專(zhuān)利名稱(chēng)：：抗炎和抗過(guò)敏的環(huán)肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及合成的環(huán)肽，其一級(jí)結(jié)構(gòu)含有13個(gè)L-氨基酸的序列，呈現(xiàn)出抗炎和抗過(guò)敏的活性，可用于治療急性或慢性炎癥和/或過(guò)敏癥，尤其是可用于治療急性或慢性過(guò)敏性哮喘。本發(fā)明還描述了含有所述肽的藥物組合物、其用途和治療或預(yù)防急性和/或慢性炎癥和/或過(guò)敏性病癥的方法?？s寫(xiě)貫穿本說(shuō)明性報(bào)道使用下列縮寫(xiě)"seq01"是指SequenceIDNo.1;"seq02，，是指SequenceIDNo.2;"Seq03"是指SequenceIDNo.3;"Seq04"是指SequenceIDNo.4;"Seq05"是指SequenceIDNo.5;"Seq06"是指SequenceIDNo.6;"Seq07"是指SequenceIDNo,7;"Seq08"是指SequenceIDNo.8;"Seq09"是指SequenceIDNo.9。發(fā)明基礎(chǔ)炎癥是動(dòng)態(tài)的和保護(hù)性的內(nèi)穩(wěn)態(tài)反應(yīng)，其作為宿主遭受多樣攻擊的結(jié)果而發(fā)生.炎癥急性期的特征為血管系統(tǒng)改變，它引起微循環(huán)血流增加和結(jié)構(gòu)變化，允許血漿蛋白和白細(xì)胞從循環(huán)中流出，其伴有旨在恢復(fù)內(nèi)穩(wěn)態(tài)的細(xì)胞和組織上的一系列事件。在組織中的事件方面，在這個(gè)時(shí)期，白細(xì)胞募集至損傷部位。最初，主要流入是嗜中性白細(xì)胞，隨后是單核細(xì)胞。流入引起炎性過(guò)程消退、除去攻擊物質(zhì)和恢復(fù)組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)。4嗜中性白細(xì)胞是到達(dá)損害部位的初級(jí)細(xì)胞，在組織損傷急性期，數(shù)量上占有優(yōu)勢(shì)。它們通過(guò)吞噬作用和破壞致病物質(zhì)而在生物體防御中起重要作用。此外，嗜中性白細(xì)胞可被內(nèi)皮細(xì)胞和組織中固有的巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞因子活化。一旦血液?jiǎn)魏思?xì)胞離開(kāi)循環(huán)系統(tǒng)并進(jìn)入損傷部位，它們就分化為巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞是炎癥反應(yīng)中最終的效應(yīng)細(xì)胞。巨噬細(xì)胞負(fù)責(zé)吞噬外來(lái)顆粒并通過(guò)合成反應(yīng)性氧種類(lèi)例如一氧化氮來(lái)破壞它們。隨后，活化巨噬細(xì)胞通過(guò)除去細(xì)胞碎片，誘發(fā)消除抗原和消除炎癥反應(yīng)，以及啟動(dòng)適應(yīng)性免疫反應(yīng)?？紤]到另一種方式的細(xì)胞事件，募集至損傷部位的白細(xì)胞啟動(dòng)促炎或"報(bào)警"細(xì)胞因子(IL-1、TNFot-和IL-6)的分泌過(guò)程，它們啟動(dòng)炎癥部位以及遠(yuǎn)處的一連串體液和細(xì)胞反應(yīng)。細(xì)胞因子對(duì)基質(zhì)細(xì)胞的活化驅(qū)使對(duì)嗜中性白細(xì)胞和單核細(xì)胞起作用的趨化性趨化因子的分泌。在炎癥部位，毛細(xì)血管后微靜脈的舒張開(kāi)始發(fā)生以及血流改變(減少)，引起白細(xì)胞沿著血管內(nèi)皮邊緣化，這是碳水化合物中富含的選擇蛋白及其配體介導(dǎo)的過(guò)程。活化后，白細(xì)胞停止?jié)L動(dòng)并穩(wěn)固附著于內(nèi)皮上。這個(gè)事件是白細(xì)胞中表達(dá)的整聯(lián)蛋白P1和P2與內(nèi)皮中表達(dá)的免疫球蛋白超家族的各種成員(ICAM-1、ICAM-2和VCAM-1)結(jié)合的結(jié)果。最后，白細(xì)胞在朝向基底外側(cè)表面的頂部區(qū)的內(nèi)皮細(xì)胞之間向血管外空間的方向遷移(血細(xì)胞滲出)。隨后通過(guò)血管外組織向內(nèi)皮下遷移依賴(lài)于趨化因子的梯度、趨化細(xì)胞因子和與胞外基質(zhì)的粘附相互作用。最后，在炎癥灶，白細(xì)胞增強(qiáng)它們的細(xì)胞毒性作用，釋放氧化劑、蛋白酶和其他產(chǎn)物，諸如生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子。與嗜中性白細(xì)胞相反，嗜酸性粒細(xì)胞可以在組織中長(zhǎng)期存活，時(shí)常存活數(shù)周，這取決于微環(huán)境中存在的細(xì)胞因子。關(guān)于參與這個(gè)過(guò)程的細(xì)胞因子，由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、活化NK細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子TNFcc增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的粘附分子表達(dá)；活化嗜中性白細(xì)胞；刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1、IL-6和IL-8;增加I型MHC表達(dá)；增加下丘腦細(xì)胞合成前列腺素；作用于肝細(xì)胞，產(chǎn)生血清淀粉樣蛋白；抑制髓質(zhì)中細(xì)胞的分裂；減少組織灌流(通過(guò)降低心肌收縮力)；緩和血管平滑肌緊張和促進(jìn)血管內(nèi)血栓形成。巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮和上皮細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子IL-1促進(jìn)T淋巴細(xì)胞合成IL-2和B淋巴細(xì)胞的分化；促進(jìn)前列腺素合成；增加T和B淋巴細(xì)胞增生；作用于巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)IL-1、IL-6、TNF-cx和IL-8合成；促進(jìn)蛋白急性期合成；惡病質(zhì)和增加髄質(zhì)中細(xì)胞的分裂。巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮和T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子IL-6作用于肝細(xì)胞，產(chǎn)生纖維蛋白原；活化B淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)因子；增加髓質(zhì)中細(xì)胞的分裂。這些細(xì)總和組織事件產(chǎn)生影響，其特征是疼痛、體溫升高、紅斑、水胂和炎癥持續(xù)過(guò)程中損害部位附近的功能喪失。炎性過(guò)程控制的調(diào)節(jié)失敗并可以引起上皮、內(nèi)皮或肌細(xì)胞破壞以及引起細(xì)胞水平或所波及器官的功能障礙。例如哮喘是慢性肺炎性疾病，其特征在于支氣管收縮急性發(fā)作和嗜酸性粒細(xì)胞肺炎。在急性期，支氣管收縮由肥大細(xì)胞釋放的藥理學(xué)介質(zhì)驅(qū)使，由過(guò)敏原與其表面上過(guò)敏原特異性IgE分子結(jié)合活化，和晚期支氣管反應(yīng)與嚴(yán)重的嗜酸性粒細(xì)胞肺炎有關(guān)。T淋巴細(xì)胞，主要是Th2亞型，通過(guò)產(chǎn)生基因控制的細(xì)胞因子，例如IL-4、IL-5、IL-9和IL-13而安排這些反應(yīng)。成熟肺樹(shù)突細(xì)胞呈遞抗原是Th2致敏過(guò)程的基礎(chǔ)，其在接觸空傳過(guò)敏原的過(guò)敏患者或動(dòng)物中發(fā)生。哮喘中炎癥的證據(jù)最初來(lái)源于這一發(fā)現(xiàn)它表現(xiàn)出CD4+T淋巴細(xì)胞、Th2型、肥大細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在致命哮喘患者的肺中優(yōu)先蓄積。晚期反應(yīng)LPR期間，哮喘患者的支氣管肺泡灌洗法分析也揭示存在CD4+T淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量升高?；罨疌D4+T細(xì)胞是細(xì)胞因子(IL-4、IL-5、IL-9和IL-13)的主要來(lái)源，其造成過(guò)敏性肺炎癥反應(yīng)，典型地Th2，嗜酸性粒細(xì)胞優(yōu)先滲出和IgE產(chǎn)生。由于多種多樣的因子的作用，例如促進(jìn)趨化性的細(xì)胞因子和趨化因子的作用，嗜酸性粒細(xì)胞被吸引到肺，增加粘附分子在血管內(nèi)皮和細(xì)胞表面表達(dá)、活化和細(xì)胞遷移。一旦活化，嗜酸性粒細(xì)胞就釋放它們的顆粒狀內(nèi)容物(主要是堿性蛋白、來(lái)源于嗜酸性粒細(xì)胞的神經(jīng)毒素、來(lái)自嗜酸性粒細(xì)胞的陽(yáng)離子蛋白和嗜酸性粒細(xì)胞產(chǎn)生的過(guò)氧化物酶)，除了對(duì)蠕蟲(chóng)和細(xì)菌有毒性之外，還直接刺激支氣管平滑肌，引起收縮和促進(jìn)膽堿能介質(zhì)反應(yīng)增加。在先前確立的肺炎中，由于局部產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，嗜酸性粒細(xì)胞能夠擴(kuò)增反應(yīng)、募集新細(xì)胞。慢性嗜酸性粒細(xì)胞炎癥和IgE抗體直接與孝喘嚴(yán)重性有關(guān)。津喘中的慢性炎癥伴有肺反應(yīng)過(guò)度(支氣管應(yīng)答非特異性刺激而收縮增強(qiáng))和氣道結(jié)構(gòu)變化。很多因素可以促成哮喘發(fā)作，包括過(guò)敏原、細(xì)菌或病毒感染、鍛煉、氣象突然變化或接觸空傳刺激，例如煙草煙霧。5歲以下兒童哮喘的主要原因是副流感病毒(PIV)、呼吸道合胞病毒(VSR)、鼻病毒和腸道病毒引起的病毒感染。當(dāng)過(guò)敏性哮喘個(gè)體接觸煙霧形式的過(guò)敏原時(shí)，當(dāng)5至10分鐘內(nèi)開(kāi)始表現(xiàn)出癥狀。在哮喘急性期期間，觀察到下列癥狀支氣管平滑肌收縮、局限性水腫、支氣管上皮腺體粘液分泌增加和輕度細(xì)胞浸潤(rùn)。介質(zhì)的作用可以解釋這些特征，所述介質(zhì)諸如組胺、前列腺素D2(PGD2)、白細(xì)胞三烯C4(LTC4)、血小板活化因子(PAF)和IgE過(guò)敏原-特異性抗體活化的肥大細(xì)胞所釋放的細(xì)胞因子TNF-oc和IL-1。根據(jù)國(guó)立衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)中心疾病預(yù)防和控制中心(NCHS-CDC，2005，Hyattsville,MD)的估計(jì)，在美國(guó)大約2220萬(wàn)人罹患哮喘，其中650萬(wàn)人小于18歲。單就在美國(guó)，每天接近ll人死于哞喘。在巴西，估計(jì)表明10%的人群表現(xiàn)出哮喘癥狀，每年2500人死亡，是進(jìn)入通用健康管理系統(tǒng)(UniversalHealthCareSystem,SUS)的第四大原因。