專利名稱：：將碳水化合物或聚環(huán)氧烷與肽共價(jià)連接的方法、用于該方法的前體及所得產(chǎn)物的制作方法將碳水化合物或聚環(huán)氧烷與肽共價(jià)連接的方法、用于該方法的前體及所得產(chǎn)物本發(fā)明涉及將碳水化合物或聚環(huán)氧烷與肽共價(jià)連接以形成糖肽樣化合物的方法，該方法中使用的前體化合物以及所得的產(chǎn)物。糖肽在自然界中廣泛存在。許多激素是糖蛋白，并且在細(xì)胞壁中也可發(fā)現(xiàn)糖蛋白。天然存在的糖肽具有一個(gè)或多個(gè)碳7jC化合物基團(tuán)，其通過氨基酸側(cè)鏈直接附著到肽上。將碳水化合物中第一個(gè)糖與Jl^酸側(cè)鏈連接的鍵是糖苷鍵。糖肽中天然存在的糖苷鍵的兩種一般類型為O-糖苷鍵和N-糖苷鍵，這取決于氨基酸中與碳7jc化合物中的第一個(gè)糖結(jié)合的原子是o(如絲氨酸或蘇氨酸中)還是N(如天冬酰胺中)。碳水化合物與蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的附著稱為"糖基化"。糖蛋白中碳水化合物的生物功能尚不完全清楚。已知寡糖附著到蛋白鏈上會(huì)改變其疏水性。另外，已經(jīng)提出，肽與寡糖之間的空間相互作用可能有利于一種折疊方式(相對(duì)于另一種折疊方式而言)。還發(fā)現(xiàn)，去糖基化蛋白質(zhì)(即已經(jīng)去除了糖部分的天然存在的糖肽)與其糖基化類似物相比通常不能在體內(nèi)長(zhǎng)期存在。某些天然存在的糖蛋白在動(dòng)物中僅極少量產(chǎn)生。這樣的蛋白質(zhì)的實(shí)例包括哺乳動(dòng)物的腎中產(chǎn)生的促紅細(xì)胞生成素(EPO)。EPO是在稱為"紅細(xì)胞發(fā)生"的過程中產(chǎn)生紅細(xì)胞所必需的。它通過刺激骨髓中的前體細(xì)胞導(dǎo)致其分裂并分化成紅細(xì)胞而起作用。僅有極少量的天然存在EPO可以從哺乳動(dòng)物的尿中獲得。由于天然EPO難于獲取，研究者們開發(fā)了產(chǎn)生EPO的另一些方法，其中商業(yè)上最成功的方法之一使用DNA重組技術(shù)在宿主生物(如經(jīng)改造的組織培養(yǎng)系統(tǒng))中表達(dá)該蛋白而產(chǎn)生EPO。最近的研究已關(guān)注化學(xué)合成糖蛋白和糖蛋白樣結(jié)構(gòu)(而不使用重組DNA方法)，從而復(fù)制或模擬天然存在的糖蛋白或者更深入地研究糖蛋白中碳7K化合物的作用。已發(fā)現(xiàn)，化學(xué)合成具有O-和N-糖普鍵的糖蛋白十分困難，這是因?yàn)樵谔烊淮嬖诘奶请闹信c氨基酸中的"O"或"N"相連接的糖中的碳是手性的，所以連接特定氨基酸與糖的任何方法應(yīng)理想地具有立體選擇性并在該碳中心處復(fù)制同樣的手性。另外的困難常來自于寡糖所需的大量保護(hù)和去保護(hù)。已發(fā)現(xiàn)，某些聚合鏈可以代替碳水化合物或與其一起附著到肽骨架上，所得糖肽樣結(jié)構(gòu)成功地模擬了天然存在的糖基化類似物。一種這樣的聚合鏈?zhǔn)蔷垡叶?PEG)。附著有聚乙二醇鏈的糖蛋白模擬物的實(shí)例參見國(guó)際專利>^開WO01/02017和EP1064951A2。這些文獻(xiàn)均公開了"聚乙二醇化(PEGylation)"，即使用多種類型的接頭將PEG附著到EPO肽上(除了已存在的碳水化合物基團(tuán)以外)。PEG化的EPO模擬物的完整化學(xué)合成7〉開于ChemistryandBiology,第12巻，371-383,2005年3月，以及Science,第299巻，884-887，2006年3月。與天然發(fā)生相似地通過肝鍵將多種PEG鏈附著到了肽骨架上。Deiters等在5,Vwg.M^/.CAe附.丄e汰14(2004)5743-5745中公開了在酵母中表達(dá)含有非天然氨基酸(對(duì)-疊氮苯丙氨酸)之蛋白質(zhì)然后將該氨基酸的疊氮基團(tuán)與含有炔的PEG基團(tuán)連接的方法。該方法盡管允許PEG基團(tuán)與蛋白質(zhì)進(jìn)行位點(diǎn)特異性附著，然而其缺點(diǎn)在于需要在生物體中表達(dá)蛋白質(zhì)。因此，將該技術(shù)應(yīng)用于其它目的蛋白質(zhì)是非常困難的。對(duì)PEG化的糖肽模擬物已取得了一定成功，而對(duì)附著有糖的糖肽進(jìn)行的開發(fā)卻很有限。這部分地由于使用PEG操作筒便所致，因?yàn)樗恍枰堑谋Ｗo(hù)和去保護(hù)，也不具有使合成進(jìn)一步復(fù)雜化的手性中心。因此，需要開發(fā)將碳水化合物附著到肽上的方法，以允許深入研究糖肽的化學(xué)和生物學(xué)特性。以高產(chǎn)率化學(xué)合成肽的最常用方法是固相合成。在固相合成中，通過向延伸的肽鏈上一次加入一個(gè)氨基酸來構(gòu)建肽鏈。所述肽鏈的C端可移除地附著在固相支持物上，每個(gè)新肽都加入至肽鏈的N端。固相合成方法有兩種類型"FMOC"合成法和"tBOC"合成法，這種命名是因?yàn)樵谒鲭牡腘端分別使用"FMOC"和"tBOC"保護(hù)基。這些保護(hù)基在每個(gè)氨基酸連接到固相上已存在的肽鏈上之前被除去。已發(fā)現(xiàn)Fmoc合成法通常更適用于包含翻譯后修飾(如糖基化和磷酸化)的肽。使用BOC化學(xué)法組裝的肽通常用HF(氟化氫)切除，這與酸不穩(wěn)定性糖苷鍵不相容。固相合成可用于有效地構(gòu)建具有多至約50個(gè)氨基酸的肽，而對(duì)于超過50個(gè)氨基酸的肽，所構(gòu)建肽的產(chǎn)率非常低以致于無法商業(yè)化。為了獲得更長(zhǎng)的肽鏈，已開發(fā)了一種稱為"自然化學(xué)連接(nativechemicalligation,NCL)"的技術(shù)；該技術(shù)用于將肽鏈偶聯(lián)在一起。它需要一種肽在C端具有硫酯，另一種肽在其N端具有半胱氨酸。說明該偶聯(lián)的一個(gè)反應(yīng)實(shí)例顯示如下。因此，在使用化學(xué)合成技術(shù)進(jìn)行的糖肽產(chǎn)生中，任何技術(shù)都有必要與固相合成和自然化學(xué)連接相容。換言之，如果在固相合成期間^使用特定連接將糖部分與肽鏈化學(xué)鍵合，則所使用的連接在進(jìn)行進(jìn)一步固相合保護(hù)條件)都不應(yīng)斷裂。所形成的連接必須能夠承受其在固相合成(特別是FMOC固相合成)中可能接觸的酸性和堿性條件。另外，它們必須能夠承受自然化學(xué)連接中用于形成肽-肽鍵的條件。例如，盡管現(xiàn)有技術(shù)中的某些糖-肽連接包括二硫鍵，但發(fā)現(xiàn)這些連接在自然化學(xué)連接條件下易發(fā)生降解。本發(fā)明人先前公開了使用糖基碘乙酰胺將糖附著至合成肽鏈的半胱氨酸殘基上的方法，該方法適用于肽的Fmoc固相合成和自然化學(xué)連接(Macmillan等，Ze汰2002，4，(9)，1467-1470)。該方法特別適用于合成具有多個(gè)半胱氨酸殘基的肽，其中每個(gè)半胱氨酸在最終肽產(chǎn)物中具有不同的作用，例如，一個(gè)半胱氨酸可用于附著糖，另一半胱氨酸可用于形成二硫鍵。本文所述的合成肽鏈包含兩個(gè)半胱氨酸基團(tuán)，其中只有一個(gè)基團(tuán)是待附著糖的。每個(gè)半胱氨酸基團(tuán)的硫原子都附著到互不干擾的(orthogonal)保護(hù)基上(每個(gè)硫原子上附著不同的保護(hù)基，從而每個(gè)保護(hù)基可以獨(dú)立于其它保護(hù)基而被去除)。糖基碘乙酰胺通常難于制備，這是因?yàn)樵谄渲苽渲?，其合成工藝需要?dú)浠约半S后的酰化。它們通常對(duì)進(jìn)一步的操作(例如添加另外的糖)是不穩(wěn)定的，因?yàn)樗鼈儤O易被親核體攻擊并且對(duì)光不穩(wěn)定。本發(fā)明的目的在于克服或減輕與現(xiàn)有技術(shù)有關(guān)的至少一些問題。因此，在第一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了用于與肽連接的化合物，該化合物具有式I結(jié)構(gòu)S-L-Hal式I其中，S-是式II的部分或聚環(huán)氧烷鏈?zhǔn)絀II，Hal是Br或I;其中Ri和R3獨(dú)立地選自H和Ac,R4為Ac，Rs和R6獨(dú)立地選自H和Me，n為l至3;R2是選自以下的基團(tuán)H、任選地保護(hù)的單糖、任選地保護(hù)的多糖、Ac以及式IV的基團(tuán)，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>式IV其中，R7和R8各自獨(dú)立地選自任選地保護(hù)的單糖和任選地保護(hù)的多糖，A、B、C和D各自獨(dú)立地為1或2，m為1至5。在第二個(gè)方面中，本發(fā)明提供了合成本發(fā)明第一方面中化合物的方法，該方法包括在合適的催化劑存在下，將式V化合物與式VI化合物接觸，S-N3式VHOC-Lp-Hal式VI,其中s如第一方面中的定義，丄P-是式VII的部分<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>式VII其中，R5、R6、n和Hal如本發(fā)明第一方面中的定義。在第三個(gè)方面中，本發(fā)明提供了式I化合物(S-L-Hal)在合成糖肽中的用途，其中S選自任選地保護(hù)的單糖、任選地保護(hù)的多糖、式II基團(tuán)(其中R2為如上定義的式IV基團(tuán))以及聚環(huán)氧烷鏈。在第四個(gè)方面中，本發(fā)明提供了式S-L-X-P的糖肽，其中S選自任選地保護(hù)的單糖、任選地保護(hù)的多糖、式II的基團(tuán)(其中Rz為如上文所定義的式IV基團(tuán))以及聚環(huán)氧烷鏈，L是如本發(fā)明第一方面所定義的部分，P為包含在其側(cè)鏈具有X原子的至少一個(gè)氨基酸的肽鏈，其中X為氧或硫原子或者-CHr部分。在第五個(gè)方面中，本發(fā)明提供了合成如本發(fā)明第四方面所定義之糖肽的方法，該方法包括在堿存在下，將式H-X-P的肽與式S-L-Hal的化合物接觸以形成S-L-X-P，其中X、P、S和L如上文所定義。在第六個(gè)方面中，本發(fā)明提供了合成如本發(fā)明第四方面所定義之糖肽的方法，該方法包括在合適的催化劑存在下，將式S-Ns的化合物與式HCeC-Lp-X-P的化合物接觸，其中S、L、X和P如上文所定義。在第七個(gè)方面中，本發(fā)明提供了合成式HCeC-Lp-X-P之化合物的方法，其中-lZ-和P如第二方面所定義，并且其中X為氧或硫原子，該方法包括將在其側(cè)鏈上具有至少一個(gè)X原子的氨基酸與式HCEC-Lp-Hal的化合物接觸以形成HC三C-LP-X-官能化的氨基酸，其中Hal是Br或I，并在肽鏈裝配中使用所述官能化的氨基酸來形成HCeC-Lp-X-P。在第八個(gè)方面中，本發(fā)明提供了合成式HOC-Lp-X-P之化合物的方法，其中-lZ-和P如第二方面所定義，其中X為氧或硫原子，該方法包括提供肽鏈P，其中P為包含在其側(cè)鏈具有X原子的至少一個(gè)氨基酸的肽鏈，其中X為氧或硫原子，以及將所述肽鏈與式HC三C-lZ-Hal之化合物接觸以形成HC三C畫lZ-X國(guó)P，其中Hal為Br或I。本發(fā)明的一些優(yōu)選特征可見于下述說明書以及從屬權(quán)利要求中。上述方面中以及下文中的"糖肽"意指通過接頭部分附著有一個(gè)或多個(gè)糖或聚環(huán)氧烷基團(tuán)的肽。本發(fā)明人出人意料地發(fā)現(xiàn)，如上定義的-L-部分為糖/聚環(huán)氧烷鏈與肽的氨基酸側(cè)鏈上氧或硫原子(例如半胱氨酸的硫原子)之間提供了非常穩(wěn)定的連接，其穩(wěn)定程度足以承受肽在固相合成和自然化學(xué)連接期間(包括添加和去除保護(hù)基)通常經(jīng)受的所有條件。已發(fā)現(xiàn)，可用于本發(fā)明的前體(例如疊氮化物(如本文所定義的S-N3))容易制備得多、對(duì)光穩(wěn)定，并且可能最重要的是，可適合于多種合成轉(zhuǎn)化。疊氮化物前體可與乙炔在溫和條件下(例如在水溶液中，37°C，Cu(I)離子存在時(shí))反應(yīng)，以高產(chǎn)率形成三唑基團(tuán)，而不影響附著在該疊氮化物的部分(例如糖基)上或任何肽(如果該反應(yīng)中存在的話)上可能存在的任何其它典型保護(hù)基。另外，本發(fā)明的化合物可附著至可能為任何大小的合成或重組蛋白質(zhì)中合適的氨基酸(特別是半胱氨酸)。此外，可以將大的"S"基團(tuán)附著到肽上。已發(fā)現(xiàn)，與化學(xué)合成天然存在糖肽(即如上文所述具有0-糖苷鍵和/或N-糖苷鍵的那些)的方法相比，本發(fā)明的方法是附著有寡糖或聚環(huán)氧烷鏈的肽的更高效合成途徑。就本發(fā)明人所知，所述接頭L尚未用于連接肽與糖或聚環(huán)氧烷鏈。本發(fā)明方法的優(yōu)勢(shì)還在于，它不需要在生物體中表達(dá)肽(如上文Deiters等中所述)，并因此使肽的構(gòu)建具有更高的靈活性，但仍能以合理的確定性指導(dǎo)將糖或聚環(huán)氧烷鏈附著到肽鏈上的何處。已顯示自然化學(xué)連接無法將連接位點(diǎn)附近具有大寡糖部分的糖肽與另一肽連接。相信本發(fā)明第六方面中所公開的方法可以克服這些難題，因?yàn)榭梢岳门c附著有乙炔的蛋白質(zhì)(即，式HCeC-Lp-P的蛋白質(zhì))進(jìn)行自然化學(xué)連接，并且在自然化學(xué)連接之后可以在溶液中進(jìn)行糖與疊氮化物的附著(即，與式S-N3化合物的反應(yīng))。下面將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的描述。以下各段中將更詳細(xì)地定義本發(fā)明的不同方面。除非明確說明是相反情況，否則如上文定義的每個(gè)方面都可以與任何其它方面結(jié)合。特別地，任何指明為優(yōu)選或有利的特征都可以與任何其它指明為優(yōu)選或有利的特征結(jié)合。在上文的式II中，R2可以是H或Ac?；蛘撸琑2可以是任選地保護(hù)的單糖，所述單糖選自葡萄糖、葡糖胺、半乳糖、N-乙酰葡糖胺、半乳糖胺、甘露糖、巖藻糖和唾液酸。其中，任選地保護(hù)的半乳糖和葡糖胺是優(yōu)選的。R2可以是含有2至5個(gè)組成糖的任選地保護(hù)的多糖，并且其包含葡萄糖、葡糖胺、半乳糖、N-乙酰葡糖胺、半乳糖胺、甘露糖、巖藻糖和唾液酸中的一種或多種。優(yōu)選地，所述單糖或多糖的組成糖是D-糖。優(yōu)選地，所有組成糖都是P-端基異構(gòu)體。"經(jīng)保護(hù)的單糖"和"經(jīng)保護(hù)的多糖"意指組成糖的每個(gè)氧原子(其游離態(tài)時(shí)為羥基)都與保護(hù)基結(jié)合。所述保護(hù)基優(yōu)選為乙酰基(Ac)。如果R2是糖，則優(yōu)選該糖與式I中N-乙酰葡糖胺之間的鍵為1,4，連接。在每個(gè)多糖中，優(yōu)選每個(gè)組成糖之間的連接為1，4，連接。R2可以是式IV的部分。優(yōu)選地，A和/或B為1。如杲C或D是2，則式IV可分別包含兩個(gè)R7或Rg基團(tuán)。如果式IV包含兩個(gè)R7基團(tuán)，則這兩個(gè)R7基團(tuán)可以是不同的，但優(yōu)選是相同的。同樣地，如果式IV包含兩個(gè)Rs基團(tuán)，則這兩個(gè)Rs基團(tuán)可以是不同的，但優(yōu)選是相同的。