17-0405-03) 的AKTAPrime,接著用IgG洗脫緩沖液（ThermoScientific, 21004)洗脫。將緩沖液用PBS 更換W純化嵌合抗體AbF46 (下文稱(chēng)為"cMbF46")。
[0210] 1. 3.自嵌合抗體chAbF46構(gòu)建人源化抗體huAbF46
[0211] 1.3. 1.重鏈人源化
[0212] 為了設(shè)計(jì)兩個(gè)域化-重域和冊(cè)-重域，分析與參照例1. 2中純化的小鼠抗體AbF46 的VH基因共享最高同一性/同源性的人種系基因。IgBLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/ igblast/)結(jié)果揭示了VH3-71在氨基酸水平上具有83%的同一性/同一性/同源性。依照 K油at編號(hào)方式限定小鼠抗體AbF46的CDR-H1，CDR-肥，和CDR-冊(cè)。進(jìn)行設(shè)計(jì)W將小鼠抗 體AbF46的CDR引入V冊(cè)-71的框架中。因此，在位置30(S-T)，48(V-L)，73值一腳，和 78(T-L)處進(jìn)行向小鼠AbF46的氨基酸序列的回復(fù)突變。然后，將H1在位置83巧一K) 和84(A-T)處進(jìn)一步突變W最終建立化-重（SEQIDNO:40)和冊(cè)-重（SEQIDNO:41)。
[0213] 為了在設(shè)計(jì)H4-重中使用，通過(guò)BLAST捜索分析人抗體框架。結(jié)果揭示了V冊(cè)亞 型（已知為最穩(wěn)定的）是與小鼠抗體AbF46在框架和序列中非常相似。將小鼠抗體AbF46 的CDR-H1，CDR-肥，和CDR-冊(cè)依照K油at編號(hào)方式限定，并引入V冊(cè)亞型中W構(gòu)建H4-重 (SEQIDN0:4。。
[0214] 1.3. 2.輕鏈人源化
[02巧]為了設(shè)計(jì)兩個(gè)域化-輕域（SEQIDNO: 43)和肥-輕域（SEQIDNO: 44)，分析與小 鼠抗體AbF46的VH基因共享最高同一性/同源性的人種系基因。I濁LAST捜索結(jié)果揭示 了VK4-1在氨基酸水平上具有75 %的同一性/同源性。依照K油at編號(hào)方式限定小鼠抗體 AbF46的CDR-L1，CDR-L2,和CDR-L3。進(jìn)行設(shè)計(jì)W將小鼠抗體AbF46的CDR引入VK4-1的 框架中。因此，在位置36(Y-H)，46(L-M)，和49(Y-I)處進(jìn)行向小鼠AbF46的氨基酸 序列的回復(fù)突變。僅在肥-輕上的位置49(Y-I)處進(jìn)行一處回復(fù)突變。
[0216] 為了設(shè)計(jì)冊(cè)-輕（SEQIDN0:45)，通過(guò)BLAST捜索分析與小鼠抗體AbF46的化基 因共享最高同一性/同源性的人種系基因。因此，選擇VK2-40。發(fā)現(xiàn)小鼠抗體AbF46的化 和VK2-40在氨基酸水平上具有61 %的同一性/同源性。將小鼠抗體的CDR-L1，CDR-L2,和 CDR-L3依照K油at編號(hào)方式限定，并引入VK4-1的框架中。在冊(cè)-輕上的位置36(Y-H)， 46(L-M)，和49(Y-I)處進(jìn)行回復(fù)突變。
[0217] 為了在設(shè)計(jì)H4-輕（SEQIDNO:46)中使用，分析人抗體框架。Blast捜索揭示了 Vkl亞型（已知為最穩(wěn)定的）與小鼠抗體AbF46在框架和序列中非常相似。將小鼠抗體 AbF46的CDR-L1，CDR-L2,和CDR-L3依照K油at編號(hào)方式限定，并引入Vkl亞型中。因此， 在H4-輕上的位置36(Y-H)，46(L-M)，和49(Y-I)處進(jìn)行回復(fù)突變。