在哞喘患者中，60%的病例難以控制。目前，炎癥和哞喘的治療利用兩類(lèi)藥物1)改善急性癥狀(60%的哮喘)的藥物試劑，主要以具有速效作用的h-激動(dòng)劑為代表，季銨抗膽堿能試劑異丙托溴銨，和黃嘌呤衍生物氨茶堿，引起小支氣管平滑肌松弛；和2)維持藥物，用于預(yù)防哞喘癥狀，主要以吸入性和全身性皮質(zhì)醇為代表。盡管如此，使用這些藥物，特別是重復(fù)或長(zhǎng)期使用，具有局限性，因?yàn)樗鼈冏饔梅翘禺愋院碗S之發(fā)生的對(duì)患者的不受歡迎的副作用。此外，目前使用的抗炎藥物不能顯著預(yù)防哮喘伴發(fā)的肺功能喪失。設(shè)法治療炎癥的藥物具有副作用風(fēng)險(xiǎn)最小的潛力和正在不斷地研究更特異的藥物?？梢栽龓讉€(gè)實(shí)例。專(zhuān)利申請(qǐng)W003/070194介紹了用a-氨基酸酯化皮質(zhì)醇的提議，由此能夠作為前體藥物起作用，用于治療鼻炎和哮喘，尤其是通過(guò)吸入，和用于炎癥的治療，尤其是通過(guò)局部或局限性給藥。然而，該提議的前體藥物呈現(xiàn)的優(yōu)點(diǎn)不明確，因?yàn)樘岢龅闹委熑砸蕾?lài)于皮質(zhì)醇的作用。專(zhuān)利申請(qǐng)W02004/068928涉及從蟾蜍Bombinamaxima皮膚防御性分泌而分離的肽，它們是B2緩激肽受體激動(dòng)劑，能夠用于治療和/或預(yù)防與緩激肽有關(guān)的病癥，包括心血管病癥、炎癥、哮喘、過(guò)敏性鼻炎，疼痛、血管生成等。在又一個(gè)專(zhuān)利申請(qǐng)US2003/0152564中，提供了一個(gè)肽，相當(dāng)于人C反應(yīng)蛋白序列第62-71位，能夠體外抑制人白細(xì)胞彈性蛋白酶和/或人組織蛋白酶G的酶活性，能夠治療慢性炎癥狀態(tài)例如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肺氣腫、囊性纖維化、支氣管炎、哮喘和一些急性綜合征，包括呼吸障礙。專(zhuān)利申請(qǐng)US2007/0123455提出一種方法和組合物，其包含人蛋白S100A8和/或S100A9，稱(chēng)其能夠用于治療炎性疾病，例如過(guò)敏癥、哮喘、動(dòng)脈粥樣硬化、自身免疫疾病、感染等等。美國(guó)專(zhuān)利5,290,762描述了一種預(yù)防或治療患者炎癥疾病的方法，包括將大量至少一種絲氨酸蛋白酶抑制劑施用于受傷部位。該專(zhuān)利文獻(xiàn)要求保護(hù)一組絲氨酸蛋白酶抑制劑，分泌白細(xì)胞蛋白酶、C反應(yīng)蛋白、血清淀粉樣蛋白A、oc-2-巨球蛋白或a-2-抗纖維蛋白溶酶的任何抑制劑。已經(jīng)廣泛研究了包括抑制絲氨酸蛋白酶治療炎癥的方案。例如，人類(lèi)胰蛋白酶是絲氨酸蛋白酶，在肥大細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，類(lèi)似于胰蛋白酶。類(lèi)胰蛋白酶是一系列過(guò)敏性和炎癥病理過(guò)程的介質(zhì)，包括鼻炎、結(jié)膜炎和哮喘。因而，這個(gè)絲氨酸蛋白酶抑制劑可以用于成功治療過(guò)敏性和呼吸系統(tǒng)疾病。在絲氨酸蛋白酶抑制劑當(dāng)中，研究最好的是BowmanSoc.顏.194663:547]和Birk等["i/".組C麵c"iyrae/，SecA196211:48;"/oc力e瓜"/o;力;^.196367:326]描述的肽(它們是命名為BBI-5^m3"S/ri:抑制劑-起源的來(lái)源)。雙子葉和單子葉植物中富含BBI's。這些當(dāng)中，指出名為SFTI-1(向日葵胰蛋白酶抑制劑-1)，它是由14個(gè)氨基酸組成的二環(huán)肽，到目前內(nèi)止，是最小和最有效的天然Bowman-Birk型抑制劑。SFTI-1已經(jīng)用于抗病原體和昆蟲(chóng)的轉(zhuǎn)基因植物，但是也可以用于預(yù)防癌癥、登革熱及其他炎癥和過(guò)敏性疾病。除了植物可以產(chǎn)生的藥理學(xué)活性肽之外，動(dòng)物產(chǎn)生的物質(zhì)，例如毒液也已經(jīng)是研究的目標(biāo)。動(dòng)物毒素可以認(rèn)為是自然產(chǎn)生的分子，能夠?qū)崿F(xiàn)特異性和選擇性目標(biāo)，抑制或刺激生理反應(yīng)。尤其應(yīng)該指出該蛋白命名為natterines，它們是從巴西發(fā)現(xiàn)的魚(yú)Thalassophrynenattereri毒液中分離的。這些蛋白形成分子量大約38kDa的毒素家族，它們之間序列呈現(xiàn)高度同源性并能夠誘導(dǎo)無(wú)數(shù)生物活性，例如水腫和傷害感受。使用natterines作為起點(diǎn)，可以觀察到本身不是通過(guò)天然毒液純化獲得的氨基酸的序列，盡管它們與Bowman-Birk肽的結(jié)構(gòu)相似性顯著。從natterines分離所述氨基酸序列的嘗試挫敗了，因?yàn)樗枰L(zhǎng)期和艱辛的過(guò)程，產(chǎn)生很少量的不純肽片段，不完全對(duì)應(yīng)于本發(fā)明感興趣的肽。這是工業(yè)生產(chǎn)這些肽的顯著障礙。發(fā)明概述9本發(fā)明提供了通過(guò)人工肽合成獲得的環(huán)肽，在它們的一級(jí)結(jié)構(gòu)中包含13個(gè)L-氨基酸的序列，具體地說(shuō)在該肽鏈的第4和13位存在氨基酸半胱氨酸而在該肽鏈的第11位存在氨基酸賴(lài)氨酸，它們的特征在于含有在第4和13位的半胱氨酸殘基的硫醇基之間的二硫鍵，形成環(huán)肽。所述合成環(huán)肽呈現(xiàn)抗炎和抗過(guò)敏活性，尤其是在治療急性和/或慢性哮喘中的應(yīng)用前景。