R7與Rs可以相同或不同。R2可以是式IVA的部分其中，R7和R8各自獨(dú)立地選自任選地保護(hù)的單糖和任選地保護(hù)的多糖，m為1至50R7和/或Rs可以是含有2至5個(gè)組成糖的任選地保護(hù)的多糖，并且其包含葡萄糖、葡糖胺、半乳糖、N-乙酰葡糖胺、半乳糖胺、甘露糖、巖藻糖和唾液酸中的一種或多種。R7和/或R8可以是任選地保護(hù)的二糖，其包含葡萄糖、葡糖胺、半乳糖、半乳糖胺、甘露糖、巖藻糖和唾液酸中的一種或多種。R7和/或Rs可以是含有N-乙酰葡糖胺和半乳糖的二糖，其中半乳糖是該二糖的末端糖組分。在式III中，優(yōu)選n為3。"聚環(huán)氧烷鏈"優(yōu)選地包括聚環(huán)氧乙烷鏈。所述聚環(huán)氧乙烷鏈可包含450至卯0個(gè)環(huán)氧乙烷單元，優(yōu)選500至800個(gè)環(huán)氧乙烷單元，更優(yōu)選650至700個(gè)環(huán)氧乙烷單元。在第二和第六方面的方法中，所述催化劑優(yōu)選包括Cu(I)或Cu(II),優(yōu)選Cu(I)。所述方法可包括在還原劑存在下提供含有Cu(II)的物質(zhì)(例如硫酸銅)以原位形成Cu(I)，從而催化疊氮化物與乙炔基之間的反應(yīng)。所述還原劑優(yōu)選包括抗壞血酸鈉，并任選地包括三羧基乙基膦(TCEP)?；蛘?，可以將含Cu(I)的化合物(如CuI或CuBr)加至反應(yīng)混合物中。本發(fā)明中使用的環(huán)氧烷疊氮化物是已知的。可以如rwm/^^wi44(6)2003,1133-1135和C7i麵cfl/CV附腦w/ca"Vms,2006，1652-1654所述對(duì)其進(jìn)行合成。在本發(fā)明的第三個(gè)方面中，S-可以如上文所述。在本發(fā)明的第三個(gè)方面中，所述糖肽中肽鏈的至少一部分可以使用固相合成和/或自然化學(xué)連接來合成。優(yōu)選地，肽中將附著一個(gè)或多個(gè)S-L-部分的部分將使用固相合成來合成，優(yōu)選使用FMOC固相合成?？梢栽谕ㄟ^接頭L將S-部分與肽鏈結(jié)合之前或之后進(jìn)行自然化學(xué)連接。所述第四個(gè)方面提供了式S-L-X-P的糖肽，如上所述。其中所述至少一個(gè)氨基酸優(yōu)選為半胱氨酸或高半胱氨酸。所述肽鏈可包含側(cè)鏈上具有X原子的兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸，每個(gè)氨基酸上各附著式S-L-的部分)。例如，一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)S-L基團(tuán)可以通過氨基酸的X基團(tuán)與肽P結(jié)合。所述肽可在其N端包含半胱氨酸和/或在其C端包含疏酯，以用于使用自然化學(xué)連接附著至第二肽和/或第三肽。所述第二肽和/或第三肽可以是合成肽(例如通過固相合成制得的肽)或者在生物體中使用重組:故術(shù)制得的肽。在本發(fā)明的糖肽中，S優(yōu)選如本發(fā)明第一方面所定義。已發(fā)現(xiàn)，這樣的糖肽能夠模擬天然存在的N-連接糖蛋白類，即糖通過N-糖苷鍵附著到肽上的蛋白質(zhì)。所述糖肽可以是圖2所示的肽(化合物12或13中的任一個(gè))或者圖3所示的肽(化合物14)。本發(fā)明第五個(gè)方面中的堿可包含二異丙基乙胺、吡啶和三乙胺中的一種或多種。所述第五和第六個(gè)方面中的方法可以在所述肽P附著在固體支持物(用于在固相合成中合成肽)上時(shí)或者在溶液中時(shí)進(jìn)行。所述S分子可以與任意長(zhǎng)度以及任意序列的肽結(jié)合，只要該肽中相應(yīng)的反應(yīng)基團(tuán)(例如HX-基團(tuán)，如半胱氨酸中的HS-)對(duì)于反應(yīng)來說可用即可。優(yōu)選的固體支持物包括NovasynTGT、PEGA和fink酰胺樹脂。所述第五和第六個(gè)方面的方法還可包括在固相合成中合成所述肽的第一步驟，所述合成可包括合成期間對(duì)該肽的N端進(jìn)行FMOC或tBOC保護(hù)。固相中合成的肽可以具有與天然存在糖肽的至少一部分基本相同的氨基酸序列，只是天然糖肽中將與糖基結(jié)合的氨基酸相反地是任選地保護(hù)的半胱氨酸或高半胱氨酸(必要時(shí)，可以用半胱氨酸取代天然序列中其它氨基酸之一以形成該肽鏈的N端，以用于自然化學(xué)連接)。如果固相中合成的肽僅僅是天然存在糖肽的一部分(除了半胱氨酸或高半胱氨酸替換以外)，則可以使用諸如自然化學(xué)連接等技術(shù)將天然存在肽序列的其余部分與其結(jié)合，這可以在將S-L-部分附著至固相中合成的肽的取代半胱氨酸或高半胱氨酸之前或之后進(jìn)行。該肽的所述其佘部分可使用固相合成來合成和/或使用技術(shù)人員已知的重組技術(shù)在生物體中表達(dá)。在固相合成中合成的肽鏈優(yōu)選在其N端包含任選地保護(hù)的第一半胱氨酸殘基(用于在自然化學(xué)連接中將該肽與另一肽連接)，以及任選地保護(hù)的一個(gè)或多個(gè)其他半胱氨酸或高半胱氨酸殘基(用于附著一個(gè)或多個(gè)S-L-部分)。優(yōu)選地，在固相合成的肽構(gòu)建期間對(duì)所有半胱氨酸/高半胱氨酸殘基進(jìn)行保護(hù)。優(yōu)選地，所述第一半胱氨酸(在N端)上的保護(hù)基與該肽中所述一個(gè)或多個(gè)其他半胱氨酸或高半胱氨酸殘基上的保護(hù)基不同。所述第一半胱氨酸的保護(hù)基可包含Trt基團(tuán)。所述一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸或高半胱氨酸殘基的保護(hù)基可包含烷基硫基團(tuán)，優(yōu)選-S-tBu基團(tuán)。可以對(duì)所構(gòu)建的肽(其包含經(jīng)保護(hù)的N端半胱氨酸和經(jīng)保護(hù)的一個(gè)或多個(gè)其他半胱氨酸或高半胱氨酸殘基)進(jìn)行處理，以除去該一個(gè)或多個(gè)其他半胱氨酸或高半胱氨酸殘基的保護(hù)基，但不除去N端半胱氨酸的保護(hù)基。如果所述一個(gè)或多個(gè)其他半胱氨酸/高半胱氨酸基團(tuán)的保護(hù)基包含-S-tBu基團(tuán)，則優(yōu)選通過使該肽接觸二硫蘇糖醇和DIPEA和/或碳酸銨、DTT和丙二硫醇中的一種或多種來除去保護(hù)基。然后，可以將去保護(hù)的所述一個(gè)或多個(gè)其他半胱氨酸/高半胱氨酸殘基與以下化合物反應(yīng)(i)一個(gè)或多個(gè)HOC-Lp-HaI化合物，以形成與一個(gè)或多個(gè)乙炔基各通過1/連接的肽(所得的肽表示為HCeC-Lp-P)，或者(ii)一個(gè)或多個(gè)S-L-Hal化合物，以形成附著有一個(gè)或多個(gè)S-L-部分的肽，其中每個(gè)S-L部分均附著至半胱氨酸/高半胱氨酸(所得的肽表示為S-L-X-P)。所述肽HOC-I/-X-P可以進(jìn)一步與化合物S-N3反應(yīng)，以形成附著有一個(gè)或多個(gè)S-L-部分的肽，其中每個(gè)S-L部分均附著至半胱氨酸/高半胱氨酸殘基(所得的肽表示為S-L-X-P)。然后，可使用常規(guī)技術(shù)將所得的肽從固體支持物上移除?？墒褂贸Ｒ?guī)技術(shù)，通過自然化學(xué)連接將從固體支持物移除的上述(i)或(ii)中形成的蛋白質(zhì)與具有C端硫酯的另一蛋白質(zhì)組合。這樣的技術(shù)描述于5Wert"2003，299，(5608)，884-887以及以下實(shí)施例中。自然化學(xué)連接可以在鹽酸胍、巰基乙烷磺酸(MESNA)和三羧基乙基膦(TCEP)存在下進(jìn)行。所述另一蛋白質(zhì)也可以是合成蛋白質(zhì)或者使用重組技術(shù)得到的蛋白質(zhì)。肽HCeC-Lp-X-P可以通過將經(jīng)過適當(dāng)保護(hù)且官能化的氨基酸(其包含HC三C-LP部分)直接摻入肽合成中來合成，例如摻入Fmoc固相合成中。例如，可以將側(cè)鏈上具有X原子的氨基酸基團(tuán)(其中X是氧或硫原子)與HOC-Lp-Hal反應(yīng)，以形成HC三C-lZ-X-官能化的氨基酸。然后，將該經(jīng)官能化的氨基酸用于肽鏈裝配中，以形成HC三C畫I/-X-P。當(dāng)通過直接摻入經(jīng)適當(dāng)保護(hù)且官能化的氨基酸(其包含HOC-Lp-部分)來合成肽HC=C-LP-X-P時(shí)，HC三C-LP-部分可通過-CHr部分與氨基酸側(cè)鏈連接，即X可以是-CHr。通過本發(fā)明的新型連接附著有PEG或糖的類似于促紅細(xì)胞生成素的肽序列的一個(gè)合成實(shí)例可以為如下。有關(guān)該合成各部分的更詳盡內(nèi)容可以參見實(shí)施例。經(jīng)修飾的促紅細(xì)胞生成素(EPO)的半合成目標(biāo)序列相對(duì)于野生型人EPO序列的氨基酸改變用下劃線標(biāo)出，殘基的疏原子通過-L-部分與所附著的PEG或糖鏈連接。(￡〉apprucdsrvleryiieakeaetkvnfyawkrj;evgqqavevssqp證柳hvdkavsg;lrm^aaplrtitadtfrkle"rGDR(SEQIDNo.1》c工ttgccescsl鵬工tvpdwqglallseavlrgqall！SLTTIJiRALGAQKEAISPPDVYSNFLRGKLKLYTGEACRT(C)是N端的任選殘基。一般性肽硫酯合成(殘基1-32)使用經(jīng)Rink接頭改性的氨基PEGA樹脂進(jìn)行肽硫酯合成。使用Unverzagt小組所述的策略來制備肽硫酯1。簡(jiǎn)言之，通過接觸DMF中20%的哌啶使經(jīng)rink改性的PEGA樹脂(0.1mmol)去保護(hù)。使用HBTU/HOBt作為偶聯(lián)劑對(duì)Fmoc-Phe-OH(5份)進(jìn)行偶聯(lián)。偶聯(lián)時(shí)間為4小時(shí)。在用DMF中20。/n哌啶去除Fmoc后，通過將樹脂與3-羧基丙磺酸(50mg，0.3mmol)、HOBt(40mg,0.3mmol)和DIC(47pL，0.3mmol)接觸5小時(shí)來偶聯(lián)磺酰胺接頭。然后，在4:1DCM/DMF中使用N畫曱基咪喳(40jiL，0.5mmol)、DIC(78^L，0.5mmol)作為偶聯(lián)劑將第一氨基酸(Fmoc-Ser(tBu)-OH，每次偶聯(lián)使用5份)雙偶聯(lián)16小時(shí)。使用AppliedBiosystems433A型肽合成儀自動(dòng)延伸該肽(目標(biāo)序歹寸.AMrl工cdsrvleRYLLEAKEAE￡ITTGC￡E§-SBn(§EQIDNO2"進(jìn)行延伸，最后使用成熟的方法在ICH2CN活化后用節(jié)硫醇將該肽切下2固體支持物上組裝之32聚體肽的一般性StBu去保護(hù)。將DTT(100mg)溶于無水DMF(0.9ml)中，并加入固體碳酸銨。攪拌5分鐘后，將上清液倒出并移至肽合成管中，其中含有與樹脂結(jié)合的經(jīng)StBu保護(hù)的肽。(注碳酸銨可用2.5v/v。/。二異丙基乙胺來代替)。16小時(shí)后，過濾樹脂，并用DMF繼而用DCM充分洗滌。必要時(shí)可重復(fù)進(jìn)行去保護(hù)。一般性溴/橫乙酰胺偶聯(lián)將碘/溴乙酰胺(具有式S-L-Hal)(3份)溶于DMF(2.0ml)中2.5WvO/。吡啶中，并移至肽合成管中，其中含有與樹脂結(jié)合的StBu去保護(hù)的肽(50-100mg)。使反應(yīng)在避光條件下進(jìn)行12至24小時(shí)。之后，過濾樹脂，并用DMF繼而用DCM充分洗滌。應(yīng)理解，如果合成肽HCeC-Lp-X-P是通過直接向肽鏈合成中摻入HC三C-LP-X-官能化的氨基酸而合成的，則可以省略上述一般性StBu去保護(hù)和一般性溴/橫乙酰胺偶聯(lián)步驟。一般性TFA切割和純化對(duì)在經(jīng)Rink改性的氨基PEGA樹脂上制備的擬糖肽模擬物合成進(jìn)行常規(guī)監(jiān)測(cè)，最后通過與95。/。TFA、2.5%乙二硫醇、2.5%水接觸3小時(shí)來去保護(hù)。之后，濾出樹脂，將濾液倒入乙醚(10體積)中。然后通過離心(10000rpm，5分鐘(用于分析)；3000rpm，15分鐘(用于制備))收集沉淀的肽。將沉淀物重懸于乙醚(5倍體積)中，并通過再次離心來收集。將粗制糖肽模擬物溶于30。/。MeCN/水中，并直接上樣到半制備型HPLC柱(250mmx10mm)中，經(jīng)歷50分鐘使用5%至95%乙腈(含有0.1%TFA)梯度。利用質(zhì)鐠鑒定含有糖肽產(chǎn)物的級(jí)分，并凍干以獲得呈白色+>散固體的純化產(chǎn)物。殘基33-166的生產(chǎn)方法(來自大腸桿菌)利用市售的pET16-b表達(dá)載體(Novagen)過表達(dá)Hisw融合蛋白，并按照使用說明利用鎳柱親和層析進(jìn)行純化。通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳來分析從Ni"柱獲得的各級(jí)分樣品。將級(jí)分合并，于4'C在8-10kDa臨界點(diǎn)的透析袋中以4升水過夜透析。蛋白質(zhì)形成白色沉淀，將其移至15.0mLFalcon管中并在4X:下以4000rpm離心15分鐘進(jìn)行沉淀。將所獲得的白色沉淀物重溶于80%甲酸中至約0.6mgmL"的濃度。然后將其移至10.0ml圓底瓶中，并加入5mgCNBr。然后在氬氣中避光攪拌該反應(yīng)物過夜。然后在減壓下除去甲酸，將干燥的沉淀物重懸于含有6M鹽酸胍的最小體積(150nL)結(jié)合緩沖液(100mMNaCl，50mMTrisHCl，pH8.0)中，并于37'C用lmMDDT還原45分鐘。通過LCMS來分析CNBr切割的效率。在以4升水透析過夜并以4000rpm離心15分鐘后得到作為白色沉淀物的經(jīng)切割的蛋白質(zhì)(1-3)。還可使用尿素緩沖液代替80%甲酸來進(jìn)行CNBr切割。將M^親和層析后透析得到的白色沉淀物溶于含0.3MHC1的8M尿素中，如上所述進(jìn)行與CNBr的反應(yīng)。22小時(shí)后，用lmMDDT(在用濃NaOH將pH調(diào)整為約8之后)還原上述蛋白質(zhì)樣品，并通過LCMS進(jìn)行分析。在以水過夜透析以及4000rpm離心15分鐘后得到經(jīng)切割的蛋白質(zhì)沉淀物。連接反應(yīng)的一般性方法使用由Kochendoerfer等所述方法的改良方式進(jìn)行連接3。直接使用經(jīng)切割的蛋白質(zhì)片段(來自透析的沉淀材料)。還檢測(cè)了經(jīng)HPLC純化的樣品，未見反應(yīng)產(chǎn)率或速率的明顯提高。將樣品溶于在6M鹽酸胍(pH8.0)中制備的300mM磷酸鈉鹽緩沖液中。加入三羧乙基膦(TCEP)至終濃度為20mM，加入2-巰基乙烷磺酸(MESNA)至終濃度為1%(重量/體積)。將該溶液加至合成肽硫酯的凍干等分試樣中，并在氬氣中在搖床上攪動(dòng)反應(yīng)混合物，并利用LC-MS進(jìn)行監(jiān)測(cè)。半合成促紅細(xì)胞生成素的重折疊將蛋白質(zhì)樣品還原，在氮?dú)鈿夥障乱?M鹽酸胍、50mMTris.HCl(pH8.0)進(jìn)行透析，l:50稀釋(至約1M)并通過以2%N-月桂酰肌氨酸、50mMTris.HCl(pH8.0)、40pMCuS04透沖斤來氧化性重折疊4。然后使用Centricon離心濃縮器來濃縮重折疊的蛋白質(zhì)。