[0218] 此后，用EcoRI(肥B，R0101巧和化〇1(肥B，R0146S)消化具有重鏈核巧酸序列 化 1-重；SEQIDN0:47,冊(cè)-重；SEQIDN0:48,H4-重；SEQIDN0:49)的DNA片段和具有 輕鏈核巧酸序列化 1-輕；SEQIDNO:50,肥-輕；SEQIDNO:51，冊(cè)-輕；SEQIDNO:52， H4-輕；SEQIDN0:53)的DM片段，之后將其分別克隆到封裝于化tiC冊(cè)TM抗體表達(dá)試 劑盒（產(chǎn)品目錄編號(hào)12762-019,Invitrogen)中的pOptiVECTM-TOPOTA克隆試劑盒和 PCDNATM3. 3-T0P0TA克隆試劑盒（產(chǎn)品目錄編號(hào)8300-01)中，從而構(gòu)建重組載體W表達(dá)人 源化抗體。
[0219] 使用QiagenMaxipr巧試劑盒（產(chǎn)品目錄編號(hào)12662)擴(kuò)增每種構(gòu)建的載體，并 使用化ees切l(wèi)e?MAX293表達(dá)系統(tǒng)（Invitrogen)實(shí)施瞬時(shí)表達(dá)。使用293F細(xì)胞進(jìn)行表 達(dá)，并將其W懸浮培養(yǎng)形式在化eeS切l(wèi)e?293表達(dá)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在瞬時(shí)表達(dá)前1天時(shí)， W5xl05個(gè)細(xì)胞/ml的濃度提供細(xì)胞，并且在24小時(shí)后，在細(xì)胞數(shù)目達(dá)到1x10 6個(gè)細(xì)胞/ml 時(shí)，實(shí)施瞬時(shí)表達(dá)。通過(guò)使用化eest^e?MAX試劑（Invitrogen)的脂質(zhì)體試劑方法實(shí)施 轉(zhuǎn)染，其中在15ml管中，將DNAW1:1(重鏈DNA:輕鏈DNA)的混合物比率提供，并與2ml OptiPro?SFM(invt;rogen)混合（管A)，并在另一個(gè) 15ml管中，將lOOul(微升）Rreest5de? MAX試劑和2ml化tiPro?SFM混合（管B)，接著混合管A和管B，并溫育15分鐘。將獲得 的混合物與瞬時(shí)表達(dá)前1天提供的細(xì)胞緩慢混合。在完成轉(zhuǎn)染后，將細(xì)胞在13化pm培養(yǎng)箱 中在37°C，80%濕度，和8%C〇2的條件下溫育5天。
[0220] 在離屯、后，將上清液應(yīng)用于AKTAPrime(GEHealthcare)W純化抗體。在該點(diǎn)上， 將100血上清液W5血/min的流速加載到裝備有蛋白A柱佑Ehealthcare, 17-0405-03) 的AKTAPrime,接著用IgG洗脫緩沖液（ThermoScientific, 21004)洗脫。將緩沖液用PBS 更換W純化人源化抗體AbF46 (下文稱(chēng)為"huAbF46" )。W下實(shí)施例中使用的人源化抗體 huAbF46 包含H4-重（SEQIDN0:42)和H4-輕（SEQIDN0:46)的組合。
[0221] 1. 4.huAbF46抗體的scFV文庫(kù)的構(gòu)建
[0222] 為了用于自huAbF46抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)構(gòu)建huAbF46抗體的scFv，對(duì)于重 鏈和輕鏈可變區(qū)中的每種，基因設(shè)計(jì)為具有"VH-接頭-VL"的結(jié)構(gòu)，其中接頭具有氨基酸 序列"GLGGLGGGGSGGGGSGGSSGVGS"(SEQIDN0:54)。編碼huAbF46 的設(shè)計(jì)的scFv的多核 巧酸序列（SEQIDN0:55)在Bioneer合成，并且多核巧酸的表達(dá)載體具有SEQIDN0:56 的核巧酸序列。
[022引在表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物展現(xiàn)出對(duì)c-Met的特異性。
[0224] 1. 5.構(gòu)建文庫(kù)基因W進(jìn)行親和力成熟
[0225] 1. 5. 1.祀CDR的選擇和引物的合成
[0226] 在W下步驟中實(shí)現(xiàn)huAbF46的親和力成熟。首先，依照K油at編號(hào)方式限定6個(gè) 互補(bǔ)決定區(qū)（CDRs)。下文表7中給出CDR。