附圖描述圖1:胰蛋白酶水解底物Abz-FRSSRQ-EDDnp的催化活性獲得的米-曼氏動(dòng)力學(xué)。圖2:不同類(lèi)型序列對(duì)LPS(脂多糖)所誘發(fā)的微循環(huán)中的白細(xì)胞滾動(dòng)的影響。豐和LPS組相比p<0.05。圖3:Seq07和ModLysMu序列的必需氨基酸改變對(duì)LPS(脂多糖)所誘發(fā)的微循環(huán)中白細(xì)胞滾動(dòng)的影響。*和LPS組相比p<0.05。圖4:Seq07預(yù)防LPS(脂多糖)誘導(dǎo)腹膜炎。LPS(10pg/mL)注射的小鼠在用Seq07(4或40nM)處理之前先腹膜內(nèi)處理30分鐘。該圖表示了24小時(shí)后洗滌腹膜，細(xì)胞(A)、嗜中性白細(xì)胞(B)和巨噬細(xì)胞(C)總數(shù)。結(jié)果用平均值土SEM來(lái)表示。,和LPS組相比p〈0.05。圖5:中Seq07(4或40認(rèn)ol)對(duì)急性哞喘支氣管肺泡灌洗得到的白細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞募集的影響。進(jìn)行小鼠支氣管肺泡灌洗以計(jì)算細(xì)胞(A)和嗜酸性粒細(xì)胞(B)總數(shù)。結(jié)果用6只動(dòng)物/組的平均值±SEM來(lái)表示。*和哞喘組相比p<0.001。圖6:Seq07對(duì)慢性哮喘時(shí)支氣管肺泡灌洗法得到的白細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞募集的影響。進(jìn)行支氣管肺泡灌洗以計(jì)算細(xì)胞(A)和嗜酸性粒細(xì)胞(B)總數(shù)。結(jié)果用6只動(dòng)物/組的平均值士SEM來(lái)表示。*和哮喘組相比p<0.001。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及環(huán)狀合成肽，它們的一級(jí)結(jié)構(gòu)中包含13個(gè)L-氨基酸的序列，優(yōu)選在該肽的一個(gè)或兩個(gè)末端存在化學(xué)保護(hù)基，所述肽呈現(xiàn)出抗炎和抗過(guò)敏活性。本發(fā)明的肽在肽鏈的第4和13位具有氨基酸半胱氨酸而在肽鏈的第ll位具有氨基酸賴(lài)氨酸。另外，本發(fā)明中包括的肽優(yōu)選在它們的基礎(chǔ)序列第l位具有氨基酸纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸或另外的疏水和中性氨基酸。另外，本發(fā)明中包括的肽優(yōu)選在它們的基礎(chǔ)序列第3位具有氨基酸精氨酸、谷氨酰胺或另外的親水和極性氨基酸，能具有正電荷。另外，本發(fā)明中包括的肽優(yōu)選在它們的基礎(chǔ)序列第5位具有氨基酸精氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、天冬氨酸或另外的親水和極性氨基酸，能具有正電荷。另外，本發(fā)明中包括的肽優(yōu)選在它們的基礎(chǔ)序列第7位具有氨基酸甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸或另外的親水和中性氨基酸。另夕卜，本發(fā)明中包括的肽優(yōu)選在它們的基礎(chǔ)序列第9位具有氨基特別是，本發(fā)明的肽特征在于它們含有第4和13位半胱氨酸殘基的硫醇基之間形成二硫鍵，形成環(huán)肽的事實(shí)。肽分子的化學(xué)保護(hù)可以通過(guò)向肽羧基末端或肽氨基末端添加化學(xué)保護(hù)基，或仍通過(guò)分子兩個(gè)末端的保護(hù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選，分子的保護(hù)通過(guò)本發(fā)明肽第13位氨基酸半胱氨酸羧基的酰胺化而發(fā)生，或通過(guò)肽鏈第1位氨基酸殘基乙?；l(fā)生，或仍通過(guò)羧基末端和氨基末端二者的保護(hù)而發(fā)生。在本發(fā)明的主要實(shí)施方案中，這些肽以本文中鑒定的氨基酸序列表征，縮寫(xiě)是SeqOl、Seq02、Seq03、Seq04、Seq05、Seq06、Seq07、Seq08和Seq09，它們的衍生物、同系物、類(lèi)似物和/或模擬物也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。這些肽的氨基酸序列的置換、缺失或修飾形式也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)，從本文教導(dǎo)的肽出發(fā)，其對(duì)于本發(fā)明技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。這些修飾的實(shí)例包括但不限于脯氨酸殘基被羥基化脯氨酸(羥脯氨酸)單獨(dú)、間隔或組合置換；甲硫氨酸殘基被氧化形式甲硫氨酸單獨(dú)、間隔或組合置換；和L-氨基酸被D-氨基酸單獨(dú)、間隔或組合置換。在它們的基礎(chǔ)序列中含有本文描述的氨基酸序列的更大的肽也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。類(lèi)似地，如本文所述，第1、2和3位已經(jīng)缺失的肽，同時(shí)仍保持第4和13位氨基酸之間存在的不變的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。包括在本發(fā)明中的環(huán)肽單獨(dú)或至少兩個(gè)肽組合呈現(xiàn)抑制實(shí)驗(yàn)室中檢測(cè)的哺乳動(dòng)物中白細(xì)胞的粘附和滾動(dòng)的能力。