該合成實(shí)例的參考文獻(xiàn)1)Mezzato,S.,'Schaffrath,M.Unverzagt,C.,Anorthogonaldouble-linkerresinfacilitatestheefficientsolid-phasesynthesisofcomplex-typeglycopeptidethio^sterssuitablefornativechemicalligation.Angew.Chem.工n仁.Sd.2005,44,1650-1S54.2)Shin,If,,-Winans,K.A"Backes,B,'J.Kent,S.B.H.;Ellman,J.A.zBert022i,C.R,,Fmoc-iasedsynthesisofpeptide-(alpha)thioesters:Applicationtothetotalchemicalsynthesisofaglycoproteinbynativechemicalligation.J.Am.Chem.Socr.1999,121,(50),11684-11689,3)Kochendoerfeir,<3.G.;Chen,'S.-Y.,'Mao,F.,'Cressman,S.,.Travigrlia,S.;.Shao,H.,Hunter,C.L.;Low,D.W.,.Cagle,E.N,;Carnevali,M.'.Gueriguian,V.;Keogh,P，0".'*Porter,H.,.Stratton,S,M.,'Wiedeke,M.C.'-Wilken,J.;Tang,J.〖Levy,J.J.f.Miranda,L.P.,.Crnogorac,M.M.Kalbag,S.,'Botti,p.,'Schindlea:-Horvat,J.;Savatski,L,,.Adamsori,J.W,,'Kung,A.,'Kent,S,B.H.,'Bradburne,J.A.,DesignandChemicalSynthesisofaHomogeneousPolymer-ModifiedErythropoiesisProtein.Sci節(jié)ce2003,299,(5S08),884-887,4)Boissel,J.￡>.'Lee,W.R./Presnell,S.R.;Cohen,F.E.zBunn,H.F.,Erythropoietinstructure-functionrelationships.Mutantproteinsthattestamodeloftertiarystructure.J.Siol.Chem,1993,2S8,(21),15S83-15S93.本發(fā)明的實(shí)施方案將參考實(shí)施例和附圖進(jìn)一步闡明，其中圖1展示了節(jié)基硫醚(10)的多種合成途徑。在10的形成中，需要將疊氮化物與乙炔基團(tuán)反應(yīng)形成三唑以及將溴乙酰胺基團(tuán)與千基硫醇反應(yīng)形成硫醚連接。該反應(yīng)表明，可以在硫醚連接形成之前形成節(jié)基三唑，反之亦然。試劑和條件i)BnSH、Et3N、DMF，16h，8和9分別為84%和75%;ii)抗壞血酸鈉(1.1份)、Cu(II)S04.5H20(0.1份)、CHC13、EtOH、H20(9:1:1)，37。C,16h，91%;iii)2%(體積/體積)一水合肼，EtOH，72h，66%;圖2展示了本發(fā)明的示例化合物(5或7)與肽鏈偶聯(lián)以形成本發(fā)明的示例肽。試劑和條件i)10%(重量/體積)DTT，2.5%DIPEA，DMF，16h;ii)5或7(3份/硫醇)、2.5%(體積/體積)Et3N、DMF,16h;iii)95%TFA、2.5%乙二硫醇，25%H20，4h;iv)2%(體積/體積)一7JC合肼7JC溶液(aqueoushydrazinemonohydrate)，lh;圖3展示了圖2所示方案中產(chǎn)生的肽與另一肽(EPO殘基l-19)的自然化學(xué)連接。試劑和條件i)6M鹽酸胍、1%(重量/體積)MESNA、300mM磷酸鈉鹽緩沖液(pH8.0),10mMTCEP;ii)2°/。H2N-NH2水溶液；圖4展示了雙寡糖化合物(化合物A)的化學(xué)合成，該化合物的末端為用于附著乙炔的疊氮基團(tuán)；圖5展示了從化合物A化學(xué)合成化合物B，即由炔丙基溴乙酰胺連接到化合物A來形成三唑；圖6展示了粗制肽硫酯(EPO殘基1-19)的HPLC，其中29分鐘級(jí)分(殘基l-19-SBn)的ESI-MS的計(jì)算質(zhì)量為2320.7Da，實(shí)測(cè)質(zhì)量為2321.6Da;圖7顯示粗制化合物12(肼去保護(hù)之前)的HPLC。級(jí)分23的峰是所期望的產(chǎn)物；圖8顯示粗制化合物13(肼去保護(hù)之前)的HPLC。主峰(保留時(shí)間=23.7分鐘)是所期望的產(chǎn)物；以及圖9:化合物14的HPLC顯示保留時(shí)間為25.8分鐘的單一的主要物質(zhì)，通過ESI-MS證實(shí)其為所期望的產(chǎn)物(計(jì)算分子量-5125.6Da,實(shí)測(cè)分子量-5127.0Da)。圖10顯示純化的7V-cc-(9-藥甲氧羰基)-L-半胱氨酸-5H7V-炔丙基)羧基曱酰胺的HPLC圖譜(HPLCtrace)。圖11顯示化合物C(C56H93N13032S2)的分析數(shù)據(jù)。分子量(MW):1524.79。實(shí)測(cè)(M+l)1525.79;(M+2)763.48;(M+2+NH2NH2):779.40;(M+2+2NH2NH2):795.63。圖12顯示EPO1-28-SBn硫酯之HPLC的ESI-MS。計(jì)算m/z=實(shí)測(cè)m/z=2233.9。圖13顯示C164H268N40O84S8的ESI-MS。MW:4400.6。實(shí)測(cè)(M+3)1468.6;(M+4(+K))1111.5;(M+4)1101.7;(M+5)881.7;(M+2(糖模擬物-Ns))741.9。圖14顯示EPO(1-28)SBn硫酯(在第24位含有乙炔)與細(xì)菌來源的EPO殘基29-166之間的蛋白質(zhì)連接。實(shí)施例實(shí)施例1在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明人制備了TV-乙酰基葡糖胺(l)、殼二糖(2)和7V-乙酰基半乳糖胺(3)(均為7V-連接糖蛋白類的組分)的全乙?；拎腔B氮化物。然后，本發(fā)明人研究了它們與異雙功能接頭2-溴乙酰基炔丙基酰胺(4)結(jié)合的條件，這些糖與4的反應(yīng)在最近文獻(xiàn)中報(bào)道的條件下順利進(jìn)行，Cu(I)催化劑存在時(shí)有利于1,5-加成產(chǎn)物(表I)。該粗產(chǎn)物無需通過柱層析進(jìn)行純化。表l擬糖肽前體溴乙酰胺化合物的合成<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>a曱醇作為溶劑；b在9:1:1CHCl3/EtOH/H20溶劑中1.1份抗壞血酸鈉存在下產(chǎn)生的活性銅物質(zhì)；e經(jīng)分離的產(chǎn)率。隨后，本發(fā)明人試圖將溴乙酰胺置于肽合成和自然化學(xué)連接中通常使用的條件中，特別是將鍵連接到半胱氨酸殘基之巰基所需的條件。另外，本發(fā)明人還研究了巰基在固相上與溴乙酰胺產(chǎn)物5-7直接反應(yīng)的可能性(參見圖l)，以及半胱氨酸巰基與4的反應(yīng)，以使得其后可以在含有顯示乙炔的肽的溶液中或固相上來研究"咬合"化學(xué)反應(yīng)(即疊氮化合物與炔類的連接)。4和5與千基琉醇完全反應(yīng)，分別以84%和75%的產(chǎn)率形成模式硫醚8和9。8還與全乙?；?-乙酰氨基-2-脫氧-D-吡喃葡糖基疊氮化物完全反應(yīng)，得到產(chǎn)率為91%的9。為了確定該產(chǎn)物在通常的酸性肽切割條件下是否穩(wěn)定，將9置于95%TFA水溶液中3小時(shí)。對(duì)蒸發(fā)后粗材料的NMR分析表明并未發(fā)生分解。最后，在接觸EtOH中的2%(體積/體積)水合肼72小時(shí)后將乙酰酯全部除去，獲得完全去保護(hù)的化合物10。受初步結(jié)果的鼓勵(lì)，本發(fā)明人裝配了肽片段(11)，其序列類似于人促紅細(xì)胞生成素(殘基21-32)，再加上N端半胱氨酸殘基，并在預(yù)定位置處包含兩個(gè)以二硫鍵保護(hù)的半胱氨酸殘基(參見圖2)。使用Fmoc固相肽合成的標(biāo)準(zhǔn)操作并以自動(dòng)方式裝配該肽。通過用含有2.5%(體積/體積)DIPEA的10%(重量/體積)二硫蘇糖醇(DTT)處理在固相上將半胱氨酸殘基去保護(hù)，以暴露巰基官能團(tuán)。然后，通過將樹脂與溴乙酰胺5或7接觸而摻入TV-乙酰葡糖胺和二糖殼二糖，每個(gè)反應(yīng)中針對(duì)每巰基使用3份5或7。室溫反應(yīng)16小時(shí)后，對(duì)少量樹脂樣品的切割表明反應(yīng)已完成，因?yàn)檫@時(shí)已觀察不到起始材料。通過用95%TFA、2.5%乙二石危醇和25%H20處理樹脂4小時(shí)從而將其從固體支持物切下后，利用半制備型HPLC來純化粗產(chǎn)物，凍干并用含有5%(重量/體積)DTT的2%(體積/體積)水合肼水溶液進(jìn)行處理，從而以定量的產(chǎn)率(利用HPLC來測(cè)定)獲得完全去保護(hù)的產(chǎn)物12和13。也可以以相同的方式將溴乙酰胺6和乙炔溴乙酰胺4摻入合成肽中。然后在自然化學(xué)連接反應(yīng)中將片段13與肽硫酯偶聯(lián)。使用最近由Unverzage及其同事所述的雙接頭法(dual-linkerapproach)(J/jgdv.2004，44，1650-1654)來監(jiān)測(cè)肽硫酯(對(duì)應(yīng)于人促紅細(xì)胞生成素殘基1-19)的構(gòu)建及其從固體支持物的釋放。在連接反應(yīng)中，在室溫下將等摩爾量的每種肽在0.25ml6M鹽酸胍(含有卯300mM磷酸鈉鹽緩沖液，pH8.0、1%(重量/體積)巰基乙烷磺酸(MESNA)和10mM三羧基乙基膦(TCEP))中結(jié)合36小時(shí)并搖動(dòng)。之后，通過將反應(yīng)混合物直接上樣至半制備型HPLC柱上來進(jìn)行純化。連接產(chǎn)物(14)是通過HPLC觀察到的僅有物質(zhì)。概括來說，我們開發(fā)了一類新的擬糖肽，其與對(duì)細(xì)菌來源的半胱氨酸突變體蛋白的修飾相容，與合成肽相容，并與自然化學(xué)連接相容。此外，還開發(fā)了糖基疊氮化物與肽的融合。實(shí)施例1的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)儀器利用Bruker250Y設(shè)備，在250和300MHz記錄NMR鐠，在63和75MHz記錄13CNMR鐠，在235MHz記錄19FNMR譜。以/;/附來記錄化學(xué)位移(5)，以Hz來記錄偶合常數(shù)(/)，除非標(biāo)明"寬(br)"，否則說明信號(hào)是尖銳的，s:單峰，d:雙峰，t:三峰，m:多峰，q:四峰。除非另有指明，否則使用殘留的質(zhì)子性溶劑CDC13(SH:7.26，s)作為111-]\01譜的內(nèi)標(biāo)。利用MicromassQuattroLC電噴霧并施加25-60V的電壓來進(jìn)行電噴霧質(zhì)i普術(shù)。層析利用包被有硅膠60F254的Merck鋁基板進(jìn)行分析型TLC。利用粒徑35-70微米的Fisher硅膠60A進(jìn)行快速層析。使用茴香醛浸漬和UV光(254nm)〗吏組分顯現(xiàn)。溶劑和試劑除非另有指明，否則所有試劑和溶劑均為標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室級(jí)并用以供應(yīng)的方式使用。如果溶劑被稱為"無水的"，則其購(gòu)買時(shí)為無水級(jí)。在蒸發(fā)前，在減壓下利用無7jC硫酸鎂對(duì)所有的有機(jī)提取物進(jìn)行干燥。7V-(炔丙基)-溴乙酰胺(4)將炔丙基胺(0.1ml,1.45mmol)溶于水(15.0ml)中，在NaHC03(2.5g)存在下用溴乙酸酐(L85g，7.25mmol)處理。在室溫下攪拌該反應(yīng)物3小時(shí)。用HC15。/。(50ml)猝滅反應(yīng)，并用乙酸乙酯(3x50ml)萃取產(chǎn)物。用1MNaOH(5x100ml)和水(2x100ml)洗滌有機(jī)相。用MgS04干燥有機(jī)相，在減壓下進(jìn)行過濾和濃縮以獲得白色結(jié)晶固體(0.11g,43%)。Rf-0.33(石油醚/乙酸乙酯為1:1)。^-NMR(250MHz，CDC13)5(p/7/w):6.78(1H，br，NH);4.07(2H，q，J-5.4Hz,J=2.6Hz，CH2);3.88(2H，s，COCg2Br);2.27(1H，t，J=2.6Hz，Cg)。"C國(guó)匪R(63MHz，CDC13)S(/7戸)165.3(qC，￡0);78.5(qC，炔)；72.2(CH)，29.9和28.6(CH2)。C5H6BrNO(M+l)，F(xiàn)AB-MS的計(jì)算值為174.96,實(shí)測(cè)值為197.85和199.85(M+23)。1-^-(3，4,6-三-0-乙酰基-2-脫氧-2-;￥-乙?；?^D-吡喃葡萄糖基酰胺)-4-(7V，-亞曱基-2，-溴乙酰胺基)-4,5-脫氫-三唑(5)將疊氮糖(100mg，0.27mmol)和炔丙基溴乙酰胺(47mg，0.27mmol)溶于兩相溶液CHCl3/EtOH/H20(9:1:1)(1.1ml)中。加入抗壞血酸鈉(54mg,0.27mmoO和CuSO,5H20(2mg，0.007mmol)。在50。C以600rpm過夜挽掉該反應(yīng)物。然后用CHC13稀釋該反應(yīng)混合物，并用飽和的NaHC03水溶液(3x20ml)洗滌，用MgS04干燥有機(jī)相，在減壓下進(jìn)行過濾和濃縮，以獲得褐色固體(98mg，66%)。Rf:0.40(乙酸乙酯)。iH畫NMR(300MHz，CDC13和5%的CD3OD)S(/，/wi):7.72(1H，bp，Cg畫三唑)；5.76(1H，d，J12=9.7Hz，HI);5.21(1H，dd，J2_3=J3.4=9.8Hz，H3);4.99(1H，dd，J3.4=J4—5=9.8Hz，H4);4.28(1H,bp，H2);4.19(2H，s，COQfcBr);4.08(2H，dd，J6a6b=12.7Hz，J5_6a=4.8Hz，H6a);3.92(1H，dd，J6a6b=12.7Hz，J56b=1.8Hz，腸)；3.87-3.83(1H，m，H5);3.63(2H，s，C&NH);1.86,1.85,1.82(9H，3xs，ClfcCO);1.52(3H，s，CS3CONH)。13C-NMR(75MHz,CDCl3和5。/。的CD3OD)S(/;/;附)171.7，170.9，170.4,169.6(5xqC，￡0);82.0，74.5,72.0，68.0，53.1(5xCH;￡1-￡5);61.7(￡H2，C6);35.0(￡H2，Ar-￡H2-NH);28.0(￡H2，CO-￡H2-Br);21.8，20.2，20.1，20.1(4xCOC払)。針對(duì)C19H26BrN509(M+l)，F(xiàn)AB-MS的計(jì)算值為548.09867，實(shí)測(cè)值為548.10034。速此處提到的"較低產(chǎn)率，，(與表l中引用的相比)可能與柱層析期間5的溶解性較低有關(guān)。