[0227] 表 7 [022引
[0229] ~為了用于將隨機(jī)序列引入抗體的CDR中，如下設(shè)計(jì)引物。常規(guī)地，利用N密碼子 W將相同比率的堿基（25%A，25%G，25%C，25%T)引入期望的突變位點(diǎn)中。在此實(shí)驗(yàn) 中，W如下的方式進(jìn)行隨機(jī)堿基對(duì)huAbF46的CDR的引入，從而在編碼每個(gè)CDR的野生型多 核巧酸中每個(gè)密碼子的=個(gè)核巧酸中，第一個(gè)和第二個(gè)核巧酸在整個(gè)序列的85 %里是保守 的，而其它=種核巧酸W相同的百分比（各5%)引入，并且對(duì)第=個(gè)核巧酸賦予相同概率 (33%G，33%C，33%T)。
[0230] 1. 5. 2.構(gòu)建huAbF46抗體的文庫(kù)和針對(duì)c-Met的親和力
[0231] 使用W與參照例1.5. 1中相同的方式合成的引物實(shí)施經(jīng)由引入隨機(jī)序列的抗體 基因文庫(kù)構(gòu)建。使用覆蓋huAbF46的scFV的多核巧酸作為模板獲得兩個(gè)PCR產(chǎn)物，并將 其進(jìn)行重疊延伸PCRW給出僅突變期望的CDR的huAbF46抗體的scFv文庫(kù)基因。構(gòu)建從 scFV文庫(kù)基因制備的祀向6個(gè)CDR中每個(gè)的文庫(kù)。
[0232] 將每個(gè)文庫(kù)的針對(duì)c-Met的親和力與野生型的針對(duì)c-Met的親和力比較。與野 生型相比，大多數(shù)文庫(kù)在針對(duì)c-Met的親和力上更低。針對(duì)c-Met的親和力在一些突變體 中得到保持。
[0233] 1.6.自文庫(kù)選擇具有改善的親和力的抗體
[0234] 在針對(duì)c-Met的構(gòu)建文庫(kù)的親和力成熟后，分析來(lái)自每個(gè)克隆的scFv的核巧酸序 列。如此獲得的核巧酸序列匯總于表8,并轉(zhuǎn)化成IgG形式。在隨后的實(shí)驗(yàn)中使用分別自克 隆L3-1，L3-2,L3-3,和L3-5生成的4種抗體。
[02巧]表8 [0236]
[0237] 1. 7.將選擇的抗體轉(zhuǎn)化成IgG
[023引將編碼4種選擇抗體的重鏈的相應(yīng)多核巧酸設(shè)計(jì)為具有"EcoRI-信號(hào)序 列-VH-Nhel-CH-XhoI"(SEQIDNO: 38)的結(jié)構(gòu)。將huAbF46抗體的重鏈原樣使用，因 為其氨基酸在親和力成熟過(guò)程中沒(méi)有改變。然而，在較鏈區(qū)的情況中，采用U6-HC7較鏈 (SEQIDN0:57)替換人IgGl的較鏈。對(duì)于輕鏈，還將基因設(shè)計(jì)為具有"EcoRI-信號(hào)序 列-VL-BsiWI-CL-XhoI"的結(jié)構(gòu)。編碼親和力成熟后選擇的4種抗體的輕鏈可變區(qū)的多核巧 酸在Bioneer合成。然后，用EcoRI(肥B，R0101巧和化01 (肥B，R0146巧消化具有重鏈核巧 酸序列（SEQIDN0:38)的DNA片段和具有輕鏈核巧酸序列的DNA片段（包含L3-1-衍生的 〔0尺-1^3的0臟片段記69 10側(cè):58，包含1^3-2衍生的〔01?-1^3的0臟片段記69 10側(cè):59， 包含L3-3衍生的CDR-L3的DNA片段；SEQIDNO:60,和包含L3-5衍生的CDR-L3的DNA片 段；SEQIDNO: 61)，之后將其分別克隆到封裝于化tiC冊(cè)TM抗體表達(dá)試劑盒（產(chǎn)品目錄編 號(hào) 12762-019,Invitrogen)中的pOptiVECTM-TOPOTA克隆試劑盒和PCDNATM3. 3-T0P0TA 克隆試劑盒（產(chǎn)品目錄編號(hào)8300-01)中，從而構(gòu)建重組載體W表達(dá)親和力成熟的抗體。