當(dāng)用本發(fā)明的代表性肽處理時(shí)，在炎性試劑LPS(脂多糖)注射的實(shí)驗(yàn)室哺乳動(dòng)物腹腔中，除抑制白細(xì)胞的粘附和滾動(dòng)之外，還觀察到白細(xì)胞募集減少和阻止，尤其是嗜中性白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在用卵清蛋白(OVA)攻擊引起急性鼠哮喘表現(xiàn)的免疫哺乳動(dòng)物中，肌內(nèi)注射、鼻內(nèi)和經(jīng)口給予本發(fā)明的環(huán)肽單獨(dú)或含有至少兩個(gè)肽的組合時(shí)，也顯示出能夠抑制向肺泡腔募集的白細(xì)胞總數(shù)，這個(gè)降低的特征尤其是在支氣管肺泡灌洗中嗜酸性粒細(xì)胞不存在。在發(fā)生動(dòng)物慢性哮喘的常規(guī)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中，本發(fā)明的環(huán)肽單獨(dú)或含有至少兩個(gè)肽的組合也能夠減少向肺泡腔募集的白細(xì)胞總數(shù)，伴嗜酸性粒細(xì)胞降低。根據(jù)在此以前相關(guān)的特征，已經(jīng)注意到本發(fā)明的環(huán)肽單獨(dú)或含有至少兩個(gè)肽的組合能夠抑制哺乳動(dòng)物中觀察到嗜酸性粒細(xì)胞滲出的炎癥表現(xiàn)、病理過(guò)敏表現(xiàn)，例如哮喘、支氣管炎、鼻炎和皮炎，以及相關(guān)病理表現(xiàn)，例如關(guān)節(jié)炎、免疫系統(tǒng)失調(diào)、免疫反應(yīng)過(guò)程中淋巴細(xì)胞功能障礙、腫瘤、細(xì)胞粘附和/或寄生蟲(chóng)病。向哮喘提供的結(jié)果可以與使用地塞米松的哞喘常規(guī)治療相媲美，其中本發(fā)明肽被證明同樣有效，另外，已經(jīng)觀察到本發(fā)明的環(huán)肽對(duì)抗胰蛋白酶消化，由此能夠經(jīng)口給藥。本發(fā)明肽可以采用的其他給藥方式包括但不限于鼻內(nèi)、肌內(nèi)和靜脈內(nèi)給藥。除抗酶胰蛋白酶的作用之外，本發(fā)明的肽也能抑制胰蛋白酶的水解作用，呈現(xiàn)20至63.6nM范圍內(nèi)的Ki。本發(fā)明肽的這個(gè)性能提示這種肽可以被分為絲氨酸蛋白酶抑制劑，從前胰蛋白酶是絲氨酸蛋白酶家族代表性的重要酶。也已知人類(lèi)胰蛋白酶是肥大細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的絲氨12酸蛋白酶，與胰蛋白酶非常相似，而且它的抑制被證明可成功治療呼吸和過(guò)敏性疾病，這可以提示證實(shí)的本發(fā)明肽的活性與抑制絲氨酸蛋白酶有關(guān)。本發(fā)明肽對(duì)巨噬細(xì)胞不具有任何細(xì)胞毒性作用，而且也證明對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物提睪肌的肌纖維或微循環(huán)不具有任何殺傷作用。此外，尚未證明本發(fā)明的肽單獨(dú)或組合具有免疫原性，因?yàn)樗鼈儾徽T導(dǎo)特異性抗體的合成，最重要的是尚未證明有致命性。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，環(huán)肽SeqOl、seq02、seq03、seq04、seq05、seq06、seq07、seq08和seq09可以釆用已知的合成肽技術(shù)獲得，例如經(jīng)典的在溶液中或固相化學(xué)合成；酶催化合成；使用重組DNA的技術(shù)。本發(fā)明的環(huán)肽的化學(xué)合成優(yōu)選可以在固相中完成，和更優(yōu)選使用FMOC(9-藥甲氧羰基)策略以保護(hù)存在于反應(yīng)中的a-氨基。合成肽的純化可以采用本領(lǐng)域熟知的色傳技術(shù)完成。優(yōu)選，采用液相色譜，質(zhì)譜法驗(yàn)證肽的純度和同一性。根據(jù)上迷說(shuō)明合成肽的純化后，接著必須將二疏鍵51入各個(gè)肽。該二硫鍵在空氣中通過(guò)還原方法在同一肽鏈第4和13位半胱氨酸殘基之間形成，例如，通過(guò)將肽以的0.05至15mg/mL的比例攪拌溶于0.01至0.5M碳酸氬銨溶液中，直到二硫鍵完全形成。肽可以通過(guò)凍干分離和通過(guò)制備型液相層析來(lái)純化。本發(fā)明的另外實(shí)施方案中涉及藥物組合物，含有肽Seq01、seci02、Seq03、Seq04、Seq05、Seq06、Seq07、Seq08或Seq09、它們的衍生物、同系物、類(lèi)似物和/或模擬物，其可以是它的藥物可接受鹽形式，單獨(dú)或含有至少兩種肽的組合在選自稀釋劑、賦形劑或藥物可接受溶劑的一種或多種栽體中。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是治療或預(yù)防急性或慢性炎癥和/或過(guò)敏性病癥的方法，例如但不限于支氣管哮喘、鼻炎、關(guān)節(jié)炎、異位性皮炎、免疫系統(tǒng)失調(diào)、免疫反應(yīng)過(guò)程中淋巴細(xì)胞功能障礙、腫瘤、細(xì)胞粘附和/或寄生蟲(chóng)病表現(xiàn)，通過(guò)將環(huán)肽SeqOl、Seq02、Seq03、Seq(H、Seq05、Seq06、Seq07、Seq08或SeqG9單獨(dú)或組合給予哺乳動(dòng)物，或?qū)⒑兄辽僖环N本發(fā)明肽的藥物組合物給予哺乳動(dòng)物。本發(fā)明的又一實(shí)施方案是環(huán)肽SeqOl、Seq02、Seq03、Seq04、Seq05、Seq06、Seq07、Seq08或Seq09單獨(dú)或組合在制備用于預(yù)防或治療急性或慢性炎癥和/或過(guò)敏性病癥的藥物中的應(yīng)用，例如但不限于支氣管哮喘、鼻炎、關(guān)節(jié)炎、異位性皮炎、免疫系統(tǒng)失調(diào)、免疫反應(yīng)過(guò)程中淋巴細(xì)胞功能障礙、腫瘤、細(xì)胞粘附和/或寄生蟲(chóng)病表現(xiàn)。