iV-炔丙基-(2-硫節(jié)基)乙酰胺(8)將7V-(炔丙基)-溴乙酰胺(100mg，0.57mmol)溶于DMF(4.0ml)中。加入卡基硫醇(700nL，5.77mmol)和三乙胺(885fiL，6.35mmol)。將該反應(yīng)物攪拌16小時(shí)。用氯仿(10.0ml)稀釋反應(yīng)混合物，并用NaOH1M(10.0ml)、5o/。HC1(10.0ml)、飽和NaHC03水溶液(10.0ml)和水(10ml)進(jìn)行洗滌。用MgS04干燥有機(jī)相，過濾和減壓濃縮。利用快速層析在硅膠(石油醚/乙酸乙酯，l:l)上純化粗產(chǎn)物，得到純的產(chǎn)物(105mg，84%)。Rf:0.38(石油St/乙酸乙酯，1:1)。iH誦NMR(300MHz，CDC13)5(p/7附)7.34-7.22(5H，m，Ph);6.91(1H，bp，NH);3.95(2H，q，J=5.4Hz，J=2.5Hz，CH2);3.72(2H，s，COC壓S);3.12(2H，s，PhCffcS);2.24(1H，t，J=2.5Hz，Cg)。13C-NMR(75MHz,CDC13)5(//;附)168.4(qC，￡0);137.0(qC,Ph);129.0，128.8，127.5(5xCH，Ph)79.3(qC，炔)；71.8(CH)，37.1，35.0和29.4(CH2)。針對(duì)C12H13NOS(M+l)，F(xiàn)AB-MS的計(jì)算值為220.07卯6，實(shí)測(cè)值為220.07910。1-^-(3，4，6-三誦0-乙?；?2國(guó)脫氧國(guó)2-7￥-乙?；?y^D畫吡喃葡糖基酰胺)-4國(guó)(7V，-亞甲基-2，-硫代節(jié)基乙酰胺)-4，5-脫氳-三唑(9)將疊氮糖(100mg,0.27mmol)和炔丙基衍生物(59mg，0.27mmol)溶于兩相溶液CHCl3/EtOH/H20(9:1:1)(1.1ml)中。加入抗壞血酸鈉(54mg，0.27mmol)和CuS04.5H20(2mg，0.007mmol)。在50。C以600rpm過夜挽掉該反應(yīng)物。然后用CHCI3稀釋該反應(yīng)混合物，并用飽和的NaHC03水溶液(3x20mL)洗滌，用MgS04干燥有機(jī)相，在過濾和減壓濃縮以獲得淡褐色固體(146mg，91%)。Rf:0.33(乙酸乙酯)。力-NMR(300MHz，CDC13和5%的CD3OD)S(/;/wi):7.75(1H，s，Cg畫三唑)；7.24-7.18(5H，m，Ph);5.86(1H,d，Ji-2=9.9Hz，HI);5.33(1H，dd，J23=J3_4=9.9Hz，H3);5.12(1H,dd，J3—4=J4_s=9.9Hz,H4);4.38(1H,dd，J12=Jw=9.9Hz，H2);4.35(2H，s，Cg2NH);4.19(1H，dd，J6a_6b=12.6Hz，J5_6a=4.8Hz，H6a);4.03(1H，dd，J6a_6b=12.6Hz，J5_6b=1.9Hz，H6b);3.94(1H，ddd，J4_5=9.9Hz，J5_6a=4.8Hz，JS6b=1.9Hz，H5);3.66(2H,s，COC払S);3.03(2H，s，SCg2Ph);1.97，1.95，1.93(9H，3xs，QJ3CO);1.62(3H，s，CgaCONH),13C-NMR(75MHz,CDCl3和5。/。的CD3OD)S(/;/wi):171.4，170.9，170.6，169.7，169.6(5xqC,￡0);137.1(qC，三唑)；128.9，128.5，127.2(￡H，Ph);121.2(qC，Ph);85.9，74.7，72.2，68.0，53.3(5xCH;￡l-￡5);61.7(￡H2，C6);36.8，34.8，34.7(￡H2);23.6，22.2,20.5，20.4(4xCOCga)。針&C26H33N509S(M+l)，F(xiàn)AB-MS的計(jì)算值為592.20717，實(shí)測(cè)值為592.20858。S-節(jié)J^iL醚(9)將糖(50mg，0.09mmol)溶于DMF(615)中。加入節(jié)基石危醇(106pL，0.9mmol)和三乙胺(138pL，0.726mmol)。將該反應(yīng)物攪拌16小時(shí)。用氯仿(10mL)稀釋反應(yīng)混合物，并用NaOH(1M，10mL)、5%HCl(10mL)、飽和NaHC03水溶液(10mL)和水(10mL)進(jìn)行洗滌。用MgS04干燥有機(jī)相，在減壓下進(jìn)行過濾和濃縮。利用快速層析在硅膠(石油醚/乙酸乙酯，9:1—1:9)上純化粗產(chǎn)物，得到純的產(chǎn)物(40mg,75%)。Rf:0.33(乙酸乙酯)。iH-NMR數(shù)據(jù)如上所述。去乙?；腟-節(jié)基硫醚(10)35將糖(137mg，0.23mmol)溶于乙醇(5mL)中2%的一7JC合肼溶液中。3天后，反應(yīng)完成。在高真空下除去溶劑，通過在硅膠(DCM中10%甲醇)上進(jìn)行快速層析而對(duì)粗產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到純的產(chǎn)物(71mg，66%)。Rf0.01(DCM中10%甲醇^H國(guó)NMR(300MHz，D20/CD3OD)S(//7/if):8.04(1H，s，Cg國(guó)三唑)；7.30-7.24(5H，m，Ph);5.76(1H，d,J12=9.8Hz，HI);4.40(2H，s，三唑國(guó)Cg2-NH);4.20(1H，dd，^_2=J2-3=9.8Hz，H2);3.卯-3,54(5H，m，H3，H4，H5，H6a，H6b);3.78(2H,s，CO-Cg2國(guó)S);3.12(2H,s，S-Qfc-Ph);1.76(3H，s，COC払)。"C國(guó)N匿(75MHz，D20/CD3OD)5(，附)173.5，172.2(2xqC，￡0);146.0，139.0(2xqC，苯和三唑)；130.2，129.5，128.2，123.0(4x￡H，苯和三唑)；88.2，81.2，75.6，71.4，56.8(5xCH;￡1隱￡5);62.3(￡H2，C6);37.5，35.8,35.5(3x￡H2);22.6(COC払)。針對(duì)C20H27N5O6S(M+l)，F(xiàn)AB-MS的計(jì)算值為466.17548，實(shí)測(cè)值為466.17335。肽合成使用Rink酰胺-MBHA樹脂進(jìn)行肽合成以產(chǎn)生肽石危酯(上樣0.67mmol/g)。所有樹脂和Fmoc氨基酸均購(gòu)自Novalbiochem。質(zhì)鐠數(shù)據(jù)獲得自MicromassQuattroLC系列電噴霧質(zhì)i普儀。4吏用PhenomenexLUNAds柱，在45分鐘中以含有0.1%TFA的5-95%乙腈梯度進(jìn)行半制備型HPLC(流速為3.0mL/分鐘)。所有其它化學(xué)試劑來自Aldrich。肽硫酯合成(EPO殘基1-19)使用最近由Unverzagt小組所述的雙接頭策略來制備肽硫酯\簡(jiǎn)言之，通過與DMF中的20%哌咬接觸而將rink酰胺樹脂(0.1mmol)去保護(hù)。使用HBTU/HOBt作為偶聯(lián)試劑來偶聯(lián)Fmoc-Phe-OH(5份)。偶聯(lián)時(shí)間為4小時(shí)。用DMF中的20%哌啶除去Fmoc后，通過將樹脂與3-羧基丙磺酸(50mg,0.3mmol)、HOBt(40mg,0.3mmol)和36DIC(47nL，0.3mmol)接觸5小時(shí)來偶聯(lián)磺酰胺接頭。使用7V-甲基咪唑(40nL，0.5mmo1)、DIC(78pL,0.5mmol)作為偶聯(lián)試劑，在4:1DCM/DMF中將第一氨基酸(Fmoc-Ser(tBu)-OH,每個(gè)偶聯(lián)5份)雙偶聯(lián)16小時(shí)。使用成熟的方法，對(duì)肽進(jìn)行延伸(目標(biāo)序列APPRLICDSRVLERYLLEA-SBn),在ICH2CN活化后用爺基硫醇將該肽切下2。將完全去保護(hù)并且沉淀的粗制肽重溶于25D/。MeCN水溶液中，并利用半制備型HPLC進(jìn)行純化。利用ESI-MS對(duì)主峰(保留時(shí)間為29分鐘)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其對(duì)應(yīng)于所期望的產(chǎn)物。將該級(jí)分凍干以獲得約1mg的產(chǎn)物，將該產(chǎn)物用于隨后的NCL反應(yīng)中。逸雙接頭策略的使用表明，盡管用ICH2CN活化樹脂幾乎是定量的，但隨后的硫酯釋放是特別緩慢的，因?yàn)榇罅拷?jīng)活化的樹脂結(jié)合肽仍與固體支持物結(jié)合。另外，肽可通過將樹脂與千基硫醇再次接觸以及通過在40。C進(jìn)行切割反應(yīng)來釋放。溴乙酰胺4-7與固體支持的肽11反應(yīng)利用MS驗(yàn)證所期望的肽已制備后，通過與無水DMF(其含有2.5%(體積/體積)DIPEA)中的新鮮的10°/。(重量/體積)二硫蘇糖醇接觸2x24小時(shí)來切除固相上的StBu保護(hù)基。通過在含有2.5%吡啶的DMF(或EtsN)中用所期望的溴乙酰胺(3份/巰基)處理24小時(shí)來對(duì)巰基進(jìn)行加帽。自然化學(xué)連接在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行NCL反應(yīng)。將肽(1mg/硫酯和純化的13)溶于250pL的6M鹽酸胍中，其含有300mM躊酸鈉鹽緩沖液(pH8.0)、1%(重量/體積)MESNA和10mMTCEP。將該反應(yīng)物在室溫孵育36小時(shí)，并直接上樣到半制備型HPLC柱。HPLC顯示出保留時(shí)間為25.8分鐘的單一主要物質(zhì)，其經(jīng)ESI-MS驗(yàn)證為所期望的產(chǎn)物(計(jì)算分子量=5125.6Da，實(shí)測(cè)分子量==5127.0Da)。最后，當(dāng)將炔類首先上樣至固相上時(shí)也可以發(fā)生click反應(yīng)(參見下述反應(yīng))。將包含示意圖1中所示肽的樹脂(42mg)(如手稿中所述，9.16x106mol用4修飾的肽)懸浮于9:1:1CHCl3/EtOH/50mM磷酸鈉鹽緩沖液(l.lml)，加入l(20mg，0.055x103mol，3份/巰基)和抗壞血酸鈉(7mg,0.055x103咖l)，之后加入Cu(S04).5H20(0.5mg)。在37。C、500rpm搖動(dòng)下，將該反應(yīng)物在eppendorf恒溫混勻器中在1.5mleppendorf管內(nèi)進(jìn)行孵育。然后過濾樹脂并用水、NMP、隨后用DCM進(jìn)行洗滌。通過用95%TFA、2.5%7jC、2.5%EDT處理3小時(shí)將產(chǎn)物從固體支持物上切除，并利用質(zhì)譜法進(jìn)行分析。示意圖1:試劑和條件i)l(3份)，抗壞血酸鈉(3份)，CHCl3/EtOH，50mM磷酸鈉鹽緩沖液(pH8.0)，催化劑CuS04'5H20，37。C，16小時(shí)。ii)95%TFA，2.5%EDT，2.5%H20。實(shí)施例2本發(fā)明人還構(gòu)建了用于附著肽鏈的更大的多糖化合物(圖4和圖5中所示反應(yīng)的終產(chǎn)物一一分別為化合物A和B)，該多糖附著有兩個(gè)二糖基團(tuán)。顯示這些化合物之合成的反應(yīng)示意圖可見于圖4和圖5中。實(shí)施例2的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)通用技術(shù)38儀器:利用Bruker250Y設(shè)備，在250和300MHz記錄illNMR鐠，在63和75MHz記錄13CNMR鐠，在235MHz記錄19FNMR鐠。以/;/7挑來記錄化學(xué)位移(S),以Hz來記錄偶合常數(shù)(/),除非標(biāo)明"寬(br)"，否則說明信號(hào)是尖銳的，s:單峰，d:雙峰，t:三峰，m:多峰，q:四峰。除非另有指明，否則使用殘留的質(zhì)子性溶劑CDC13(5H:7.26，s)作為iH-NMR語的內(nèi)標(biāo)。利用MicromassQuattroLC電噴霧儀并施加25-60V的電壓來進(jìn)行電噴霧質(zhì)鐠術(shù)。利用包被有硅膠60F2S4的Merck鋁基板進(jìn)行分析型TLC。利用粒徑35-70微米的Fisher硅膠60A進(jìn)行快速層析。使用茴香醛浸漬和UV光(254nm)4吏組分顯現(xiàn)。溶劑和試劑除非另有指明，否則所有試劑和溶劑均為標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)級(jí)并以供應(yīng)的形式使用。如果溶劑被稱為"無水的"，則其購(gòu)買時(shí)為無水級(jí)。在蒸發(fā)前，在減壓下利用無水疏酸鎂對(duì)所有的有機(jī)提取物進(jìn)行干燥。2-鄰苯二甲酰氨基-2-脫氧-1,3,4，6-四-0-乙?；?y^D-吡喃葡萄糖將鹽酸葡糖胺(10.00g，46.3mmol)加入經(jīng)攪拌的甲醇鈉(3.00g，46.3mmol)的無水曱醇(75ml)溶液中。在室溫?cái)嚢柙摲磻?yīng)混合層析1.NaOMe/MeOH2.鄰苯二甲酸酐/Et3N3.ACgO/吡咬39物30分鐘，然后進(jìn)行抽濾。隨后，向?yàn)V液中加入鄰苯二曱酸酐(3.50g，23.0mmol),繼續(xù)再攪拌20分鐘。然后加入另一部分鄰苯二曱酸酐(3.50g，23mmo1)，隨后加入三乙胺(7.6ml，55.6mmol)。在室溫?cái)嚢柙摲磻?yīng)混合物10分鐘，然后在冰浴中冷卻1小時(shí)，隨后進(jìn)行抽濾。用冷甲醇(2x20ml)洗滌沉淀物，在高真空下進(jìn)行干燥。然后將白色干燥固體懸于乙酸酐(44.5ml)中，并冷卻至O'C,然后加入吡啶(22.7ml)并輕輕攪拌。在室溫?cái)嚢柙摲磻?yīng)16小時(shí)。之后，將該反應(yīng)混合物倒入水/水(200ml)中，并用氯仿(3x200ml)進(jìn)行萃取。用5D/。HC1(1x120ml)、飽和NaHC03水溶液(120ml)、水(120ml)和鹽水(100ml)洗滌合并的有機(jī)提取物。用MgS04干燥有機(jī)相，在減壓下進(jìn)行過濾和濃縮以獲得橙色的油。利用快速層析在硅膠(1:1己烷/乙酸乙酯)上對(duì)粗產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到純產(chǎn)物(6.62g;30%)。Rf:0.56(4:1乙酸乙酯/石油醚)。^國(guó)NMR(250MHz，CDC13):(p/;附)7.74-7.62(4H，m，ArH);6.35(1H，d，U9Hz，H-l);5.73(1H，dd，3J2-3=3J34=9.8Hz，H隱3);5.05(1H,dd,3J3_4=3J4_S=9.8Hz，H畫4);4.34(1H，dd，2J6a-6b=11.6Hz,3J56a=3.3Hz，H-6a);4.30(1H，dd，3J12=8.9Hz,3J23=9.8Hz，H-2);3.98(IH，dd，2J6a.6b=11.6Hz，3J5_6b=4.2Hz，H-6b);3.91(1H,ddd，3J4_5=9.8Hz，3J56a=3.3Hz，3Js_6b=4.2Hz，H5);1.92，1.88，1.81和1.70(12H,4xs，CH3CO)。