[0239] 使用QiagenMaxipr巧試劑盒（產(chǎn)品目錄編號(hào)12662)擴(kuò)增每種構(gòu)建的載體，并 使用化eest^e?MAX293表達(dá)系統(tǒng)（Invitrogen)實(shí)施瞬時(shí)表達(dá)。使用293F細(xì)胞進(jìn)行表 達(dá)，并將其W懸浮培養(yǎng)形式在化eeS切l(wèi)e?293表達(dá)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在啟動(dòng)瞬時(shí)表達(dá)前1天 時(shí)，W5xl05個(gè)細(xì)胞/ml的濃度提供細(xì)胞，并且在24小時(shí)后，在細(xì)胞數(shù)目達(dá)到1x10 6個(gè)細(xì)胞 /ml時(shí)，實(shí)施瞬時(shí)表達(dá)。通過(guò)使用化eest^e?MAX試劑（Invitrogen)的脂質(zhì)體試劑方法實(shí) 施轉(zhuǎn)染，其中在15ml管中，將DNAW1:1(重鏈DNA:輕鏈DNA)的混合物比率提供，并與2ml OptiPro?SFM(invt;rogen)混合（管A)，并在另一個(gè) 15ml管中，將lOOul(微升）Rreest5de? MAX試劑和2ml化tiPro?SFM混合（管B)，接著混合管A和管B，并溫育15分鐘。將獲得 的混合物與瞬時(shí)表達(dá)前1天提供的細(xì)胞緩慢混合。在完成轉(zhuǎn)染后，將細(xì)胞在13化pm培養(yǎng)箱 中在37°C，80%濕度，和8%C〇2的條件下溫育5天。
[0240] 在離屯、后，將上清液應(yīng)用于AKTAPrime(GEHealthcare)W純化抗體。在該點(diǎn)上， 將100血上清液W5血/min的流速加載到裝備有蛋白A柱佑Ehealthcare, 17-0405-03) 的AKTAPrime,接著用IgG洗脫緩沖液（ThermoScientific, 21004)洗脫。將緩沖液用 PBS更換W純化4種親和力成熟的抗體（下文分別稱(chēng)為"huAbF46-H4-Al(L3-1起源）， huAbF46-H4-A2(L3-2 起源），huAbF46-H4-A3(L3-3 起源），和huAbF46-H4-A5(L3-5 起 源）"）。
[0241] 1.8.構(gòu)建恒定區(qū)和/或較鏈區(qū)替代的huAbF46-H4-Al
[0242] 在參照例1. 7中選擇的4種抗體中，發(fā)現(xiàn)huAbF46-H4-Al在針對(duì)c-Met的親和力 上最高且在Akt磯酸化和c-Met降解程度上最低。在該抗體中，將較鏈區(qū)，或恒定區(qū)和較鏈 區(qū)替代。
[0243] 抗體huAbF46-H4-Al(U6-肥7)由重鏈和輕鏈構(gòu)成，所述重鏈包含huAbF46-H4-Al 的重鏈可變區(qū)，U6-HC7較鏈，和人IgGl恒定區(qū)的恒定區(qū)，所述輕鏈包含huAbF46-H4-Al的輕 鏈可變區(qū)和人kappa恒定區(qū)?？贵whuAbF46-H4-Al(IgG2較鏈）由重鏈和輕鏈組成，所述重 鏈包含重鏈可變區(qū)，人IgG2較鏈區(qū)，和人IgGl恒定區(qū)，所述輕鏈包含huAbF46-H4-Al的輕 鏈可變區(qū)和人kappa恒定區(qū)。抗體huAbF46-H4-Al(IgG2Fc)由huAbF46-H4-Al的重鏈可變 區(qū)，人IgG2較鏈區(qū)，和人IgG2恒定區(qū)，和包含huAbF46-H4-Al的輕鏈可變區(qū)和人kappa恒 定區(qū)的輕鏈構(gòu)成。因此，輕鏈的人kappa恒定區(qū)上第36位的組氨酸殘基在所有S種抗體中 改變?yōu)槔野彼醀提高抗體生成。