依據(jù)這方面，本發(fā)明的合成環(huán)肽單獨(dú)或組合可以用來(lái)獲得抑制哺乳動(dòng)物炎癥和/或過(guò)敏癥發(fā)展的前體藥物或藥物。本發(fā)明的環(huán)肽或含有它的藥物組合物的給藥可以通過(guò)不限于肌內(nèi)、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)和經(jīng)口給藥的方式完成，優(yōu)選給藥方法是經(jīng)口。好理解本發(fā)明包含的研發(fā)內(nèi)容而采用，而不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明的范圍或精神。實(shí)施例1A:胰蛋白酶的抑制肽SeqOl抑制胰蛋白酶的研究揭示了圖l所示的簡(jiǎn)單竟?fàn)幮砸种?用X軸簡(jiǎn)單截取)和得到范圍lOjiM-O.lnM的L值。利用的底物是緩激肽熒光類(lèi)似物Abz-Phe-Arg-Ser-Ser-Arg-Gln-EDDnp,用純化，(HPLC)直到純度達(dá)到95%以上(單峰)。實(shí)施例1B:測(cè)試a)確定Km和k。"的酶促反應(yīng)通過(guò)熒光分析胰蛋白酶完全水解后形成的產(chǎn)物Abz來(lái)確定底物溶液的濃度。使用HitachiF-2000熒光分光計(jì)實(shí)施水解反應(yīng)，激發(fā)和發(fā)射縫隙分別定在IO和20nm，和激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別在320和420mn。反應(yīng)杯溫度維持在恒溫控制的隔室中37TC。在50mMTris-HCl緩沖液pH8.0中37"C測(cè)定胰蛋白酶(0.5-5nM)的酶促活性，所述緩沖液含有20mMNaCl，并添加大約0.l-6.0nM熒光底物。熒光的增加以熒光分光計(jì)連續(xù)監(jiān)測(cè)5分鐘。必要時(shí)，使用Araajo等人，Biochemistry25;8519，2000描述的經(jīng)驗(yàn)式進(jìn)行焚光讀數(shù)的校正。測(cè)定最初的水解(消耗底物小于10%)的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)并使用GRAFIT為Windows3.0程序提供的米-曼氏方程式進(jìn)行包括動(dòng)力學(xué)參數(shù)(Km，V屮和keat)的計(jì)算。b)測(cè)定抑制常數(shù)(Ki)為測(cè)定本發(fā)明肽抑制胰蛋白酶的動(dòng)力學(xué)，使用三種底物濃度a)相當(dāng)于IL值的一半(O.8pM);b)相當(dāng)于L全部值(1.6pM);c)相當(dāng)于稍高于L值的二倍(3.5piM)。酶采用3.0nM的濃度和抑制劑(Seq01至Seq09)采用三種濃度(10nM、100nM和lPm)，除每個(gè)底物濃度的對(duì)照外，底物消耗小于起始濃度的10%。在含20mMNaCl的Tris-HCl緩沖液pH8.0中，37C進(jìn)行賻育。對(duì)于酶抑制的表征，釆用Lineweaver-Burk圖(1/V對(duì)1/S),和由表觀抑制常數(shù)(Ki(app))和底物L(fēng)值之間的關(guān)系測(cè)定Ki值Ki(app)-[I]/[(v。/vi)-l]和Ki-K"app)/[(L/[S])+1〗，其中抑制濃度；(v。/vi)-分別在不存在和存在抑制劑下水解速度的比值；Kra/[S]-底物L(fēng)和底物濃度之間的比值。以下表l中總結(jié)了得到的結(jié)果表l<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實(shí)施例2:抑制白細(xì)胞體內(nèi)粘附和滾動(dòng)a)本發(fā)明的肽對(duì)白細(xì)胞的滾動(dòng)在小鼠(n-3只/組)中進(jìn)行證實(shí)抑制白細(xì)胞粘附和滾動(dòng)的測(cè)試，小鼠用戊巴比妥鈉(Hypnor，50mg/Kg)麻醉并保持在溫度控制板中(37O。實(shí)施陰嚢手術(shù)操作以暴露提睪肌，固定在板透明區(qū)周?chē)?。這定位于光學(xué)顯微鏡托架上以允許體內(nèi)顯象局部微循環(huán)。制劑保持濕潤(rùn)和用0.15MPBS(磷酸鹽緩沖液)灌注而溫暖。1i!g/mL濃度的炎性試劑LPS(脂多糖)稀釋至20nL局部應(yīng)用于提睪肌。應(yīng)用LPS(脂多糖)前后記錄次毛細(xì)血管小靜脈的狀況。應(yīng)用LPS后，局部應(yīng)用肽SeqOl至Seq09(lpM)15分鐘。觀察前和次毛細(xì)血管小靜脈、小動(dòng)脈和肌纖維事件30分鐘。記錄在直徑20-40pM之間的次毛細(xì)血管處小靜脈白細(xì)胞滾動(dòng)、堅(jiān)固粘附和滲出并以1分鐘間隔定量IO分鐘的時(shí)間。遷移定義為延伸IO(VM—段的血管外組織中白細(xì)胞的數(shù)量。用外照明技術(shù)使用活體內(nèi)熒光顯微鏡分析提睪肌微循環(huán)(AxioImagerAl，CarlZeiss,Germany),如Sperandio等(J.Exp.Med.，19;197(10):1355-1363，2003)所述。檢測(cè)的肽誘導(dǎo)小鼠提睪肌次毛細(xì)血管小靜脈中白細(xì)胞滾動(dòng)減少大約50到90%，如圖2所看到的。b)修飾肽第1、2和3位缺失氨基酸對(duì)白細(xì)胞的滾動(dòng)。用修飾肽(Mod-3)重復(fù)上面的檢測(cè)，其中第1、2和3位氨基酸被去掉，如下表示SeqOlHei-Pro2-Arg3-C'ys4-Arg5-Lys6-Met7-Pro8"Gly9-Valio-Lysii-Meti2-C^si31—---!