同時(shí)檢測(cè)小鼠血液和肝臟組織中脂肪酸含量的氣相色譜方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及氣相色譜方法，尤其涉及同時(shí)檢測(cè)小鼠血液和肝臟組織中脂肪酸含量 的氣相色譜方法，屬于脂肪酸含量的氣相色譜檢測(cè)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 脂肪酸是天然油脂與水發(fā)生分解反應(yīng)生成的脂肪族羧酸化合物，是脂類的重要組 成部分，所以脂肪酸的性質(zhì)會(huì)極大地影響甘油三酯、磷酯和糖脂等的特性。目前發(fā)現(xiàn)的天然 脂肪酸有200多種，廣泛存在于動(dòng)植物油脂中。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)中碳原子的數(shù)目，可分為短鏈 脂肪酸（2~6)、中鏈脂肪酸（8~12)、長(zhǎng)鏈脂肪酸（14~26);根據(jù)碳原子雙鍵的數(shù)目（飽 和度）可分為飽和脂肪酸（SFA)、單不飽和脂肪酸（MUFA)和多不飽和脂肪酸（PUFA);隨著 營養(yǎng)科學(xué)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)雙鍵所在的位置會(huì)影響脂肪酸的營養(yǎng)價(jià)值，因此又按其雙鍵位置不 同將不飽和脂肪酸進(jìn)行分類。根據(jù)甲基端第一個(gè)雙鍵所連接碳原子的編號(hào)可分為n-3族、 n-6族、n-7族、n-9族（也可用《編號(hào)）。其中，n-3族和n-6族不飽和脂肪酸與人類的健 康密切相關(guān)，具有重要的生物學(xué)意義。
[0003] 氣相色譜法是脂肪酸分析中最常用的方法，也是國際標(biāo)準(zhǔn)化組織（ISO)和美國油 脂化學(xué)學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)（A0CS)中所采用的方法。從組織中提取出的脂肪酸（特別是12碳以上的 長(zhǎng)碳鏈脂肪酸），由于沸點(diǎn)高、極性強(qiáng)、高溫下不穩(wěn)定，分析中易造成損失。因此，對(duì)脂肪酸組 分分析時(shí)，必須把脂肪酸類脂鍵斷開，得到的游離脂肪酸經(jīng)衍生化后生成較易揮發(fā)、極性偏 弱的衍生物才能進(jìn)行氣相色譜（GC)分析。
[0004] 研宄表明脂肪酸與胰島素抵抗、冠狀動(dòng)脈疾病、高血壓、肥胖等慢性病密切相關(guān)。 因此，建立血清及肝組織中脂肪酸的定性、定量及快速檢測(cè)方法對(duì)醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研宄及臨床檢 驗(yàn)均具有極其重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是建立一種同時(shí)檢測(cè)小鼠血液和肝臟組織中脂肪酸 含量的氣相色譜方法，該方法適于檢測(cè)的脂肪酸種類多、沸點(diǎn)范圍較大，分離效果好，具有 準(zhǔn)確度好、重現(xiàn)性穩(wěn)定、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：
[0007] 本發(fā)明公開了一種同時(shí)檢測(cè)小鼠血液和肝臟組織中脂肪酸含量的氣相色譜方法， 包括以下步驟：（1)采集待檢測(cè)小鼠的血液，分離血清；或者，提取待檢測(cè)小鼠肝臟組織中 的脂肪酸；（2)將步驟（1)所分離的血清或提取的脂肪酸進(jìn)行皂化甲酯化；（3)采用氣相色 譜進(jìn)行定性定量測(cè)定。
[0008] 其中，步驟（1)采用Folch法提取待檢測(cè)小鼠肝臟組織中的脂肪酸。經(jīng)過兩次抽 提，此種方法損失較小，提取全面，效果比較好。
[0009] 作為參考：取肝臟組織100mg，將肝臟組織剪碎置勻漿器中，加入lmL生理鹽水， 冰浴中研磨成勻漿，加入三氯甲烷2mL、甲醇lmL，充分混勻，共重復(fù)兩次，合并兩次提取液， 3000r/mim離心lOmin，除去上層液相，下層有機(jī)相在氮?dú)饬鞔蹈?，?20°C冰箱中保存?zhèn)?用。
[0010] 本發(fā)明在血清的處理中，分別采用了經(jīng)典的Floch法和直接甲酯化的方式，經(jīng)過 檢測(cè)脂肪酸含量，發(fā)現(xiàn)二者差別不顯著，因此采用了省時(shí)省力的直接甲酯化的方式。
[0011] 本發(fā)明方法步驟⑵所述皂化甲酯化采用的試劑為質(zhì)量分?jǐn)?shù)13%BF3-甲醇溶液； 所述皂化甲酯化的溫度為40-KKTC;優(yōu)選為60°C;皂化甲酯化的時(shí)間為30-60min;優(yōu)選為 40min〇
