有20多種，2. 0Gy處理組表達(dá)變化超過2倍的 miRNA有30多種。
[0011] 口)候選miRNA確定及其巧片測試：通過分析上一步的廣泛篩查結(jié)果，選擇了 20種可能成為福射生物標(biāo)志物的miRNA組成了一個(gè)集合，W該些miRNA為內(nèi)容定制PCR (PolymeraseQiainReaction,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）巧片。分別用X射線和lOOMeV/u碳離子 束全身注入照射，X射線的劑量為0. 5、2. 0和4.OGy，碳離子的劑量為0. 25和0. 5Gy(注； 碳離子束注入生物樣品時(shí)，引起的生物效應(yīng)比較高，因此選擇的照射劑量相對較低)。照射 后24小時(shí)取血，提取血清并分離、純化總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和miRNAPCRArray巧片檢測，結(jié) 果再次表明；多個(gè)miRNA的表達(dá)水平在照射前后都有顯著的上升或下降。
[0012] 樹可作為福射生物標(biāo)志物的miRNA確定；通過W下S個(gè)條件對該20種miRNA進(jìn)行 篩選；福照后變化倍數(shù)大于2且顯著性檢測中P值小于0. 05W保證miRNA變化水平具有顯 著性差異；PCR檢測中平均Ct值（PCR反應(yīng)中反應(yīng)管內(nèi)的巧光信號(hào)達(dá)到設(shè)定值時(shí)所經(jīng)歷的 循環(huán)數(shù)）小于32W保證miRNA在血清中豐度較高、容易檢測。經(jīng)過篩選之后，從X射線照 射組和碳離子照射組確定出6種可作為福射生物標(biāo)志物的miRNA,包括miR-34a、let-7a、 miR-223和已經(jīng)有報(bào)道的miR-150。
[0013] (4)循環(huán)血miRNA穩(wěn)定性檢測；對該6種可作為福射生物標(biāo)志物的循環(huán)血miRNA的 穩(wěn)定性作了進(jìn)一步考察。具體方法如下；選取鼠齡為6周，10周，16周的小鼠，在未經(jīng)任何 處理的條件下取血清，用巧光實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)方法檢測該6種miRNA的本底表達(dá) 水平，結(jié)果表明；所檢測的6種miRNA在不同年齡組別中變化很小，在小鼠血清中穩(wěn)定存在。
[0014] 腳循環(huán)血miR-34a對福射的響應(yīng)；循環(huán)血miR-34a表達(dá)水平在X射線和碳離子束 照射條件下都表現(xiàn)出明顯的上升趨勢；并且在0.5Gy的X射線和0.25Gy的碳離子束注入 照射條件下，miR-34a表達(dá)上升明顯，約為沒有受到照射時(shí)的2倍；并且隨著照射劑量的增 加，循環(huán)血miR-34a表達(dá)上升也呈現(xiàn)增加的趨勢。表明循環(huán)血miR-34a對福射的響應(yīng)非常 靈敏，完全符合作為福射生物標(biāo)志物的條件，具體的檢測數(shù)據(jù)結(jié)果見表1所示。
[0015] 表1.不同類型的福射處理后，循環(huán)血miR-34a表達(dá)水平均有提高
做將miR-34a的表達(dá)變化和已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道的miR-150的表達(dá)變化作了對比，如表2 所示。W2Gy劑量處理結(jié)果為例，miR-34a表達(dá)上升了 3