這種修飾的目的是證實(shí)由存在于第4和13位的半胱氨酸殘基的硫醇基之間的二硫鍵產(chǎn)生的環(huán)狀結(jié)構(gòu)對(duì)于本發(fā)明肽抗炎活性的必要性。已經(jīng)除去氨基酸的肽與本發(fā)明描述的肽相比，對(duì)白細(xì)胞滾動(dòng)保持抑制活性，如圖2所見(jiàn)。c)第ll位Lys的置換對(duì)本發(fā)明的肽活性的影響重復(fù)修飾肽(ModLysM")對(duì)于白細(xì)胞滾動(dòng)的檢測(cè)，如實(shí)施例2所述，其中本發(fā)明一個(gè)肽的第11位賴(lài)氨酸被丙氨酸(與賴(lài)氨酸具有相反性能的氨基酸)置換，以測(cè)定Lysn殘基對(duì)于本發(fā)明肽活性的必要性，如下表所示S叫Olr■'■-----........■,N1'■-1Ilel-Pro2-Arg3-Cys4-Arg5-Lys6-Met7-Pro8-Gly9-Vallo-Lysll-Metl2-Cysl3nel-pr02-Arg3-cs4-Arg5-Lys6-Met7-pr08-Gly9-vallcrAla"-Metl2-c^s13修飾肽(ModLys/Au)與肽Seq07相比不能有效抑制白細(xì)胞滾動(dòng)，如圖3所見(jiàn)，證明Lysu的存在對(duì)于保持藥理活性的重要性。實(shí)施例3:預(yù)防LPS誘導(dǎo)的腹膜炎在腹膜內(nèi)注射稀釋于500pL無(wú)菌鹽水溶液的LPS(055:BR20pg/mL，Sigma)前30分鐘，給小鼠腹膜內(nèi)注射溶于500pl無(wú)菌鹽水溶液的4nmol或40nmolSeq07鑒定的肽。僅注射無(wú)菌鹽水的動(dòng)物考慮作為對(duì)照。LPS注射后24小時(shí)，用高劑量水合氯醛殺死動(dòng)物，以洗滌腹腔，計(jì)算細(xì)胞(A)、嗜中性白細(xì)胞(B)和巨噬細(xì)胞(C)數(shù)目。從腹膜去掉的物質(zhì)以1500rpm4X:離心10分鐘，分離上清并冷凍于-20T用于進(jìn)一步分析，同時(shí)含有細(xì)胞的殘留物質(zhì)重懸于含0.1%BSA的PBS中。計(jì)算Neubauer室中的總數(shù)。對(duì)于白細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)，將等份細(xì)胞懸浮液置于玻片上并離心(Citospin)，用Hema3染色和在光學(xué)顯微鏡下研究，計(jì)數(shù)總共300個(gè)細(xì)胞。用樣品柱中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞總數(shù)乘以百分比獲得每個(gè)細(xì)胞群的絕對(duì)數(shù)量。在測(cè)試的肽的兩個(gè)濃度(4nmol和40nmol)阻止LPS注射的小鼠腹腔中接近于50%的白細(xì)胞募集(與對(duì)照相比)。研究圖4還可以證實(shí)肽阻止嗜中性白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞募集。實(shí)施例4:抑制急性和慢性肺過(guò)敏性和炎癥反應(yīng)在第0和7天，用吸附于l，6mg氫氧化鋁上的1°/。卵清蛋白(OVAV級(jí)，lOpg,sigma)免疫7周齡雄性BALB/c小鼠，觀察到誘發(fā)了急性肺哮喘。第14天后，動(dòng)物接受1%OVA煙霧劑攻擊，每周三次。免疫且僅僅用PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)攻擊的動(dòng)物認(rèn)為是對(duì)照。為誘導(dǎo)慢性哮喘，連續(xù)三周每周三次攻擊動(dòng)物。對(duì)于煙霧劑攻擊，動(dòng)物處于配備有超聲噴霧器(US-800，ICEL)的密閉塑料箱內(nèi)并暴露著吸入2mL含1。/。卵清蛋白溶液(V級(jí)，Sigma))的鹽水20分鐘。最后一次煙霧劑攻擊后24小時(shí)，用高劑量水合氯醛殺死動(dòng)物獲得外周血，支氣管肺泡灌洗(BAL)和肺組織以計(jì)算白細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞總數(shù)。每次攻擊之前，用Seq07鑒定的4認(rèn)ol或40nmol肽處理動(dòng)物組，鼻內(nèi)和腹膜內(nèi)處理30分鐘，和每次攻擊前經(jīng)口處理1小時(shí)。每次攻擊之前，僅僅用Seq07鑒定的4nmol或40nmol肽腹膜內(nèi)處理慢性哮喘動(dòng)物組30分鐘。為達(dá)到BAL,用10y。水合氯醛殺死兩組(0VA處理或?qū)φ?動(dòng)物，除去血液，和將套管放入氣管。用lmL等分HBSS(Hanks平衡鹽溶液)+EDTA(乙二胺四乙酸)洗滌氣道三次。收集后，BAL立即在800rpm離心10分鐘，丟棄上清液，和細(xì)胞塊重懸于1mLHBSS+0.1%BSA(牛血清清蛋白)以計(jì)算細(xì)胞。計(jì)算Neubauer室中來(lái)自BAL的全部細(xì)胞。在載玻片上離心含5x105個(gè)細(xì)胞的等分，使用冷凍離心，以600rpm5分鐘。為測(cè)定不同細(xì)胞群的百分比，用Hema3對(duì)玻片進(jìn)行染色和計(jì)算隨機(jī)選擇區(qū)域中的300個(gè)細(xì)胞。用樣品柱中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞總數(shù)乘以百分比獲得BAL中每個(gè)細(xì)胞群的絕對(duì)數(shù)量。用4nmol或40nmol檢驗(yàn)肽以全部給藥途徑治療表現(xiàn)出急性哮喘的動(dòng)物引起向肺泡腔募集的白細(xì)胞總數(shù)減少。