[0012] 作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述皂化甲酯化的操作為：
[0013] 取肝臟組織100mg，采用Folch法提取脂肪酸；或者，血清lOOyL;然后，加 0? 5mol/LK0H-甲醇溶液lmL，充氮?dú)饷芊猓?0°C水浴10min，加13%BF3-甲醇溶液1. 5mL， 60°C水浴40min，取出置冷，加入正己烷1. 5mL，渦流lmin提取。加入飽和氯化鈉溶液2mL， 離心3000r/min，15min，靜置5min，取上層液于螺口試管中，吹入氮?dú)?，密封?°C冰箱保存。
[0014] 本發(fā)明方法步驟（3)所述氣相色譜的條件包括：毛細(xì)管色譜柱為DB-23毛細(xì)管柱， 規(guī)格為 30mX0. 25mmX0. 25ym;載氣為氮?dú)猓?9. 999%):流速50mL/min;氫氣：流速50mL/ min，空氣：流速500mL/min;進(jìn)樣量為1yL;分流比為1 :30 ;進(jìn)樣器溫度240°C;檢測(cè)器溫度 260。。。
[0015] 升溫程序?yàn)椋撼跏贾鶞?0°C，保持2min，升溫速率15-22°C/min，升到170°C保 持lmin，1-10°C/min升至240°C保持10min;優(yōu)選為，初始柱溫50°C，保持2min，升溫速率 20°C/min，升到 170°C保持lmin，2°C/min升至 240°C保持 10min。
[0016] 本發(fā)明方法適于檢測(cè)的脂肪酸種類包括：C12:0、C14:0、C15:0、C16:0、C17:0、 C18:0、C18:1、C18:2、C18:3、C20:0、C22:0、C23:0、C20:1、C20:2、C20:3、C20:4、C22:6〇
[0017] 本發(fā)明根據(jù)待檢測(cè)脂肪酸與脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間一致，確定為目標(biāo)脂肪酸； 根據(jù)脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度與色譜峰面積做線性回歸，得到相應(yīng)的線性回歸方程，根據(jù)小鼠血 清或肝臟組織中脂肪酸的峰面積帶到相應(yīng)的線性回歸方程，計(jì)算目標(biāo)脂肪酸的相應(yīng)濃度。
[0018] 本發(fā)明對(duì)皂化甲酯化的溫度、時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。水浴溫度分別為40、50、60、 70、80、90、100°〇，加熱401^11，氣相色譜升溫程序?yàn)?：初始柱溫501：，保持21^11，升溫速率 20°C/min，升到170°C保持lmin，2°C/min升至240°C保持10min;觀察脂肪酸含量與水浴 溫度的關(guān)系。結(jié)果表明，同種脂肪酸在水浴溫度60°C的峰面積比40、50、70、80、90和100°C 的峰面積大，且差異顯著（P〈〇. 01或P〈〇. 05)。
[0019]本發(fā)明進(jìn)一步在水浴溫度為60°C條件下，加熱30、35、40、45、50、55、60min進(jìn)行單 因素試驗(yàn)，考察脂肪酸含量與水浴時(shí)間的關(guān)系。結(jié)果表明，同種脂肪酸在加熱40min的峰面 積比加熱30、35、45、50、55和60min的峰面積大，差異顯著（P〈0. 01或P〈0. 05)。
[0020] 本發(fā)明還對(duì)色譜條件的升溫程序進(jìn)行優(yōu)化，分別設(shè)計(jì)了 7種升溫程序，考察對(duì)飽 和、不飽和脂肪酸峰面積的影響。結(jié)果表明，升溫程序?yàn)椋撼跏贾鶞?0°C，保持2min，升溫速 率20°C/min，升到170°C保持lmin，2°C/min升至240°C保持10min的條件下，同種脂肪酸 的峰面積分別大于其他6種升溫程序，差異顯著（P〈0. 01或P〈0. 05)。
[0021] 應(yīng)用本發(fā)明方法檢測(cè)的小鼠血清和肝臟中脂肪酸的平均回收率分別在81. 53%~ 100. 72%和 80. 72%~100. 62%，精密度分別在 0? 44%~5. 51%和 0? 58%~5. 74%;脂肪 酸的檢測(cè)限在100~300ng/mL，定量限在150~500ng/mL。
[0022] 應(yīng)用本發(fā)明同時(shí)檢測(cè)小鼠血液和肝臟組織中脂肪酸含量的氣相色譜方法，檢測(cè) NAFLD小鼠血清和肝臟中脂肪酸的含量。結(jié)果表明，NAFLD小鼠肝臟中占主要含量的C16: 0、 C18:0、C18:1和C18:2等呈現(xiàn)顯著地上升，而C22:6的含量有所下降，提示肝臟中脂肪酸代 謝的明顯異常。