13C-NMR(63MHz，D20)(/7/wi):169.8，169.3，168.8，167.9，166.7((qC，￡0);134.0(Ar畫4，7);130.6(Ar國(guó)3a，7a);123.2(Ar-5，6);89.1，72.0，69.8，67.7,52.9(5xCH，￡1誦￡5);60.9(￡H2);20.0(COC払)。針對(duì)CmHmNOu,FAB國(guó)MS的計(jì)算值為476.9，實(shí)測(cè)值為494.9[MNH4+。3，4，6-三-0-乙^^-2-脫氧-2-鄰苯二曱酰亞^J^0"D-吡喃葡糖基疊氮化物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage40</formula>將三甲基硅烷基疊氮化物(0.77ml，5.78mmol)和四氯化錫(0.28ml,2.41mmol)加入1，3,4，6-四-0-乙@*^-2-脫氧-2-鄰苯二甲酰亞氨->^0-吡喃葡萄糖(2.36g，4.82mmol)的DCM(25ml)懸液中，將該混合物攪拌24小時(shí)。之后，TLC(3:1乙酸乙酯/石油醚)表明反應(yīng)已完成。用DCM(50ml)稀釋反應(yīng)物，用飽和NaHC03水溶液(40ml)和水U0ml)進(jìn)行洗滌。用MgS04干燥有機(jī)相，在減壓下進(jìn)行過濾和濃縮。將粗產(chǎn)物溶于最小體積的DCM中并用曱醇飽和，以產(chǎn)生白色結(jié)晶(1.612g;73%)。Rf:0.36(3:1乙酸乙酯/石油醚)。^-NMR(250MHz,CDC13):7.88-7.84(2H，q，3J4_5=3J6_7=5.5Hz,4J"=4J5_7=3.1Hz，ArH-4，-7);7.76-7.73(2H，q，3J5_6=5.4Hz，4J46=4J57=3.1Hz，ArH陽5,-6);5.79(1H,dd，3J23=10.6Hz，3J34=9.2Hz，H曙3);5.64(1H，d,3J12=9.5Hz，H-l);5.18(1H,dd，3J3_4=3J34-9.5Hz,H-4);4.38-4.16(3H，m，H-2，H誦6a，H-6b);3.97(1H，m，H5);2.12，2.03和1.85(9H，3xs，CH3CO)。13C-NMR(63MHz,D20)8(p/wi):170.6，170.0和169.4(qC，￡0);134.5(Ar-4,7);131.2(Ar-3a，7a);123.7(Ar誦5，6);85.5，73.9，70.3,68.4，53.9(5xCH，￡l-￡5);61.7(￡H2);20.7,20.5和20.3(COCgs)。針對(duì)C20H20N4O9(M+NH4+)，F(xiàn)AB-MS的計(jì)算值為478.1230，實(shí)測(cè)值為478.1348。6-0-叔丁基二苯M烷基-2-脫氧-2-鄰^甲酰亞^J^^D-吡喃葡糖基疊氮化物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage41</formula>將糖基疊氮化物(1.612g，3.5mmol)溶于甲醇(24ml)中。加入0.5MNaOMe的甲醇溶液，直至pH達(dá)到10。將反應(yīng)物攪拌16小時(shí)后，加入乙酸進(jìn)行中和。然后，將混合物濃縮，與甲苯一起共沸，然后置于高真空下l小時(shí)。將所得的白色固體溶于添加了DIPEA(1.22ml,7.0mmol)和DMAP(43mg，0.35mmol)的DCM(12ml)中。然后加入TBDPSC1(1.0ml，3.85mmol),將反應(yīng)物攪拌16小時(shí)。之后，TLC(4:1乙酸乙酯/石油醚)表明反應(yīng)已完成。用水(2x20ml)和鹽水(2x20ml)洗滌粗產(chǎn)物。用MgS04干燥有機(jī)相，在減壓下進(jìn)行過濾和濃縮。利用快速層析在硅膠(DCM中5%甲醇)上對(duì)粗產(chǎn)物進(jìn)行純化，以得到純化產(chǎn)物(1.868g;93%)。Rf:0.56(4:1乙酸乙酯/石油醚)。iH畫NMR(250MHz,CDC13):8(//;附)7.76-7.61(9H，m，ArH);7.43(5H，m，ArH);5.35(1H，d，3Jl尸9.5Hz,H-l);4.40(1H，dd，3J3_4=10.5Hz，3J2-3=7.8Hz，H國(guó)3);4.05(1H,dd，3J^2=9.5Hz，3J23=7.8Hz，H-2);3.97(1H，m，H-5);3.70(1H，m，H-4);3.65(2H，m，H-6a，H-6b);1.09(9H,s，C(CH3)3)。13C-NMR(63MHz,D20)S(/;/;附)168.2(qC，￡0);135.5(4xCH，￡6H5);134.2(2xqC，Pht);132.8(2xCH,Pht);131.3(2xqC，￡6H5);129.8(4xCH，￡6H5);127.7(2xCH，￡6H5);123.5(2xCH，Pht);85.3，77.2，72.5，71.2，55.8(5xCH，￡1-￡5);63.8(￡H2));26.7(3><CH3，C(￡H3)3);19.1(qC，￡(CH3)3)。FAB-MS的計(jì)算值為573.2091，實(shí)測(cè)值為573.2169。1，2，3,4,6-五-0-乙^L^-^D-吡喃半乳糖OAc在0"C下將HC104(0.1ml)逐滴加入乙酸酐溶液(225ml)中，攪拌1小時(shí)。然后，將半乳糖(25.0g，0.130mol)分成小份加入所述反應(yīng)混合物中。3小時(shí)后，TLC(7:3乙酸乙酯/己烷)表明反應(yīng)已完成。將粗產(chǎn)物濃縮至其原始體積的三分之一。用氯仿(600ml)稀釋混合物，并用飽和NaHC03水溶液(4x150ml)、水(150ml)和鹽水(150ml)進(jìn)行洗滌。用MgS04干燥有機(jī)相，在減壓下進(jìn)行過濾和蒸發(fā)以得到褐色油(54g;100%)。Rf:0.42(7:3乙酸乙酯/己烷)。力-NMR(250MHz,CDC13)S(/7/7附)6.34(1H，d,3Jl尸1.7Hz，HI);5.46(1H，d，3J4.5=1.1Hz，H4);5.39-5.19(2H，m,H2，H3);4.31(1H，dd，3J5_6=6.5Hz，3J4_5=l.lHz，H5);4.05(2H，dd，H6a，H6b);2.18，2.12,2.00,1.98和1.97(15H，5xs，CH3CO)。13C-NMR(63MHz,CDC13)5(;i/7柳)170.3，170.0，168.9,166.3(5xqC,5CH3￡0);89.6,67.3,67.2，66.4(5xCH，￡l-￡5);61.2(￡H2);20.5(5xCH3，￡H3CO)。針對(duì)CwI^On(M+l),FAB-MS的計(jì)算值為391.3393,實(shí)測(cè)值為391.12404。2，3，4,6-四-0-乙g-D-半乳糖將全乙?；陌肴樘?7.8g，20.0mmol)溶于無水THF(120ml)中，在氮?dú)庵屑尤牍?jié)胺(2.6ml，24.0mmol)。然后，在50。C攪拌反應(yīng)混合物24小時(shí)。之后，TLC(4:1乙酸乙酯/石油醚)表明存在半縮醛和一些未反應(yīng)的原材料。然后，在減壓下將反應(yīng)混合物濃縮。利用快速層析在硅膠(4:1乙酸乙酯/石油醚)上對(duì)粗產(chǎn)物進(jìn)行純化，以得到純化產(chǎn)物(6.24g;95%)。Rf:0.46、0.30(4:1乙酸乙酯/石油醚)。力-NMR(250MHz，CDC13)，13C-NMR(63MHz,CDC13):端基異構(gòu)a:P混合物。針對(duì)CmH^Ow,FAB-MS的計(jì)算值為348.3,實(shí)測(cè)值為371.3[MNa+。2，3，4,6-四-0-乙g-D-吡喃半乳糖基三氯乙亞氨酸酯將單糖(100mg,0.29mmol)的無水DCM(1.86ml)溶液冷卻至0°C，加入三氯乙腈(872.0pL，8.7mmol)和DBU(43pL，0.29mmol)。在0。C、N2下攪拌2小時(shí)后，將反應(yīng)物濃縮以得到固體。利用快速層析在硅膠(1:1乙酸乙酯/石油醚)上對(duì)粗產(chǎn)物進(jìn)行純化，以得到純化產(chǎn)物(0.129g;卯％)，為褐色的油。Rf:0.34(2:1乙酸乙酯/石油醚)。^-NMR(250MHz，CDCl3)5("挑)8.65(1H，s，NH);6.59(1H，d，、2=3.2Hz，HI);5.55(1H，dd，3J3-4=2.9Hz，3J4-5=1.0Hz，H4);5.42(1H,dd,3J2.3=10.8Hz，3J3_4=2.9Hz，H3);5.35(1H，dd，3JW=10.8Hz，3j仁尸3.2Hz，H2);4.43(1H，dt，3J56=7.2Hz，3J4_5=1.0Hz,H5);4.16(1H，dd，2J6a_6b=11.2Hz，3J5—6a=7.2Hz，H6a);4.07(1H，dd，2J6a_6b=11.2Hz，3J5_6b=6.8Hz，H6b);2.16-2.00(12H，s,CH3CO)。"C-N證(63MHz,CDC13)S(p/wi):170.7，170.5,170.4，161.3(6xqC,4CH3￡0，￡NH，￡C13);93.9，69.4，67.9，67.7，67.3(5xCH，￡l-￡5);61.6(￡H2);21.0(4><CH3，4￡H3CO)。針對(duì)C16H2。NO10a3，F(xiàn)AB-MS的計(jì)算值為492.7，實(shí)測(cè)值為515.7[MNa+。0畫(2，3，4，6-四-0-乙酰基-^D-吡喃半乳糖基)-(1—4)-6-0-叔丁基二苯基硅烷基-2-脫氧-2-苯二酰亞氨基-^D-吡喃葡糖基疊氮化物將三氯乙酰亞氨酸(trichloroacetimidate)(4.69g,9.5mmol)和去保護(hù)的糖(2.72g，4.75mmol)溶于無水DCM(25ml)中，其包含4A分子篩，將該溶液冷卻至-20'C。加入0.1MTMS-OTf的無水DCM(4.75ml，0.475mmol)溶液。2小時(shí)后，將該反應(yīng)升溫至室溫。1小時(shí)后，TLC(8:2甲苯/乙酸乙酯)表明該反應(yīng)已完成。用DCM(50ml)稀釋反應(yīng)混合物，并用固體NaHC03進(jìn)行中和，然后在減壓下進(jìn)行過濾并除去溶劑。利用快速層析在硅膠(8:2甲苯/乙酸乙酯)上對(duì)粗產(chǎn)物進(jìn)行純化，以得到純化產(chǎn)物(3.93g，92%),為白色泡沫。Rf:0.26(8:2甲苯/乙酸乙酯)。力國(guó)NMR(250MHz,CDC13):S(/;/wi):7.66和7.35(10H,m,2><C6H5);7.16-7.06(4H，m，Pht-H);5.36(1H，d，3J12，=(1H，d，3J3_4=3J45=3.3Hz,H-4);5.15(1H,dd，3J2-3=10.4Hz，3U.lHz，H-2);4.卯(1H，dd,3JW=10.4Hz，3J34=3.3Hz,H國(guó)3);4.65(1H,d，3J12=8.1Hz，H-l);4.42(IH，dd,3J2，.3，=10.4Hz，3J3,_4，=8.5Hz，H畫3，)；4.06(1H，dd，3J2，.3，=10.4Hz，3jr.2^9.5，H-2，)；4.00-3.45(7H，m,H5,H6a，H6b,H4，，H5，，H6a，，H6b，)，2.26，2.04，l.卯，1.65(12H,4xs，COCH3);1.04(9H，s，C(CH3)3),13C-NMR(63MHz,D20)8(;;/wi):170.4,170.0,169,9，169.2,168.1，167.5(6xqC，￡0和￡OCH3);135.4(4xCH，￡6H5);134.0(2xqc，Pht);132.8(2xCH,Pht);131.3(2xqc，￡6H5);129.7(4xCH，￡6H5);127.7(2xCH，￡6H5);123,4(2xCH,Pht);100.9，85.2，80.0，77.2,71.9，71.1，70.6，68.6，66.8，55.8(10xCH，￡l-￡5,￡1,國(guó)￡5，)；63.5，61.2(2x￡H2);26.6(3xCH3，C(￡H3)3);20.3(4xCO￡H3);19.1(qC，￡(CH3)3)。針對(duì)C44H50N4O15Si(M+1)，F(xiàn)AB國(guó)MS的計(jì)算值為卯3.3042，實(shí)測(cè)值為903.3117。2，3,4,6-四-0-乙?；?y"D-吡喃半乳糖基-(1—4)-3,6-二-6>-乙?；?2-乙酰氨基-2-脫氧-^D-吡喃葡糖基疊氮化物在0"C下向THF(31.5ml)中的鄰苯二曱酰亞胺基二糖(946mg，1.05mmol)和乙酸(600^L，10.5mmol)中加入1MTBAF的THF(4.2ml，4.2mmol)溶液。血室溫?cái)嚢璺磻?yīng)混合物15小時(shí)。隨后將該混合物濃縮為黃色的油。將該油溶于正-BuOH(20ml)中，并加入乙二胺(5ml)。將反應(yīng)物加熱至卯'C，并攪拌16小時(shí)。然后將該混合物在高真空下進(jìn)行濃縮，并溶于2:1吡啶/Ac20溶液(100ml)中，將反應(yīng)物攪拌8小時(shí)。將該反應(yīng)再次濃縮，以得到黃色的油，對(duì)其進(jìn)行硅膠層析(柱用DCM中1%甲醇裝填，流動(dòng)相為DCM中3%甲醇)純化以得到純化的產(chǎn)物(1.18g,76%),為白色泡沫。Rf:0.23(DCM中3%甲醇)。力-NMR(360MHz,CDC13)8(/7/7附)5.96(1H，d，3JNH_2，=9.5Hz，NHAc);5，32(1H，dd，3J3_4=3.3Hz，H4);5.10-5.04(2H，m，H2,Hl，)；4.96(1H，dd，3Jw=10.2Hz，3J3_4=3.2Hz，H3);4.53-4.48(2H，m，Hl，H3，)；4.12-3.71(7H，m,H5，H6a，H6b，H2，，H4'，H6a，H6b);3.68(1H，m，H5，)；2.26，2.13，2.10，2.08，2.04,1.20，1.95(21H，7xs，COCH3)。13C-NMR(63匪z，CDCl3)"/;/wi):171.0，170.4，170,3，170.1，170.0和169.3(7xqC，￡0);101.1，88.3,75.6，74.5，72.6，70.6,70.5，68.9，66.4，52.9(10xCH，￡1-￡5，￡1，畫￡5，)；61.7，60.6(2x￡H2);23.0，20.7，20.5，20,4(7xCOC払)。針對(duì)C26H36N4016(M+l)，F(xiàn)AB-MS的計(jì)算值為661.2126，實(shí)測(cè)值為661.1630。2,3，4，6-四-0-乙SL^-^D-吡喃半乳糖基-(1—4)-2-乙酰氨基-2-脫氧-3,6-二國(guó)O-乙酰基-l-7V畫[l畫(2-溴)乙?；鵠畫y^D國(guó)吡喃葡為糖將二糖(1.98g，3.00mmol)和10%Pd/C(205mg)溶于無水甲醇(90ml)中，在氫氣氣氛下于室溫?cái)嚢?小時(shí)。然后，通過硅藻土過濾除去催化劑，用甲醇洗滌珪藻土墊。在真空下除去溶劑。將粗反應(yīng)物重溶于無水DMF(20ml)中，并加入溴乙酸酐(1.01g，3.9mmol)。在室溫?cái)嚢璺磻?yīng)物過夜。用氯仿(200ml)稀釋反應(yīng)物，并用5%HC1(200ml)、飽和NaHC03水溶液(200ml)和水(200ml)進(jìn)行洗滌。用MgS04干燥有機(jī)相，在減壓下進(jìn)行過濾和濃縮。利用快速層析在硅膠(DCM中2.5%甲醇)上對(duì)粗產(chǎn)物進(jìn)行純化，以得到純化產(chǎn)物(2.19g，95%)。Rf:0.25(DCM中2%曱醇)。