這個(gè)降低的特征為嗜酸性粒細(xì)胞不存在，如圖5可以證實(shí)。檢驗(yàn)肽對(duì)細(xì)胞募集至肺的影響類(lèi)似于口服0.3mg/Kg劑量地塞米松誘發(fā)的作用。用4nmol或40nmol檢驗(yàn)肽腹膜內(nèi)治療表現(xiàn)出慢性哞喘的動(dòng)物引起向肺泡腔募集的白細(xì)胞總數(shù)減少，嗜酸性粒細(xì)胞減少，如圖6可以證實(shí)。檢驗(yàn)肽對(duì)細(xì)胞募集至肺的影響類(lèi)似于口服O.3mg/Kg劑量地塞米松誘發(fā)的作用。18權(quán)利要求1.合成的環(huán)肽，其特征在于包含13個(gè)氨基酸，在肽鏈的第4位和第13位呈現(xiàn)氨基酸半胱氨酸而第11位呈現(xiàn)氨基酸賴(lài)氨酸，并且第4和13位的半胱氨酸殘基的硫醇基之間呈現(xiàn)二硫鍵，具有抗炎和/或抗過(guò)敏的活性。2.根據(jù)權(quán)利要求1的肽，其特征在于包含選自下組的共有序列11e「Pro2-Arg3-Cys4-Arg「Lys6-Met7-Pro8-Gly9-Val-10"LySi「Metu-CySi3(Seq.IDNo,1)Vali-Glu2-Gln3-CysrThr5-Ile6-Ile「Gly「Asp9-GluK)-Lysii-Aspi2-Cys13(Seq.IDNo.2)Vali-Glu2-Gln3-Cys4-Thr5—Ile6-Ile7—Gly8—Asp9—Ala1Q-Lysn-Aspi2-Cys13(Seq.IDNo.3)Va1廣G1n廠G1n3-CysrSer「G1u「I1e7-A1a「G1y廠A1a-10-Lysu-Pro12-Cys13(Seq.IDNo,4)Leu「His「Arg廣Cys4-Asps-Lys6-11e7-A1a「Asp9—A1a-mHLySn-Prou-Cysu(Seq.IDNo.5)Ile「Pro2-Arg3_Cys4-Arg5-Ala6-Met「Pro8-Gly9-Val-K)-LySi廣Meti2-Cysi3(Seq,IDNo.6)Ile「Pro2-Arg3-Cys4-Arg5~Lys6-Met7-Pro「Gly9-Val-,Lysu-Met!廣Cys^NH2(Seq.IDNo.7)Ac-Ile廣Pro2-Arg3—Cys4-Arg5-Lys6-Met「Pro「Gly9-Val-『LySn-Meti2-Cysi3(Seq,IDNo,8)Ac-Ile廣Pro2-Arg「Cys4-Arg5-Lys6-Met7-Pro「Gly9-Va卜i。-LySn-Met,Cys^冊(cè)2(Seq.IDNo.9)3.根據(jù)權(quán)利要求1的肽，其特征在于氨基酸是L-氨基酸的事實(shí)。4.根據(jù)權(quán)利要求2的肽，其特征在于脯氨酸殘基逐一、間隔或組合被羥脯氨酸殘基取代的事實(shí)。5.根據(jù)權(quán)利要求2的肽，其特征在于甲硫氨酸殘基逐一、間隔或組合被氧化甲硫氨酸殘基取代的事實(shí)。6.根據(jù)權(quán)利要求2的肽，其特征在于L-氨基酸逐一、間隔或組合被D-氨基酸取代的事實(shí)。7.根據(jù)權(quán)利要求1或2的肽，其特征在于是抗炎和/或抗過(guò)敏性的。8.根據(jù)權(quán)利要求1或2的肽，其特征在于是抗哞喘的。9.根據(jù)權(quán)利要求l的肽，其特征在于是胰蛋白酶抑制劑。10.藥物組合物，其特征在于含有權(quán)利要求1或2的肽，單獨(dú)或與至少兩種所述肽或它們的藥物可接受鹽組合，和一種或多種藥物可接受賦形劑，其中該肽以治療或預(yù)防急性和/或慢性炎癥和/或過(guò)敏性病癥的有效量存在。11.根據(jù)權(quán)利要求10的藥物組合物，其特征在于經(jīng)口、鼻內(nèi)、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥。12.權(quán)利要求1或2描述的至少1個(gè)肽的用途，其特征在于用于制備治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物的急性和/或慢性炎癥和/或過(guò)敏性疾病、哮喘、鼻炎、關(guān)節(jié)炎、異位性皮炎、免疫系統(tǒng)病癥、免疫反應(yīng)過(guò)程中淋巴細(xì)胞功能障礙、腫瘤、細(xì)胞粘附和/或寄生蟲(chóng)病的藥物。13.—種治療或預(yù)防急性和/或慢性炎癥和/或過(guò)敏性病癥的方法，其特征在于包括將有效量的至少一種權(quán)利要求1或2的肽給予哺乳動(dòng)物的步驟。14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其特征在于該肽經(jīng)口、鼻內(nèi)、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥的事實(shí)。全文摘要本發(fā)明涉及合成的環(huán)肽，其一級(jí)結(jié)構(gòu)含有13個(gè)L-氨基酸的序列，呈現(xiàn)出抗炎和抗過(guò)敏的活性，可用于治療急性或慢性炎癥和/或過(guò)敏癥，尤其是可用于治療急性或慢性過(guò)敏性哮喘。本發(fā)明還描述了含有所述肽的藥物組合物、其用途和治療或預(yù)防急性和/或慢性炎癥和/或過(guò)敏性病癥的方法。文檔編號(hào)C07K7/64GK101511861SQ200780031898公開(kāi)日2009年8月19日申請(qǐng)日期2007年7月19日優(yōu)先權(quán)日2006年7月21日發(fā)明者丹尼爾·皮曼塔,卡拉·希爾瓦,卡迪亞·康塞西奧,莫尼卡·費(fèi)雷拉,費(fèi)爾南達(dá)·普爾塔羅,馬里利恩·德馬斯申請(qǐng)人:克里斯泰利亞化學(xué)藥物產(chǎn)品有限公司;圣保羅國(guó)情研究援助基金會(huì);莫尼卡·費(fèi)雷拉