信號且大于含2%BSA、0. 5mol/L甘氨酸的磯酸鹽緩沖液（如圖 10所示），說明1%BSA磯酸緩沖液的封閉效果優(yōu)于2%BSA、0. 5mol/L甘氨酸的磯酸鹽緩沖 液。
[002引 5.最佳解育緩沖液的確定 在含有1%BSA(v/v)、0. 58%NaCl或者2%BSA、0. 5mol/L甘氨酸的磯酸鹽緩沖溶液(含 0. 05%Tween-20)中分別作為解育液對巧片進行解育，比較該2種緩沖液對糖膚巧片與切3 標記的RNaseB結合的影響。結果發(fā)現含l%BSA(v/v)、0. 58%NaCl磯酸鹽緩沖溶液(含 0. 05%Tween-20)作為解育緩沖液，檢測均能獲得理想的巧光信號，含有2%BSA、0. 5mol/L甘 氨酸的磯酸鹽緩沖溶液(含0. 05%Tween-20作為解育緩沖液，未能出現巧光信號，該說明甘 氨酸會影響二者的特異性結合（圖11)。
[002引 實施例3 如圖12和圖13所示，從糖膚巧片掃描結果圖中獲取各個不同來源用LCA和ConA分別 提取的糖膚與糖結合蛋白結合的巧光信號值，將大于2倍背景標準偏差的值作為有效值。 一張片子上的每個區(qū)中LCA和ConA提取的不同源性的糖膚都有3個重復點，選取每種糖膚 的巧光信號值的中值，求得平均值和標準偏差值。比較二型糖尿病患者和健康對照的唾液， 血清中糖結合蛋白的差異表達情況。計算二型糖尿病患者唾液、血清樣本巧光信號和健康 對照唾液樣本巧光信號的比值Ratio。一般的情況，統(tǒng)計學理論將Ratio值在0. 66到1. 5 之間的值作為無顯著差異的值，而Ratio值大于1. 5和小于0. 66的作為存在差異的值。
[0030]W下表一、表二為LCA和ConA提取的源性不同的糖膚相應的測試結果。
[0031] 表一為本發(fā)明健康對照老年女性和2型糖尿病患者老年女性唾液混合樣本的檢 測結果。
[0032]表一
注；FH;健康老年女性對照樣本，抑；2型糖尿病患者老年女性樣本，其中沖< 0. 05;*沖 < 0.01;林沖 <0.001。
[0033] 表二為本發(fā)明健康對照老年女性和2型糖尿病患者老年女性血清混合樣本的檢 測結果。
[0034]表二
注：FH;健康老年女性對照樣本，抑；2型糖尿病患者老年女性樣本，其中沖< 0. 05;*沖< 0.01;林沖< 0.001。
[0035] W上內容是結合具體的實施方式對本發(fā)明所做的進一步詳細說明，不能認定本發(fā) 明的具體實施只局限于該些說明。對于本發(fā)明所屬技術領域的普通技術人員來說，在不脫 離本發(fā)明構思的前提下，還可W做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬于本發(fā)明的保護 范圍。
【主權項】
1. 一種糖肽芯片制備方法，其特征在于，用凝集素濾膜輔助法從自然來源的樣本中分 離出糖肽，利用糖肽上肽的N-端或氨基酸殘基上的氨基，以N-C鍵形式共價偶聯(lián)到環(huán)氧化 衍生化的固相載體上，具體是：先將蛋白用活化胰蛋白酶trypsin酶解得蛋白酶解液；再向 蛋白酶解液加入凝集素，清洗、洗脫選擇性分離蛋白酶解液中的糖蛋白，得到特異性分離的 糖肽；利用所述特異性分離的糖肽制成點樣液，將點樣液加到384孔板內，再用點樣儀在環(huán) 氧化片基上點制4區(qū)的陣列，得到糖肽芯片。2. 根據權利要求1所述糖肽芯片制備方法，其特征在于，所述包括蛋白酶解具體是：取 蛋白樣品1~I. 5mg，加入離心管中，進行離心濃縮，再加入弱堿性清洗液，再次離心，終體 積100ML，離心產物用500ML終濃度8M尿素溶解、室溫靜置至少30min，濃縮離心至100ML， 再加入200ML lOmmol/L的DTT溶液進行水浴，水浴后加入IOOML 20mmol/L IAM溶液，避光 靜置，再加入100ML IOmmoVL的DTT溶液后進行水浴，水浴結束后加入0. 125mg/mL的活化 胰蛋白酶trypsin，酶解過夜，酶解后高溫加熱，離心收集離心液，得到蛋白酶解液。