一種糖肽芯片及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及一種鑒別疾病的糖膚巧片。
【背景技術】
[0002] 糖巧片是研究糖組學W及糖結合蛋白（glycan-bindingprotein,GBP)與糖鏈 相互作用的最有效的高通量分析工具，其潛在的應用范圍非常廣泛，例如包括篩選GBP、抗 體特異性分析、細菌和病毒的粘附W及酶的特性分析等方面。糖巧片也能幫助研究者發(fā)展 新的診斷方法和監(jiān)測疾病狀態(tài)W及發(fā)展治療疾病的藥物。糖巧片正在變成一種標準的研究 方法用于大規(guī)模篩選糖和闡明糖在生物系統(tǒng)中所扮演的角色。例如糖巧片技術用于了禽流 感方面的研究，用于快速監(jiān)測當前冊N1禽流感亞型的爆發(fā)W及評估病毒變異對人類潛在 的威脅性。
[0003] 目前，所報道的糖巧片的制備方法有=種，第一種是W物理吸附的方法將糖鏈固 定到固相載體上；另一種是對糖鏈進一步化學修飾，然后再把經修飾的糖鏈共價偶聯(lián)到諸 如硝酸纖維素膜或玻片等固相載體上。該兩種方法存在如下缺點：如果用物理吸附的方法 來制備糖巧片，則固定在固相載體上的糖鏈在實驗過程中易脫落，影響結果的準確性；對糖 鏈進一步化學修飾(氨基化或琉基化）和純化，然后再把糖共價偶聯(lián)到諸如表面醒基或駿基 化的硝酸纖維素膜或玻片等固相載體上，該方法過程復雜，成本高，實用性差。第=種制備 糖巧片的方法是利用糖鏈的還原末端，W目虧基共價偶聯(lián)其到-0-NH2衍生化的玻片上或W糖 巧鍵的形式價偶聯(lián)其到哲基衍生化的玻片上，由于糖鏈的來源(分離或合成）困難，該些糖 巧片制備成本較高。
[0004]目前糖巧片制備的原料主要是糖鏈，技術設及糖鏈的固定化、糖結合蛋白的高通 量表達及糖巧片的檢測與分析等部分。對于哺乳動物而言，其體內的糖類主要由大約10 種常見的單糖單位組成，同時具有線性和分支結構，并且包含a和0兩種立體構型，該使 得糖鏈具有極高的潛在的復雜性。據(jù)計算，哺乳動物中可能的糖鏈類型可W達到大約1012 種，實際中發(fā)現(xiàn)的N連接的糖鏈已經超過2000種，并且該一數(shù)字目前還在不斷增加.由于 糖巧片要將糖鏈固定于載體上并作為檢測中特異性的"探針"，糖巧片的發(fā)展很大程度上依 賴于糖鏈，獲得大量的適合制備巧片需要的糖鏈是首要的問題。
[0005] 糖類的分離對于分析糖組中糖鏈的序列及其生理功能非常重要，然而自然來源的 糖類非常有限，特別是需要大量純度很高的糖的時候。發(fā)展能夠大量、高效的從自然界分離 純度較高的聚糖的方法對于糖文庫的建立非常重要。另一方面，多糖或寡糖可W通過多步 生物合成結合化學和生物催化方法進行，該對于自然來源糖類的不足可W起到補充作用。 對于糖類合成的研究已經持續(xù)了一個多世紀，經過大量的研究工作，現(xiàn)在許多寡糖已經可 W人工合成。然而由于糖類結構的復雜性的不同，專業(yè)的實驗室合成某些寡糖可能需要數(shù) 月甚至數(shù)年時間。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種制備成本低，能更好的反應糖鏈與其結合蛋白作用的 自然狀態(tài)，降低識別的非特異性，解決固定效率低，結合特異性不真實的一種糖膚巧片及其 制備方法。
[0007] 本發(fā)明提供一種糖膚巧片制備方法，用凝集素濾膜輔助法從自然來源的樣本中分 離出糖膚，利用糖膚上膚的N-端或氨基酸殘基上的氨基，WN-C鍵形式共價偶聯(lián)到環(huán)氧化 衍生化的固相載體上，具體是；先將蛋白用活化膜蛋白酶trypsin酶解得蛋白酶解液；再向 蛋白酶解液加入凝集素，清洗、洗脫選擇性分離蛋白酶解液中的糖蛋白，得到特異性分離的 糖膚；利用所述特異性分離的糖膚制成點樣液，將點樣液加到384孔板內，再用點樣儀在環(huán) 氧化片基上點制4區(qū)的陣列，得到糖膚巧片。