力-NMR(250MHz,CDC13)S(/7;7/m):7.65(1H,d，3JNH=8.1Hz，Cl，國(guó)NgCO);7.04(1H，d，3JNH=8.3Hz，NHAc);5.27(1H，dd，3J34=3.0Hz,3J4S=0.6Hz,H-4);5.05(1H,m,H3，)；4.97(IH，dd，3Jl2=3J2.3=10.1Hz，H2)，4.卯(1H，dd，3J2-3=10.1Hz，3J3-4=3.2Hz，H3);4.42(1H，d，3Jw=10.1Hz，HI);4.35(IH，d，3Jr-2，=11.61Hz，Hl，)；4.06-3.66(8H，m，H2，，H4，，H5,H5，，H6a,H6b，H6a，，H6b，)；3.75(2H，s，COCg2Br);2.11，2.09，2.08，2.05，2.04，1.98，1.94(21H，7xs，CH3CO)。13C-NMR(63MHz,D20)S(p/wi):172.2,171.0,170.3，170.1，169.2和167.4(8xqC，￡0);101.0，80.0，76.8，74.4，72.7,70.9，70.6,68.9，66.9，52.7(IOXCH，￡l-￡5，￡l，-￡5，)；62.0，60.9，28.2(3x￡H2);22.9，20.9，20.6,20.5(7xCOCg3)。針對(duì)C28H39BrN2017(M+l),FAB畫MS的計(jì)算值為754.14,實(shí)測(cè)值為777.4和779.4。2-乙酰"^-2-脫氧-3，4，6-三-0-乙St^-cc-D-吡喃葡萄糖基氯ci將7V-乙?；咸前?20g，90.46mmol)加至攪拌中的乙酰氯(30ml)中。將懸液磁性攪拌20小時(shí)。然后，用CHC13(50ml)稀釋反應(yīng)物，并用冰水(50ml)和水飽和的NaHC03水溶液(50ml)洗滌所得的溶液。用MgS04干燥有機(jī)相，在減壓下進(jìn)行過濾和濃縮。利用硅膠層析(柱中裝填有l(wèi):l石油醚/乙酸乙酯；流動(dòng)相為1:2)對(duì)粗產(chǎn)物進(jìn)行純化，以得到純化產(chǎn)物(11.36g,34%)。Rf:0.40(乙酸乙酯)。^-NMR(300MHz，CDC13)5(/7/7附)6.15(1H,d，3Jl2=3.7Hz，HI);6.03(1H，d，3JNH-2=8.7Hz，NH);5.30(1H,dd，3J23=3J3.4=9.9Hz，H3);5.17(IH，3J3_4=3J4_5=9.9Hz，H4);4.51(1H，ddd，3J23=9.9Hz，3JNH_2=8.7Hz,3J12=3.7Hz，H2);4.28-4.20(2H，m，H5，H6a),4.11-4.07(1H,m，H6b);2.06，2.01和1.95(9H，s，CH3CO)。13C-NMR(75MHz,CDCl3)S(;^附)171.4，170.6，170.2，169.1(4xqC，￡0);93.7，70.9，70.1，67.0，53.4(C1-C5);61.1(￡H2);23.0，20.7，20.5(4xCOCJfc)。針對(duì)C14H20NO8Cl(M+l)，F(xiàn)AB-MS的計(jì)算值為366，實(shí)測(cè)值為366。2-乙酰氨基-2-脫氧-3，4，6-三-0-乙酰基-a-D-吡喃葡糖基疊氮化物將飽和NaHC03水溶液(110ml)加入葡糖基氯(11.36g，31.12mmol)、TBAHS(10.57g，31.12mmol)和NaN3(6.07g，93.36mmol)的DCM(110ml)溶液中。將所得到的兩相溶液在室溫下劇烈攪拌1小時(shí)。然后加入乙酸乙酯(200ml)，分離有機(jī)層并用飽和NaHC03水溶液(100ml)、水(2x100ml)洗滌。用MgS04干燥有機(jī)相，在減壓下進(jìn)行過濾和濃縮，以得到純化產(chǎn)物(9.54g，82°/。)。Rf:0.30(乙酸乙酯)。^-NMR(300MHz,CDC13)3(//wi):6.02(1H，d,3Jnh-2=8.9Hz，NH);5.26(IH，3J3_4=9.8Hz，3J23=9.6Hz，H3);5.08(1H,3J3_4=3J45=9.8Hz,H4);4.78(IH，d，3^.2=9.3Hz,HI);4.25(1H，dd，2J6a—6b=12.4Hz,3J5—6a=4.8Hz，H6a);4.14(1H，dd,2J6a_6b=12.4Hz，3JS-6b=2.3Hz，H6b);3.91(1H，ddd,3J2.3=9.6Hz，3Jl尸9,3Hz，3JN&2=8.9Hz，H2);3.80(1H，ddd，3J45=9.8Hz，3J56a=4.8Hz，3J5.6b=2.3Hz,H5);2.10,2.02，2.01和1，96(12H，s,CH3CO)。13C-NMR(75MHz，CDC13)3(p/;附)170.9，170,7,170.6，169.3(4xqC,￡0);88.4，73.9，72.2，68.2，54.1(C1畫C5);61.9(￡H2);23.2，20.7,20.6，20.6(4xcOC払)。針對(duì)(:141120]\408(M+l)，F(xiàn)AB隱MS的計(jì)算值為372.3,實(shí)測(cè)值為373。2-乙酰M-2-脫氧-4,6-0-對(duì)甲氧基苯亞曱基-^D-吡喃葡糖基疊氮化物將疊氮基單糖(3g，8.07mmol)溶于無水MeOH(15ml)中，并加入甲醇鈉(甲醇中0.5M溶液，200pL),在室溫下將反應(yīng)物攪拌2小時(shí)。通過加入乙酸(10nL)來中和所述反應(yīng)混合物，并在減壓下對(duì)其進(jìn)行濃縮，從而得到去乙酰化的粗產(chǎn)物，為淺黃色泡沫。將該粗制疊氮化物溶于無水DMF(10ml)中，并加入對(duì)茴香醛二甲基乙縮醛(3.37i.NaOMe，MeOHii.對(duì)茴香醛二甲基乙縮醛，TsOHiii.Ac20,他咬g，18.54mmol)和對(duì)甲苯磺酸(0.28g,1.61mmol)。在50。C攪拌1.5小時(shí)后，在真空下對(duì)該反應(yīng)混合物進(jìn)行濃縮。將殘余物倒入飽和NaHC03(30ml)與DCM(30ml)的冷混合物中，并于4。C冷卻10分鐘。從乙酸乙酯(30ml)中結(jié)晶出沉淀物。在真空下過濾、干燥該產(chǎn)物，分離出白色固體。將所得產(chǎn)物溶于吡啶(20ml)和乙酸酐(10ml)中。在室溫?cái)嚢柙摶旌衔?4小時(shí)，然后在真空下進(jìn)行濃縮。然后加入二氯甲烷(150ml)，用水(20ml)、飽和NaHC03水溶液(20ml)洗滌有機(jī)相。用MgS04干燥有機(jī)相，在真空下除去溶劑，以得到粗產(chǎn)物，它是從乙酸乙酯中結(jié)晶出的白色固體(1.19g，70%)。Rf:0.30(乙酸乙酯)。^國(guó)匪R(300MHz，CDC13)8(/7/;附)7.34(2H,d，3J=8.7Hz，ArH);6.88(2H，d，3J=8.8Hz，ArH);5.88(1H，d，3JH2-NHAc=9.5Hz,NHAc);5.48(IH，s，CHPh);5.24(1H,dd,3J2-3=9.9Hz，H3);4.48(1H，d，3J12=9.2Hz，HI);4.32(1H，dd，2J6a6b=10.5Hz，3J56a=4.6Hz，H6a);4.11(1H，ddd，3J23=9.9Hz，3Jh2_nhac=9.5Hz，3J12=9.2Hz，H2);3.79(3H，s，CH30);3.77-3.61(3H,m，H4，H5，H6b);2.09和2.00(6H,s，CH3CO)。13C-NMR(75MHz，CDC13)8(p/wi):171.4,170.9，159.8和128.8(qC);127.1(2xAr￡H);113.2(2xAr￡H);101.2，88.8，78.1，71.4和68.1(￡H);67.9(￡H2);54.9(0￡H3);53.3(￡H);22.2和20.3(2xCO￡H3),針對(duì)C18H22N407(M+Na)，F(xiàn)AB國(guó)MS的計(jì)算值為429,實(shí)測(cè)值為429。2-乙酰氨基-2-脫氧-3-乙?；?6-0-對(duì)曱氧基節(jié)基-y^D-吡喃葡糖基疊氮化物將無水DMF(22.1ml)中的TFA(4.19g，36.8mmol)冷卻至0。C，并將其逐滴加入冰浴中O'C的糖疊氮化物(1.5g,3.68mmol)、氰基硼氫化鈉(1.16g,18.40mmol)和3A分子篩的無水DMF(29.4ml)溶液中。添加完畢后，移去水浴，在室溫?cái)嚢璺磻?yīng)混合物16小時(shí)。然后，對(duì)反應(yīng)進(jìn)行抽濾。將濾液倒入水冷的飽和NaHC03水溶液中，并用二氯甲烷(5x60ml)萃取產(chǎn)物。用NH4C1(100ml)的飽和水溶液和水(100ml)洗滌合并的有機(jī)提取物。用MgS04干燥有機(jī)相，在減壓下進(jìn)行過濾和濃縮。利用硅膠層析(柱中裝填有l(wèi):l石油醚/乙酸乙酯，流動(dòng)相為乙酸乙酯)純化粗產(chǎn)物，以得到純化產(chǎn)物(lg，66%)。Rf:0.20(乙酸乙酯)。iH畫NMR(300MHz，CDC13)8(//;附)7.28(2H，d，2J=8.7，ArH);6.91(2H，d，2J=8.7,ArH);6.02(1H，d，3JH2-NHAc=9.2Hz，NHAc);5.08(1H，dd,3J23=10.5Hz，3J3_4=9.2Hz，H3);4.59(1H，d,3jw-9,3Hz，HI);4.54(2H，q，OCH2Ph);4.09(1H，ddd，3J2_3=10.5Hz，3J12=9.3Hz，3Jh2-nhac=9.2Hz;H2);3.78(3H，s，CH30);3.77-3.46(4H，m，H4，H5，H6a，H6b);3.26(1H，bp，OH);2.09和1.96(6H，s，CH3CO)。13C-NMR(75MHz,CDC13)S(/7/7附)171.8,171.4(CH3￡0);159.3(qC，Ar);129.7(qC，Ar);129.4(2xAr￡H);113.8(2xAr￡H);88.8，77.4,75.4,68.6和53.1(Cl-C5);73.4(0￡H2Ph);68.9(￡H2);55.1(0￡H3);22.7和20.7(2><CO￡H3)。針對(duì)C18H24N407(M+Na),FAB-MS的計(jì)算值為431.4，實(shí)測(cè)值為431.4。2-乙酰絲-2-脫氧-3-乙絲-4-叔丁IL^羧甲基-6-0-對(duì)曱H&千基-^D-吡喃葡糖基疊氮化物將NEt3(1.6ml，11.2mmol)加入0。C的糖衍生物(2.28g，5.6mmol)DMF(15ml)溶液中，并攪拌30分鐘。然后，加入溴乙酸叔丁酯(3ml，20.3mmo1)和氧化銀(2.3g，10.2mino1)。在氮?dú)庖约氨芄鈼l件下于室溫過夜攪拌該反應(yīng)物。用DCM(50ml)稀釋該粗反應(yīng)物，并通過硅藻土進(jìn)行過濾。用飽和NaHC03(4x50ml)和水洗滌有機(jī)相。用MgS04干燥有機(jī)相，在減壓下進(jìn)行過濾和濃縮.利用硅膠層析(柱中裝填有l(wèi):l石油醚/乙酸乙酯，流動(dòng)相為1:2)純化粗產(chǎn)物，以得到純化產(chǎn)物(1.67g，57%)。Rf:0.5(乙酸乙酯)。'H-NMR(300MHz，CDC13)5(p戸)7.21(2H，d，3J=8.7，ArH);6.85(2H，d,3J=8.7,ArH);6.35(1H，d，3JH2.NHAc=9.6Hz，NHAc);5.14(1H,dd，3JM=10.9Hz,3J3-4=8.4Hz，H3);4.57(1H，dd，3J3-4=3J4_5=8.4Hz，H4);4.43(1H，d，3J12=11.5Hz，HI);4.02(1H,m,H2);3.98(2H，s,COCg2Br);3.77(3H，s，CH30);3.75-3.58(3H,m，H5，H6a，H6b);2.07和1.95(6H，s,CH3CO);1.41(9H,s，(CH3)3C)。13C-NMR(75MHz，CDC13)S(/;/7附)171.4，170.5，168.6(3x￡0);159.3(qC，Ar);130.1(qC,Ar);129.6，129.4(2xAr￡H);113.8(2xAr￡H);88.7，81.8，76.7,75.1和53.4(C1誦C5);73.2，70.3和67.9(3x￡H2);55.3(0￡H3);28.1(3x￡H3);22.7和20.7(2xCO￡H3)。針對(duì)C24H34N409(M+Na),FAB-MS計(jì)算<￡_為545.5，實(shí)測(cè)值為545.5。2-乙酰^J^-2-脫氧-3,6-二乙?；?4-叔丁氧基羧甲基-^D-吡喃葡糖基疊氮化物將疊氮基糖(145mg，0.28mmol)溶于9:1MeCN/H20(1.5ml)，并加入CAN(307mg，0.56mmol)。1小時(shí)后，TLC(乙酸乙酯)表明該反應(yīng)已完成。用DCM(25ml)稀釋該粗反應(yīng)物，并用飽和NaHC03水溶液(10ml)進(jìn)行洗滌。用MgS04干燥有機(jī)相，在減壓下進(jìn)行過濾和濃縮。利用硅膠層析(柱中裝填有1:1石油醚/乙酸乙酯，流動(dòng)相為1:2)純化粗產(chǎn)物，以得到純化產(chǎn)物(95mg，85%)。Rf:0.5(乙酸乙酯)。iH-NMR(300MHz，CDC13)3)6.32(1H，d，3J=9.6Hz，NHAc);5.17(1H，dd,3J3_4=10.4Hz，J2_3=9.2Hz，H3);4.65(1H,d，3J12=9.2Hz，HI);4.43(1H，dd，2J6"b=12.2Hz，3J56a=2.1Hz，H6a);4.29(1H，dd，2J6a_6b=12.2Hz，3J5_6b=4.7Hz，H6b);4.12-3,96(3H，m，H4，CH2);3.78(1H，m，H5);3.53(1H，dd,3ji陽尸3J23=9.2Hz，H2);2.10，2.08，1.96(9H,s，CH3CO);1.42(9H，s，(CH3)3C)。13C-NMR(75MHz,CDCl3)8(/7/7/w):171.3,170.6,170.4,168.4(4xqC，￡0);88.5，77.5，74.4，70.2，53.3(5><CH，￡l-￡5);82.1(qC，￡(CH3)3);74.4，62.7(2x￡H2);28.0(3xCH3，C(￡H3)3);23.1，21.1，20.8(3xCOCga),針對(duì)C18H28N409(M+Na)，F(xiàn)AB-MS的計(jì)算值為467.4，實(shí)測(cè)值為467.4。2-乙酰M-2-脫氧-3，6-二乙g-4-羧曱基-^D-吡喃葡糖基疊氮化物將單糖衍生物(95mg，0.21mmo1)的TFA/H20(95:5，5ml)溶液在室溫?cái)嚢?小時(shí)。之后，將該溶液濃縮以得到所期望的化合物(82mg，100°/。)。iH畫NMR(300MHz，CDC13)8(/;/wi):6.67(1H，d,3J=9.4Hz，NHAc);5.21(1H，dd，3J23=3J34=9.5Hz，H3);4.68(1H，d，3U.4Hz,HI);4.49(dd，2J6a_6b=11.6Hz,H6a);4.31(dd,2J6"b=11.6Hz，3J5-6b=4.4Hz，H6b);4.24(2H，d，3J=3.7Hz，CH2);4.01(1H，ddd,3J=9.4Hz,H2);3.77(1H,m，H5);3.61(1H，dd，3J3-4=3J4_5=9.5Hz，H4);2.12，2.09和2.03(9H，s，CH3CO)。13C-NMR(75MHz,CDC13)6(/;/wi):171.2，170.4，170.1，168.0(4xqC，￡0);87.7,75.1，74.2，70.1，54.3(5xCH，￡1國(guó)￡5);75.2，63.4(2x￡H2);22.2，20.7(3xCOCga)。