[0244] 為了用于構(gòu)建S種抗體，編碼由huAbF46-H4-Al的重鏈可變區(qū)，U6-HC7較鏈 區(qū)，和人IgGl恒定區(qū)構(gòu)成的多膚（SEQIDN0:62)的多核巧酸（SEQIDN0:63)，編碼 由huAbF46-H4-Al的重鏈可變區(qū)，人IgG2較鏈區(qū)，和人IgGl恒定區(qū)構(gòu)成的多膚（SEQID N0:64)的多核巧酸（SEQIDN0:65)，編碼由huAbF46-H4-Al的重鏈可變區(qū)，人IgG2較鏈 區(qū)，和人IgG2恒定區(qū)構(gòu)成的多膚（SEQIDN0:66)的多核巧酸（SEQIDN0:67)，和編碼由 huAbF46-H4-Al的輕鏈可變區(qū)（其中用酪氨酸殘基替換第36位的組氨酸）和人kappa恒 定區(qū)構(gòu)成的多膚（SEQIDN0:68)的多核巧酸（SEQIDN0:69)在Bioneer合成。然后，將 具有重鏈核巧酸序列的DNA片段插入封裝于化tiC冊(cè)TM抗體表達(dá)試劑盒（產(chǎn)品目錄編號(hào) 12762-019,Invitrogen)中的pOptiVECTM-TOPOTA克隆試劑盒中，而將具有輕鏈核巧酸序 列的DNA片段插入PCDNATM3. 3-T0P0TA克隆試劑盒（產(chǎn)品目錄編號(hào)8300-01)中，從而構(gòu) 建載體W表達(dá)抗體。
[024引使用QiagenMaxipr巧試劑盒（產(chǎn)品目錄編號(hào)12662)擴(kuò)增每種構(gòu)建的載體，并使 用化ees切l(wèi)e?MAX293表達(dá)系統(tǒng)（Invitrogen)實(shí)施瞬時(shí)表達(dá)。使用293F細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，并 將其W懸浮培養(yǎng)形式在化eeSt^e?293表達(dá)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在瞬時(shí)表達(dá)前1天時(shí)，W5xl05 個(gè)細(xì)胞/ml的濃度提供細(xì)胞，并且在24小時(shí)后，在細(xì)胞數(shù)目達(dá)到IxlO6個(gè)細(xì)胞/ml時(shí)，實(shí)施 瞬時(shí)表達(dá)。通過(guò)使用化eest^e?MAX試劑（Invitrogen)的脂質(zhì)體試劑方法實(shí)施轉(zhuǎn)染，其中 在15ml管中，將DNAW1:1 (重鏈DNA:輕鏈DNA)的混合物比率提供，并與2ml0ptiPro?SFM (irwtrogen)混合（管A),并在另一個(gè)15ml管中，將lOOul(微升）化eest}de?MAX試劑和 2ml化tiPro?SFM混合（管B)，接著混合管A和管B，并溫育15分鐘。將獲得的混合物與 瞬時(shí)表達(dá)前1天提供的細(xì)胞緩慢混合。在完成轉(zhuǎn)染后，將細(xì)胞在13化pm培養(yǎng)箱中在37°C， 80%濕度，和8%CA的條件下溫育5天。
[0246] 在離屯、后，將上清液應(yīng)用于AKTAPrime(GEHealthcare)W純化抗體。在該點(diǎn)上， 將100血上清液W5血/min的流速加載到裝備有蛋白A柱佑Ehealthcare, 17-0405-03) 的AKTAPrime,接著用IgG洗脫緩沖液（ThermoScientific, 21004)洗脫。將緩沖液用 PBS更換W最終純化 3 種抗體化uAbF46-H4-Al(U6-HC7)，huAbF46-H4-Al(IgG2 較鏈），和 huAbF46-H4-Al(IgG2Fc))。在S種抗體中，將huAbF46-H4-Al(IgG2Fc)代表性選出W用于 W下的實(shí)施例，并且稱(chēng)為抗c-Met抗體L3-lY/IgG2。
[0247] 參照例2 ;異種移植物模型和測(cè)試樣品的制備
[024引經(jīng)由腹膜內(nèi)注射嫁接有患者衍生腫瘤組織（腫瘤；非小細(xì)胞肺癌（NSCLC))的14 種小鼠異種移植物模型自化cotestGmbH(Germany)獲得。
[0249] 分別對(duì)14種小鼠異種移植物模型施用候選藥物最終形式（L3-lY/IgG2 ;n(每個(gè)模 型的）=10)和空媒介物（對(duì)照；n(每個(gè)模型的）=10)，并且測(cè)量每個(gè)模型中的腫瘤大 小，由此測(cè)定對(duì)抗體的響應(yīng)。
[0250] 將L3-lY/IgG2 -周一次W5mg/kg的量施用（在對(duì)照的情況中，施用PBS緩沖液）， 其中從在小鼠