[0008] 所述包括蛋白酶解具體是；取蛋白樣品1~1. 5mg，加入離屯、管中，進行離屯、濃縮， 再加入弱堿性清洗液，再次離屯、，終體積100化，離屯、產物用500化終濃度8M尿素溶解、室溫 靜置至少30min，濃縮離屯、至100化，再加入200化lOmmol/L的DTT(二硫蘇糖醇)溶液進行 水浴，水浴后加入100化20mmol/LIAM(艦己酷胺)溶液，避光靜置，再加入100化lOmmol/L 的DTT溶液后進行水浴，水浴結束后加入0. 125mg/mL的活化膜蛋白酶trypsin,酶解過夜， 酶解后高溫加熱，離屯、收集離屯、液，得到蛋白酶解液。
[0009] 所述選擇性分離蛋白酶解液中的糖蛋白具體是；取300嗦凝集素加入到蛋白酶解 液中，空氣震蕩浴中室溫反應化，轉移至30KD離屯、柱中，通過用結合緩沖液的反復清洗， 600化/次，洗去非特異性吸附的蛋白質，然后加入300化洗脫緩沖液（ConA的洗脫緩沖液 為含有0. 5mol/La-甲基甘露糖巧的緩沖液，LCA的洗脫緩沖液為含有0. 2mol/L巖藻糖 的緩沖液)，空氣震蕩浴中洗脫比，收集洗脫液，即得到從樣本中特異性分離的糖膚。
[0010] 所述糖膚巧片的點制的具體步驟是 1) 將純化的糖膚配制成點樣液，該點樣液的有效成分為具有一類糖鏈結構的糖膚； 2) 將配制的點樣液加到384孔板內，再用點樣儀在環(huán)氧化片基上點制4區(qū)的陣列（點 樣）； 3) 將點制好的巧片在濕度為40%~60%的環(huán)境中解育過夜；對解育好的巧片在37°C 的真空干燥器中抽真空3小時或者6(TC的真空干燥器中抽真空1小時，使糖膚固定于巧片 上； 4) 將固定好的糖膚巧片放置在干燥器中，避光保存；稱量0. 02g/mLBSA溶入抑7. 4的 磯酸鹽緩沖液-吐溫20中，溶解混勻后用0. 2ym的濾膜過濾，將制備好的糖膚巧片置于封 閉液中1小時； 5) 將封閉后的糖膚巧片用磯酸鹽緩沖液-吐溫20和磯酸鹽緩沖液分別依次清洗1次， 每次5分鐘，再經甩干后備用； 6) 對甩干后的糖膚巧片加入600~700yL的解育緩沖液，作為與待測樣本的反應環(huán) 境； 所述磯酸鹽緩沖液抑7. 4W1L總量計，組分為：化C18.Og，KC1 0. 2g，KH2PO40. 2g， 化2冊〇4*12&0 2. 9g; 所述磯酸鹽緩沖液-吐溫20是還含有質量分數(shù)0. 05吐溫20的所述磯酸鹽緩沖液。
[0011] 所述蛋白酶解過程中弱堿性清洗液采用lOOmmol/L畑4肥〇3。
[0012] 所述蛋白酶解過程中所有離屯、均采用10邸離屯、柱，柱溫4°C，14,OOOg離屯、，離屯、 時間15min。
[0013] 所述蛋白酶解過程中加入弱堿性清洗液并再次離屯、的處理重復兩次。
[0014] 所述蛋白酶解過程中所有水浴處理中均為水浴溫度37°C、時間比。
[0015] 所述蛋白酶解過程IAM溶液避光保存，避光室溫靜置比。
[0016] 所述蛋白酶解過程中活化膜蛋白酶trypsin與蛋白的質量之比蛋白酶：蛋白 =1:100,且用 25mmol/L畑4肥〇3稀釋。
[0017] 本發(fā)明具有如下有益效果： 本發(fā)明技術方案基于凝集素對特定糖鏈識別結合特異性，用凝集素濾膜輔助法從自然 來源的樣本中分離出糖膚，利用糖膚上膚的N-端或氨基酸殘基上的氨基，WN-C鍵形式共 價偶聯(lián)到環(huán)氧化衍生化的固相載體上，制備出糖膚巧片，解決了糖鏈來源難和昂貴的問題， 成本和技術都較傳統(tǒng)的糖巧片較低；能更好的反應糖鏈與其結合蛋白作用的自然狀態(tài)，能 降低識別的非特異性，解決了固定效率低，結合特異性不真實等技術問題。
【附圖說明】
[0018] 圖1為本發(fā)明糖膚巧片制備的流程示意圖； 圖2為凝集素巧片檢測圖，圖中A為標準蛋白核糖核酸酶B全蛋白，B為酶解后獲得的 糖膚，C為ConA富集后的糖膚； 圖3為質控圖，A為點樣后，B為點樣清洗后，C為封閉后，D為BSA-切3陰性質控圖，E為MAkll-切3 (特異性識別Sia2-3Gaiel-4Glc(NAc)結構）； 圖4為糖膚巧片點樣陣列圖，圖中藍色代表陰性控制點，綠色代表陽性點（Marker),灰 色代表不同來源的糖膚； 圖5為糖膚巧片解育結果圖； 圖6為不同點