針對(duì)C14H20N4O9(M+l)的FAB-MS計(jì)算值為389.33，實(shí)測(cè)值為389.31，(M+Na)為411.25?；衔顰的合成化合物A通用方法使用帶有Teflon濾器并通過Teflon閥與真空廢料室連接的塑料注射式裝配器(syringefitter)來人工進(jìn)行固相肽合成。利用MBHARink酰胺樹脂(載樣量=0.58mmol/g)進(jìn)行糖肽的合成。通用的固相肽合成化合物A的合成規(guī)模為0.05mmol。在每次偶聯(lián)與去保護(hù)步驟之間，通過用DMF中20%哌啶處理(5和15分鐘)來除去Fmoc基團(tuán)。使用各0.25mmol(5份)的HBTU/HOBt和DIPEA進(jìn)行與Fmoc氨基酸的偶聯(lián)反應(yīng)3小時(shí)。使用Kaiser茚三酮測(cè)試來監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。在每次偶聯(lián)和去保護(hù)之間，用DCM和DMF(各5分鐘)洗滌樹脂。通用的StBu去保護(hù)將DTT(100mg)溶于無水DMF(0.9ml)中，并加入2.5%(體積/體積)的DIPEA。攪拌5分鐘后，將該溶液移至肽合成管中，該管中含有與樹脂結(jié)合的經(jīng)StBu保護(hù)的肽。16小時(shí)后，過濾樹脂，并用DMF隨后用DCM徹底洗滌。將該步驟重復(fù)兩次。通用的溴乙酰胺偶聯(lián)將溴乙酰胺(3份/巰基0.05mmolx2個(gè)巰基x3份=0.3mmol)溶于DMF(400nL)和NEt3(65^L，0.45mmol)中，并移至肽合成管中，該管中含有與樹脂結(jié)合的StBu去保護(hù)的肽。使反應(yīng)進(jìn)行24小時(shí)。之后，過濾樹脂，并用DMF和DCM徹底洗滌。通用的Alloc去保護(hù)用DMF/CHCl3/AcOH/iV-甲基嗎啉(NMM)(18.5:18.5:2:1)溶液洗滌樹脂5分鐘。將Pd(PPh3)4(115mg，0.1mmol)溶于DMF/CHCl3/AcOH/NMM(18.5:18.5:2:1)溶液(0,05M)中。在避光的條件下，將該混合物置于氮?dú)庵?小時(shí)。然后，依次用以下溶液洗滌樹脂DMF中0.5°/。DIPEA(體積/體積)(4x2ml)、DMF(6x2ml)、DMF中的0.5%二乙基二硫代氨基曱酸鈉三水合物(重量/體積)(4x2ml)，最后用DMF(6x2ml)洗滌。2-乙酰^J^-2-脫氧-3，6-二乙酰基-4-羧甲基-^D-吡喃葡糖基疊氮化物的偶聯(lián)用DMF(2ml)洗滌樹脂。使用0.25mmol(5份)的糖、HBTU/HOBt和DIPEA進(jìn)行與2-乙St^-2-脫氧-3，6-二乙SfcJ^4-羧甲基-^D-吡喃葡糖基疊氮化物的偶聯(lián)反應(yīng)3小時(shí)。切割化合物A用DCM和DMF洗滌樹脂5次(每次洗滌5分鐘)。通過與切割混合物(95%TFA、2.5%水和2.5%EDT)孵育3小時(shí)而將化合物A從樹脂上切下。隨后用切割混合物洗滌樹脂兩次(每次10分鐘)。用冷的二乙醚沉淀化合物A，并離心10分鐘。將沉淀物重溶于1:1水/乙腈溶液中，并凍千?；衔顰的純化利用反相制備型HPLC-MS(水-乙腈，0.1%TFA)來純化粗產(chǎn)物。純化的產(chǎn)物為19mg(12個(gè)步驟的總產(chǎn)率為18%)?；衔顰的分析數(shù)據(jù)C84H121N13046S2。MW:2113.05。實(shí)測(cè)值(M+l)為2113.05，(M+2)為1057.52。化合物B的合成化合物B將化合物A(5mg，0.0023mmol)和炔丙基溴乙酰胺(0.5mg，0.0023mmol)溶于CHCl3/EtOH/H20(9:1:1)兩相溶液(220)中。加入抗壞血酸鈉(0.5mg,0.0023mmol)和CuS04'5H20(微量，0.0002mmol)。在37。C下，以600rpm過夜攪拌反應(yīng)物。之后，用乙酸乙酉旨稀釋反應(yīng)物，用飽和NaHC03水溶液(3x10ml)進(jìn)行洗滌，并用MgS04干燥有機(jī)相，在減壓下進(jìn)行過濾和濃縮以得到產(chǎn)物(5mg,90%)。分析數(shù)據(jù)C89H127BrN14047S2。MW:2289.06。實(shí)測(cè)值(M+2)1146.15。實(shí)施例3實(shí)施例3的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)儀器利用Bruker250Y設(shè)備，在250和300MHz記錄工HNMR鐠，在63和75MHz記錄13CNMR鐠，在235MHz記錄19FNMR鐠。以/;/wi來記錄化學(xué)位移(5),以Hz來記錄偶合常數(shù)(/)，除非標(biāo)明"寬(br)，，，否則說明信號(hào)是尖銳的，s:單峰，d:雙峰，t:三峰，m:多峰，q:四峰。除非另有指明，否則使用殘留的質(zhì)子性溶劑CDC13(SH:7.26,s)作為iH-NMR鐠的內(nèi)標(biāo)。利用MicromassQuattroLC電噴霧并施加25-60V的電壓來進(jìn)行電噴霧質(zhì)鐠。層析利用包被有硅膠60F2S4的Merck鋁基板進(jìn)行分析型TLC。利用粒徑35-70微米的Fisher硅膠60A進(jìn)行快速層析。使用茴香醛浸漬和UV光(254nm)使組分可見。溶劑和試劑除非另有指明，否則所有試劑和溶劑均為標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)級(jí)并用作補(bǔ)充。如果溶劑被稱為"無水的"，則其購(gòu)買時(shí)為無水級(jí)。在蒸發(fā)前，在減壓下利用無7jC硫酸鎂對(duì)所有的有機(jī)提取物進(jìn)行干燥。N-(炔丙基)-溴乙酰胺OO將炔丙基胺(0.20mL,2.卯mmol)溶于水(30.00mL)中，并立即在NaHC03(5.00g)存在下用溴乙酸酐(3.70g，14.50mmol)進(jìn)行處理。在室溫下攪拌反應(yīng)物16小時(shí)。用5%HCI水溶液(50.00mL)猝滅反應(yīng)，并用乙酸乙酯(3x50.00mL)萃取產(chǎn)物。用NaOH1N(5x100.00mL)和水(2x100.00mL)洗滌有機(jī)相。用MgS04干燥有機(jī)相，在減壓下進(jìn)行過濾和濃縮以得到白色結(jié)晶(0.38g，76%)。Rf:0.33(石油St/乙酸乙酯1:1)。^-NMR(250MHz,CDC13)5(/，/wi):6.78(1H，bp，NH);4.07(2H，q，J=5.4Hz，J=2.6Hz，CH2);3.88(2H，s，COQ^Br);2.27(1H,t，J=2.6Hz,CgX13C-NMR(63匪z，CDC13)5(p/wi):165.3(qC，￡0);78.5(qC，炔)；72.2(CH)，29.9和28.6(CH2)。針對(duì)CsH6BrNO(M+l)的FAB-MS計(jì)算值為174.96，實(shí)測(cè)值為197.85，(M+23)為199.85。L-半胱氨酸J-(7V-炔丙基)-氛基甲酰胺fNaHC03,H20將鹽酸L-半胱氨酸(268mg，1.70mmol)溶于水(2.0ml)中，并加入2-溴乙?；脖０?300mg，1.70mmol)。將固體碳酸氫鈉分成小份加入(放出C02)直至pH達(dá)到8.0。然后，在室溫下再攪拌該反應(yīng)混合物2小時(shí)。之后，將反應(yīng)混合物凍在液氮中并凍干，以得到淺褐色固體的粗產(chǎn)物，可使用而無需進(jìn)一步純化。iH-NMR(300MHz,D20)S(p/7附)3.99(2H，d，J=2.5Hz，C&N);3.93(1H，q，aCg，J=7.7Hz，J=4.3Hz);3.37(2H,s，C(O)Cg2S)，3.17(1H,dd，J=14.8Hz,J=4.3Hz，Cg2S)，3.06(1H,dd，J=14.8Hz,J=7.7Hz，C払S)，2.61(1H,t，J=2.5Hz，Cg)。7V-a-(9-芴基甲IL^n)-L-半胱氨酸-5KiV-炔丙基)n甲酰胺將粗制炔丙基酰胺溶于水(2.0ml)中，并加入Et3N(146pi)。將Fmoc-琥珀酰亞胺(336mg)溶于乙腈(2.0ml)中，將該溶液一次性加入氨基酸水溶液中，在室溫下繼續(xù)攪拌1.5小時(shí)。在整個(gè)反應(yīng)期間監(jiān)測(cè)該反應(yīng)的pH，以確保其維持在8和9之間，必要時(shí)可另外加入Et3N。1.5小時(shí)后，將反應(yīng)混合物蒸發(fā)干燥，將殘余物在二氯曱烷(30.0ml)和2MHCl(30.0ml)之間分層。分離有機(jī)相，用二氯曱烷(1x30.0ml)萃取水相。用2MHCl(25.0ml)和飽和NaCl水溶液(25.0ml)洗滌合并的有機(jī)提取物，用MgS04進(jìn)行千燥，在真空下進(jìn)行過濾并除去溶劑，以得到灰白色固體粗產(chǎn)物。利用快速層析在硅膠(短柱5cm硅膠，洗脫液100%EtOAc，然后是EtOAc中20%MeOH)上對(duì)粗產(chǎn)物進(jìn)行純化，以得到白色泡沫的純化產(chǎn)物(370mg，47%)。Rf=0.05(4:1EtOAc/MeOH)，^-NMR(400MHz,CDC13)5):7.77-7.26(8H，m,ArH);4.41-4.27(3H,m，CHCg20和aCg);3.96(2H，d，J=2.5Hz，CM2N);3.23(2H,s，COCg2S);3.11(1H，dd，J=13.9Hz，J=4.5Hz，CUzS),2.93(IH，dd，J=13.3Hz，J=8.1Hz，C^S),2.56(1H，t，J=2.5Hz，Cg))。針對(duì)<:231122]\2058，ESI-MS的計(jì)算值為438.1249，實(shí)測(cè)值為461.18[MNa+?；衔顲的合成通用方法使用帶有Teflon濾器并通過Teflon閥與真空廢料室連接的塑料注射式裝配器(syringefitter)來人工進(jìn)行固相肽合成。利用MBHARink酰胺樹脂(載樣量=0.58mmol/g)進(jìn)行糖肽的合成。通用的固相肽合成化合物C的合成規(guī)模為0.10mmol。在每次偶聯(lián)與去保護(hù)步驟之間，通過用DMF中的20%(體積/體積)哌啶處理(5和15分鐘)來除去Fmoc基團(tuán)。使用各0.50mmol(5份)的HBTU/HOBt和DIPEA進(jìn)行與Fmoc氨基酸的偶聯(lián)反應(yīng)3小時(shí)。使用Kaiser茚三酮測(cè)試來監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。在每次偶聯(lián)和去保護(hù)之間，用DCM和DMF(各5分鐘)洗滌樹脂。通用的StBu去保護(hù)將DTT(200mg)溶于無水DMF(1.8ml)中，并加入2.5%(體積/體積)的DIPEA。攪拌5分鐘后，將該溶液移至肽合成管中，該管中含有與樹脂結(jié)合的經(jīng)StBu保護(hù)的肽。16小時(shí)后，過濾樹脂，并用DMF、DMF/H20(1:1)混合物、DMF、隨后用DCM徹底洗滌。將該步驟重復(fù)兩次。通用的溴乙酰胺偶聯(lián)將糖溴乙酰胺(2份/巰基0.10mmolx2個(gè)巰基x2份=302mg，0.40mmol)溶于DMF(1.0mL)和臓3(84nL，0.6mmol)中，并移至肽合成管中，該管中含有與樹脂結(jié)合的StBu去保護(hù)的肽。使反應(yīng)進(jìn)行24小時(shí)。之后，過濾樹脂，并用DMF和DCM徹底洗滌。通用的Alloc去保護(hù)用DMF/CHCl3/AcOH/W-甲基嗎啉(NMM)(18.5:18.5:2:1)溶液洗滌樹脂5分鐘。將Pd(PPh3)4(230.00mg，0.2mmol)溶于DMF/CHCl3/AcOH/NMM(18.5:18.5:2:1)溶液(0.05M)中。在避光的條件下，將該混合物置于氮?dú)庵?小時(shí)。再次重復(fù)該過程。最后，依次用以下溶液洗滌樹脂DMF中0.5%DIPEA(體積/體積X4x2.00ml)、DMF(6x2.00ml)、DMF中的0.5%二乙基二硫代氨基曱酸鈉三水合物(重量/體積)(4x2.00ml)，最后用DMF(6x2.00ml)洗滌。2-乙酰胺基-2-脫氧-3，6-二乙it^-4-羧曱基-AD-p比喃葡糖基疊氮化物的偶聯(lián)，以及該分子的全乙?；肈MF(2.00mL)洗滌樹脂。使用2.5份的PyBOP/HOBt和5份的DIPEA進(jìn)行與2-乙酰胺基-2-脫氧-3，6-二乙?；?4-羧甲基-^D-吡喃葡糖基疊氮化物(97mg，0.25mmol,2.5份)的偶聯(lián)反應(yīng)16小時(shí)。重復(fù)該過程。之后，用DCM和DMF徹底洗滌樹脂。從固體支持物上切下化合物C用DCM和DMF洗滌樹脂5次(每次5分鐘)。通過與切割混合物(95%TFA、2，5%水和2.5%EDT)孵育3小時(shí)將完全保護(hù)的前體從樹脂上切下。再次用同樣的切割混合物處理樹脂3小時(shí)。用冷的二乙醚沉淀化合物C，并離心10分鐘。通過吹氮?dú)?0分鐘來干燥沉淀物。用5%肼的水/曱醇(10:1)溶液(6.0ml)重懸沉淀物。在室溫?cái)嚢璺磻?yīng)物24小時(shí)?；衔顲的純化利用反相半制備型HPLC(40分鐘中水-乙腈5%-95%，0.1%TFA)來純化粗產(chǎn)物，凍干后得到+>散的白色固體(35.9mg，47%產(chǎn)率(基于樹脂載樣量))?；衔顲的分析數(shù)據(jù)C56H93N13032S2。MW:1524.79。實(shí)測(cè)值(M+l)1525.79;(M+2)763.48;(M+2+NH2NH2)779.40;795.63(M+2+2NH2NH2)。結(jié)果示于圖ll中。如上文所述產(chǎn)生細(xì)菌來源的促紅細(xì)胞生成素片段在CNBr切割后清除殘佘的帶His^標(biāo)簽的EPO28/33-166如果觀察到CNBr尚未完全切割帶HISn。標(biāo)簽的EPO片段，則將EPO制備物重懸于1ml重懸緩沖液(含有20mMTris-HCl(pH8.0)、500mMNaCl、5mM咪唑、1mMPMSF的6M鹽酸胍)中，并與200預(yù)平衡的結(jié)合有His的樹脂(Novagen)混合。樣品在水上混合4小時(shí)，通過離心使樹脂沉淀。收集上清液，在4。C通過以水透析(在8kDa臨界分子量透析袋中)24小時(shí)而將蛋白質(zhì)沉淀出來。通過離心收集沉淀的蛋白質(zhì)。肽合成使用用于產(chǎn)生肽硫酯的Rink酰胺-MBHA-LL樹脂(載樣量=0.34mmol/g)進(jìn)行肽合成。所有樹脂和Fmoc氨基酸均購(gòu)自Novabiochem。利用MicromassQuattroLC系列電噴霧質(zhì)譜儀獲得質(zhì)譜。使用PhenomenexLUNA<:18柱以及45分鐘中含有0.1%TFA的5-95%乙腈梯度(流速為3.0mL/分鐘)來進(jìn)行半制備型HPLC。所有其它化學(xué)試劑均來自Aldrich。肽疏酯合成(EPO殘基1-28)使用最近由Unverzagt小組所述的雙接頭策略來制備肽硫酯。筒言之，通過與DMF中20%哌咬接觸將rink酰胺樹脂(0.1mmol)去保護(hù)。使用HBTU/HOBt作為偶聯(lián)試劑來偶聯(lián)Fmoc-Phe-OH(5份)。偶聯(lián)時(shí)間為4小時(shí)。