3. 根據權利要求1所述糖肽芯片制備方法，其特征在于，所述選擇性分離蛋白酶解液 中的糖蛋白具體是：取300呢凝集素加入到蛋白酶解液中，空氣震蕩浴中室溫反應3h，轉移 至30KD離心柱中，通過用結合緩沖液的反復清洗，600ML/次，洗去非特異性吸附的蛋白質， 然后加入300ML洗脫緩沖液，Con A的洗脫緩沖液為含有0. 5mol/L a -甲基甘露糖苷的緩 沖液，LCA的洗脫緩沖液為含有0. 2mol/L巖藻糖的緩沖液，空氣震蕩浴中洗脫lh，收集洗 脫液，即得到從樣本中特異性分離的糖肽。4. 根據權利要求1所述糖肽芯片制備方法，其特征在于，所述糖肽芯片的點制的具體 步驟是： 1) 將純化的糖肽配制成點樣液，該點樣液的有效成分為具有一類糖鏈結構的糖肽； 2) 將配制的點樣液加到384孔板內，再用點樣儀在環(huán)氧化片基上點制4區(qū)的陣列； 3) 將點制好的芯片在濕度為40%~60%的環(huán)境中孵育過夜；對孵育好的芯片在37°C 的真空干燥器中抽真空3小時或者60°C的真空干燥器中抽真空1小時，使糖肽固定于芯片 上； 4) 將固定好的糖肽芯片放置在干燥器中，避光保存；稱量0. 02g/mLBSA溶入pH7. 4的 磷酸鹽緩沖液-吐溫20中，溶解混勻后用0. 2 y m的濾膜過濾，將制備好的糖肽芯片置于封 閉液中1小時； 5) 將封閉后的糖肽芯片用磷酸鹽緩沖液-吐溫20和磷酸鹽緩沖液分別依次清洗1次， 每次5分鐘，再經甩干后備用； 6) 對甩干后的糖肽芯片加入600~700 yL的孵育緩沖液，作為與待測樣本的反應環(huán) 境； 所述磷酸鹽緩沖液PH7. 4以IL總量計，組分為：NaCl 8. 0g，KCl 0. 2g，KH2PO4 0. 2g， Na2HPO4* 12H20 2. 9g ； 所述磷酸鹽緩沖液-吐溫20是還含有質量分數0. 05吐溫20的所述磷酸鹽緩沖液。5. 根據權利要求2所述的糖肽芯片制備方法，其特征在于：所述蛋白酶解過程中弱堿 性清洗液采用IOOmmo I/L NH4HCO3。6. 根據權利要求3所述的糖肽芯片制備方法，其特征在于：所述蛋白酶解過程中所有 離心均采用10KD離心柱，柱溫4°C，14, OOOg離心，離心時間15min。7. 根據權利要求5所述的糖肽芯片制備方法，其特征在于：所述蛋白酶解過程中加入 弱堿性清洗液并再次離心的處理重復兩次。8. 根據權利要求2所述的糖肽芯片制備方法，其特征在于：所述蛋白酶解過程中所有 水浴處理中均為水浴溫度37°C、時間Ih。9. 根據權利要求4所述的糖肽芯片制備方法，其特征在于：所述蛋白酶解過程IAM溶 液避光保存，避光室溫靜置lh。10. 根據權利要求1~9任一項所述的糖肽芯片制備方法，其特征在于：所述蛋白酶 解過程中活化胰蛋白酶trypsin與蛋白的質量之比蛋白酶：蛋白=1:100,且用25mmol/L NH 4HCO3 稀釋。
【專利摘要】一種糖肽芯片及其制備方法，涉及一種鑒別疾病的糖肽芯片。目的在于提供一種制備成本低，能更好的反應糖鏈與其結合蛋白作用的自然狀態(tài)，降低識別的非特異性，解決固定效率低，結合特異性不真實的一種糖肽芯片及其制備方法。該方法用凝集素濾膜輔助法從自然來源的樣本中分離出糖肽，利用糖肽上肽的N-端或氨基酸殘基上的氨基，以N-C鍵形式共價偶聯(lián)到環(huán)氧化衍生化的固相載體上。該制備方法制備成本及技術較傳統(tǒng)技術低，制備的糖肽芯片能更好的反應糖鏈與其結合蛋白作用的自然狀態(tài)，降低了識別的非特異性，解決現有技術固定效率低，結合特異性不真實的缺陷。
【IPC分類】G01N33/68, G01N33/543
【公開號】CN104977417
【申請?zhí)枴緾N201510248845
【發(fā)明人】李錚, 鐘耀剛, 馬恬然, 杜昊騏, 賈麗苑, 秦鑫敏, 張志偉, 于漢杰
【申請人】西北大學
【公開日】2015年10月14日
【申請日】2015年5月15日