在用DMF中20%哌啶除去Fmoc后，通過將樹脂與3國(guó)羧基丙磺酸(50mg，0.3mmo1)、HOB"40mg,0.3mmol)和DIC(47nL，0.3mmol)接觸5小時(shí)來偶聯(lián)磺酰胺接頭。在4:1DCM/DMF中使用7V-曱基咪哇(40fiL，0.5mmol)、DIC(78jiL,0.5mmol)作為偶聯(lián)試劑將第一氨基酸(Fmoc-Gly-OH，每個(gè)偶聯(lián)5份)雙偶聯(lián)16小時(shí)。對(duì)肽(0.05mmol規(guī)模)進(jìn)行延伸(目標(biāo)序列APPRL(I*)CDSR(V*)L(E*)RYLL<E*)A(K*E*A*E*)^X工。TTG畫SBn:)，《吏用成熟的方案在ICH2CN活化后用節(jié)基硫醇將該肽切下2。對(duì)帶星號(hào)的殘基進(jìn)行雙偶聯(lián)，將粗體且有下劃線的半胱氨酸殘基作為上述Fmoc-乙炔化的半胱氨酸衍生物引入。將完全去保護(hù)且沉淀的粗制肽重溶于25%MeCN水溶液中，利用半制備型HPLC進(jìn)行純化。利用ESI-MS對(duì)主峰(保留時(shí)間為26分鐘，6mg,5.3%)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其對(duì)應(yīng)于所期望的產(chǎn)物。將該級(jí)分凍干，并用于隨后的NCL反應(yīng)中(圖12)。蛋白質(zhì)裝配在一個(gè)模式反應(yīng)中，將以乙炔修飾的肽(3.60mg，2.67'1(T3mmol)和C(14.30mg，9.38.103mmol)溶于0.1MPBS緩沖溶液(pH8，l.卯mL)中。將抗壞血酸鈉(13.00mg,6.66'1(T2mmol)和三+基三哇曱胺(TBTA)(35.00mg，6.66'1(T2mmol)加入溶液中。將最終的懸液在冷水浴中超聲處理5分鐘。最后，加入CuSO,5H20(0.67mg，2.67.1CT3mmol，26.70mM，100^L)的PBS溶液。在20。C下，在Eppendorf恒溫混勻儀中以1200rpm將該反應(yīng)物搖動(dòng)24小時(shí)。然后,將該粗制反應(yīng)以14000rpm離心5分鐘，并通過珪藻土塞子(在巴斯德吸管中)進(jìn)行過濾。利用反相半制備型HPLC(40分鐘中水-乙腈5%-95%，0.1。/。TFA)來純化粗產(chǎn)物。將相應(yīng)的級(jí)分進(jìn)行凍干，以獲得松散的白色固體(tR=16.1分鐘)(8.10mg，69%)，以及松散的白色固體C(tR=14.2分鐘)(5.10mg回收的起始材料)。分析數(shù)據(jù)C164H268N40O84S8。MW:4400,6。實(shí)測(cè)值(M+3)1468.6，(M+4(+K))1111.5，(M+4)1101.7，(M+5)881.7，(M+2(糖模擬物-N3))741.9(圖13)。使用連有三唑的溴乙酰胺來進(jìn)行蛋白質(zhì)巰基修飾<image>imageseeoriginaldocumentpage62</image>將所需含有二巰基的肽(1.50mg,1.15.KT3mmol)和溴乙酰胺(9.40mg，5.53'1(T3mmol)溶于0.1M磷酸鈉鹽緩沖液(pH7.4，400.00HL)中。將該混合物在37'C以600rpm過夜孵育。利用反相半制備型HPLC(7jC-乙腈5°/。-95%,40分鐘，0.1%TFA)來純化粗產(chǎn)物。將相應(yīng)的級(jí)分進(jìn)^f亍凍干，以獲得+>散的白色固體(1.70mg，29%)。分析數(shù)據(jù)C17。H279N4308SS8。MW:4541.80。實(shí)測(cè)值(M+3(+K))1528.0，(M+4(+2K))1156.0，(M+5(+2K))925.0,((M+6(+3K))777.5。SDSPAGE和Western印跡通過加入20倍樣品體積的曱醇及丙酮溶液(1:1體積/體積)來沉淀促紅細(xì)胞生成素制備物，在-20。C孵育30分鐘，并利用離心除去溶液。將樣品重溶于20pl的8M尿素中，并用上樣緩沖液煮沸。在上述預(yù)制的18%聚丙烯酰胺凝膠上利用SDSPAGE對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。通過考馬斯染色使電泳后的蛋白質(zhì)可見。在Western印跡中，4吏用TransBlot轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(BioRad)將電泳后的蛋白質(zhì)移至硝酸纖維素膜。將膜在封閉液(16mMNa2HP04，4mMNaH2P04，100mMNaCl，0.1%(體積/體積)吐溫-20，5%(重量/體積)脫脂奶粉)中進(jìn)行封閉，并用經(jīng)同樣溶液稀釋的抗人促紅細(xì)胞生成素單抗(R&Dsystems)進(jìn)行標(biāo)記。用封閉液(不含奶粉)洗掉未結(jié)合的抗體。將膜與綴合有過氧化物酶的抗小鼠IgG(Sigma)—起孵育，如上所述進(jìn)行洗滌，使用SigmaFast3,3，-二氨基聯(lián)苯四鹽酸鹽系統(tǒng)(Sigma)使蛋白質(zhì)可見。自然化學(xué)連接反應(yīng)如上所述，表i^A促紅細(xì)胞生成素(例如，殘基29-166或33-166),并進(jìn)行純化以及制備以用于連接反應(yīng)。將3mg蛋白質(zhì)溶于脫氣連接緩沖液(300mMNaHPO4(pH8.0)，6M鹽i^，1%(重量/體積)MESNa，40mMTCEP，333中。將該溶液與連接緩沖液(500pl)中3mg合成肽硫酯混合，在37'C攪拌反應(yīng)物。在第0、48、96和144小時(shí)，利用SDS-PAGE對(duì)樣品(10nl)進(jìn)行分析?？梢允褂檬惺鄣目筯EPO單抗來容易地觀察到連接，所述單抗識(shí)別前25個(gè)"IL基酸殘基中的一個(gè)連續(xù)表位。Western印跡證實(shí)發(fā)生了連接(注在t=0時(shí)，western印跡是陰性的，因?yàn)榧?xì)菌片段(29-166)不包含所需的表位)。僅l小時(shí)后，便可觀察到分子量正確(18kDa)的產(chǎn)物形成(參見圖14)。權(quán)利要求1.式S-L-X-P的糖肽，其中S選自任選地保護(hù)的單糖、任選地保護(hù)的多糖、聚環(huán)氧烷鏈以及式II的基團(tuán)，式II其中，R1和R3獨(dú)立地選自H或Ac，R4為Ac，R2為式IV的基團(tuán)，式IV其中，R7和R8各自獨(dú)立地選自任選地保護(hù)的單糖和任選地保護(hù)的多糖，A、B、C和D各自獨(dú)立地為1或2，m為1至5；-L-為式III的部分式III，其中，R5和R6獨(dú)立地選自H和Me，n為1至3；和P為包含在其側(cè)鏈具有X原子的至少一個(gè)氨基酸的肽鏈，其中X為氧、硫原子或-CH2-部分。2.權(quán)利要求1所述的糖肽，其中S-為式II的部分，式II其中，Ri和R3獨(dú)立地選自H或Ac，Rt為Ac，R2選自以下基團(tuán)H、任選地保護(hù)的單糖、任選地保護(hù)的多糖和Ac。3.權(quán)利要求2所述的糖肽，其中R2為H或Ac。4.權(quán)利要求2所述的糖肽，其中R2是任選地保護(hù)的單糖，其選自葡萄糖、葡糖胺、半乳糖、N-乙?；咸前?、半乳糖胺、甘露糖、巖藻糖和唾液酸。5.權(quán)利要求2所述的糖肽，其中R2是任選地保護(hù)的多糖，其含有2至5個(gè)組成糖，并且包含葡萄糖、葡糖胺、半乳糖、N-乙?；咸前?、半乳糖胺、甘露糖、巖藻糖和唾液酸中的一種或多種。6.權(quán)利要求l所述的糖肽，其中Rr為式IVA的部分其中，R7和Rs各自獨(dú)立地選自任選地保護(hù)的單糖和任選地保護(hù)的多糖，m為l至5。7.權(quán)利要求1或6所述的糖肽，其中尺7和/或Rs是任選地保護(hù)的多糖，其含有2至5個(gè)組成糖，并且包含葡萄糖、葡糖胺、半乳糖、N-乙酰基葡糖胺、半乳糖胺、甘露糖、巖藻糖和唾液酸中的一種或多種。8.權(quán)利要求1、6或7所述的糖肽，其中R7和/或Rs是任選地保護(hù)的二糖，其中包含葡萄糖、葡糖胺、半乳糖、半乳糖胺、甘露糖、巖藻糖和唾液酸中的一種或多種。9.權(quán)利要求7所述的糖肽，其中R7和/或Rs是含有N-乙?；咸前泛桶肴樘堑亩?，其中半乳糖是該二糖的末端糖組分。10.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的糖肽，其中所述至少一個(gè)氨基酸為半胱氨酸。11.合成如權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述糖肽的方法，該方法包括在堿存在下，將式H-X-P的肽與式S-L-Hal的化合物接觸以形成S-L-X-P,其中S、L和P如權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述，X為氧或石克原子，Hal為Br或I。12.合成如權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述糖肽的方法，該方法包括在合適的催化劑存在下，將式S-N3的化合物與式HC=C-LP-X-P的化合物接觸以形成S-L-X-P，其中S、L、X和P如權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述，-LP-為式VII的部分<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>式VII，R5、R6和n如權(quán)利要求l所述。13.用于與肽連接的化合物，所述化合物具有式I<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其中，S-為式II的部分或聚環(huán)氧烷鏈<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>式II-L-為式III的部分<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>式III，Hal為Br或I;其中，Ri和R3獨(dú)立地選自H或Ac,Rt為Ac，Rs和R6獨(dú)立地選自H和Me，n為1至3;R2選自以下基團(tuán)H、任選地保護(hù)的單糖、任選地保護(hù)的多糖、Ac以及式IV的基團(tuán)，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>式lV其中，R7和R8各自獨(dú)立地選自任選地保護(hù)的單糖和任選地保護(hù)的多牆A、B、C和D各自獨(dú)立地為l或2，和m為1至5。14.權(quán)利要求13中所述的化合物，其中R2是H或Ac。15.權(quán)利要求13中所述的化合物，其中R2是任選地保護(hù)的單糖，所述單糖選自葡萄糖、葡糖胺、半乳糖、N-乙酰基葡糖胺、半乳糖胺、甘露糖、巖藻糖和唾液酸。16.權(quán)利要求13所述的化合物，其中R2是任選地保護(hù)的多糖，其含有2至5個(gè)組成糖，并且包含葡萄糖、葡糖胺、半乳糖、N-乙酰基葡糖胺、半乳糖胺、甘露糖、巖藻糖和唾液酸中的一種或多種。17.權(quán)利要求13所述的化合物，其中R2為式IVA的部分<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>式IVA,其中，R7和R8各自獨(dú)立地選自任選地保護(hù)的單糖和任選地保護(hù)的多糖，m為l至5。18.權(quán)利要求13或17所述的化合物，其中117和/或Rs是任選地保護(hù)的多糖，其含有2至5個(gè)組成糖，并且包含葡萄糖、葡糖胺、半乳糖、N-乙酰葡糖胺、半乳糖胺、甘露糖、巖藻糖和唾液酸中的一種或多種。19.權(quán)利要求13、17或18所述的化合物，其中R7和/或Rs是任選地保護(hù)的二糖，其包含葡萄糖、葡糖胺、半乳糖、半乳糖胺、甘露糖、巖藻糖和唾液酸中的一種或多種。20.權(quán)利要求19所述的化合物，其中R7和/或Rs是含有N-乙酰葡糖胺和半乳糖的二糖，其中半乳糖是該二糖的末端糖組分。21.合成如權(quán)利要求13至20中任一項(xiàng)所述化合物的方法，該方法包括在合適的催化劑存在下，將式V的化合物與式VI的化合物接觸，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>式V<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>l式VI其中S如權(quán)利要求13至20中任一項(xiàng)所述，-lZ-為式VII的部分<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>式VII其中，R5、R6、n和Hal如權(quán)利要求1所述。22.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述催化劑包括Cu(I)或Cu(II)。23.式I(S-L-Hal)或S-N3的化合物在合成糖肽中的用途，其中S選自任選地保護(hù)的單糖、任選地保護(hù)的多糖以及如權(quán)利要求1所述的式II基團(tuán)，其中R2是式IV基團(tuán)、聚環(huán)氧烷鏈，L和Hal如權(quán)利要求l中所述。24.權(quán)利要求23所述的用途，其中S-如權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述。25.權(quán)利要求23或24所述的用途，其中所^JI肽中肽鏈的至少一部分是使用固相合成和/或自然化學(xué)連接來合成的。26.合成式HC三C-LP-X-P化合物的方法，其中-lZ-為式VII的部分其中，Rs和R6獨(dú)立地選自H和Me，n為1至3;其中P為包含在其側(cè)鏈具有X原子的至少一個(gè)氨基酸的肽鏈，其中X為氧或硫原子，該方法包括將在其側(cè)鏈上具有至少一個(gè)X原子之氨基酸與式HC三C丄p-Hal的化合物接觸，以形成HC三C-LP-X-官能化的氨基酸，其中Hal是Br或I，以及在肽鏈裝配中使用所述官能化的氨基酸來形成HCeC-Lp-X-P。27.合成式HC三C-LP-X-P之化合物的方法，其中-LP-為式VII的式VII部分式VII其中，Rs和R6獨(dú)立地選自H和Me，n為1至3;該方法包括提供肽鏈P,其中P為包含在其側(cè)鏈具有X原子的至少一個(gè)氨基酸的肽鏈，其中X為氧或硫原子，并將所述肽鏈與式HCEC-LP-Hal的化合物接觸，以形成HC三C-LP-X誦P，其中Hal為Br或I。全文摘要式S-L-X-P的糖肽，其中S選自任選地保護(hù)的單糖、任選地保護(hù)的多糖、聚環(huán)氧烷鏈以及式II的基團(tuán)，其中R₁和R₃獨(dú)立地選自H或Ac，R₄為Ac，R₂為式IV的基團(tuán)，其中R₇和R₈各自獨(dú)立地選自任選地保護(hù)的單糖和任選地保護(hù)的多糖，A、B、C和D各自獨(dú)立地為1或2，m為1至5；-L-為式III的部分，其中R₅和R₆獨(dú)立地選自H和Me，n為1至3；P為包含至少一個(gè)在其側(cè)鏈具有X原子之氨基酸的肽鏈，其中X為氧、硫原子或-CH₂-部分。文檔編號(hào)C07K1/00GK101535334SQ200780031815公開日2009年9月16日申請(qǐng)日期2007年6月29日優(yōu)先權(quán)日2006年6月30日發(fā)明者哈維爾·布蘭克,德里克·麥克米倫申請(qǐng)人:Ucl商業(yè)有限公司