一種煙草中糖苷鍵合態(tài)香味成分的測定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種煙草中糖苷鍵合態(tài)香味成分的測定方法，屬于煙草分析領(lǐng)域。 二、
【背景技術(shù)】
[0002] 人們抽煙的主要目的是享受煙草在燃吸過程中所產(chǎn)生的愉快香味，滿足心理上和 生理上的需求，所以煙草香味是煙草品質(zhì)的中心因素。20世紀(jì)70年代以來，國內(nèi)外對煙草 的致香成分進(jìn)行了大量的研宄，報道，對于天然植物，致香成分不僅以游離態(tài)的形式存在， 還以糖苷等鍵合態(tài)形式存在。煙草匯總某些揮發(fā)性香味物質(zhì)很大一部分是以糖苷的形式存 在于煙葉中的，它們對于煙草調(diào)制、香氣釋放、感官品質(zhì)都有著重要的影響。
[0003] 糖苷是糖或糖的衍生物與配基通過苷鍵連接形成的化合物，煙草中的糖苷類物質(zhì) 是煙葉在生長過程中形成的次級代謝產(chǎn)物，分子量較大，沸點(diǎn)較高，香氣較少或本身沒有香 氣，但在卷煙燃吸過程中經(jīng)高溫加熱或燃燒裂解能釋放出香氣香味，對卷煙的品質(zhì)有著很 大的貢獻(xiàn)。
[0004] 糖苷類潛香物質(zhì)的開發(fā)與應(yīng)用是目前煙草香精香料的重要方向，但由于分析手段 的瓶頸，目前對于煙草內(nèi)源潛香物質(zhì)特別是糖苷鍵和態(tài)香味成分還沒有深入地理解和充分 地利用。糖苷類化合物具體是以什么結(jié)合態(tài)形式存在，各煙葉中的組成與含量的差異以及 如何向煙氣中轉(zhuǎn)移等，研宄較少。而且，由于糖苷類物質(zhì)為煙葉次級代謝產(chǎn)物，種類繁多且 難以獲得標(biāo)樣，普通方法無法進(jìn)行準(zhǔn)確的定性定量的研宄。目前常用的分析方法為酸解或 酶解處理，然后通過氣質(zhì)聯(lián)用分析，其缺點(diǎn)在于酸解作用比較劇烈，不具選擇性，不能真實(shí) 反映煙草中糖苷類成分；而酶解耗時較長，對于酶的選擇要求較高，且無法準(zhǔn)確地判斷糖苷 糖元部分的組成。 三、
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明旨在提供一種煙草中糖苷鍵合態(tài)香味成分的測定方法，以解決現(xiàn)有分析方 法的不足，能夠全面、準(zhǔn)確地對煙草中糖苷鍵合態(tài)香味成分進(jìn)行定性和定量分析。
[0006] 本發(fā)明煙草中糖苷鍵合態(tài)香味成分的測定方法包括以下步驟：
[0007] (1)提?。簩熑~干燥粉碎后過40目篩得煙末，稱取lg煙末放入容器中，加入 20-50mL提取溶劑，提取糖苷鍵和態(tài)香味成分，取上清液過濾后，減壓蒸干溶劑得到煙草糖 苷粗提物。
[0008] ⑵分離純化：將步驟⑴得到的煙草糖苷粗提物溶于10mL去離子水中，加到固 相萃取柱上，以0. 5mL/min緩慢通過固相萃取柱，再依次用20mL超純水、15mL正戊烷/二氯 甲烷（體積比2:1)洗脫，洗脫速度不超過1.0mL/min，最后用20mL甲醇洗脫，洗脫速度為 2.OmL/min，收集甲醇洗脫液，濃縮至干得到煙草糖苷精提物。
[0009] (3)衍生化：向步驟⑵得到的煙草糖苷精提物中加入內(nèi)標(biāo)溶液lmL(2-硝基 苯-0 -D-葡萄糖苷的甲醇溶液，濃度1.Omg/mL)，N2吹干，加入400yL衍生化溶劑和400yL 酰化試劑，密封后于50-80°C水浴衍生化60min，冷卻至室溫，得到煙草糖苷衍生化產(chǎn)物。
[0010] (4)分析：
[0011] 對煙草糖苷衍生化產(chǎn)物進(jìn)行氣質(zhì)聯(lián)用分析。
[0012] 色譜條件：色譜柱為DB-5MS柱（30m*0. 25mm*0. 25ym)，程序升溫，起始溫度 120°C，保持lmin，以 3°C/min升至 220°C，再以 5°C/min升至 280°C，保持lOmin。進(jìn)樣量 l.OuL，分流比10:1，進(jìn)樣口溫度240°C。
[0013] 質(zhì)譜條件：離子源溫度230°C，四級桿溫度150°C，離子化方式EI，電子能量70eV， 掃描模式為全掃描，質(zhì)量范圍40-600amu。苷元采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及NIST譜庫比照定性，定量采 用與內(nèi)標(biāo)2-硝基苯--D-葡萄糖苷的衍生化產(chǎn)物面積比來計算（假定響應(yīng)系數(shù)相等）。
[0014] 本發(fā)明所述煙草包括烤煙、白肋煙或香料煙。
[0015] 所述提取過程包括超聲提取、震蕩提取或索氏提取。
[0016] 所述提取溶劑包括水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、或丙酮。
[0017]所述SPE固相萃取柱填料包括AmberliteXAD-2 (美國Sigma公司）、D101 (安徽 三星樹脂）或HP-20(日本三菱化學(xué)），均為市售商品。
[0018] 所述衍生化溶劑包括二氯甲烷、丙酮或吡啶。
[0019] 所述?；噭┌ù姿狒?、N-甲基-二（三氟乙酰胺）、三氟乙酸酐、五氟丙酸酐 或七氟丁酸酐。
[0020] 本發(fā)明不僅能對煙草中糖苷鍵合態(tài)香味成分進(jìn)行完全的提取，而且能對其進(jìn)行有 效的分離和純化。同時，利用衍生化以及氣質(zhì)聯(lián)用方法分析，能夠全面、準(zhǔn)確地對煙草中糖 苷鍵和態(tài)香味成分進(jìn)行定性和定量分析。較傳統(tǒng)的酸解或酶解分析方法，該方法耗時較短， 操作簡便，并且能夠同時準(zhǔn)確反映出苷元和糖元的結(jié)構(gòu)。 四、
【附圖說明】
[0021] 圖1是實(shí)施例1-3中GC/MS分析糖苷衍生化產(chǎn)物的TIC圖（A:實(shí)施例1;B:實(shí)施 例2;C:實(shí)施例3)。 五、
【具體實(shí)施方式】
[0022] 實(shí)施例1 :
[0023] 1、稱取烤煙煙末樣品lg放入容器中，加入20mL甲醇，在超聲功率350W和超聲頻 率70kHz下超聲提取60min，取上清液過濾后，減壓蒸干溶劑得到煙草糖苷粗提物。
[0024] 2、將步驟1得到的煙草糖苷粗提物溶于10mL去離子水中，加到AmberliteXAD-2 為填料的固相萃取柱上，以〇. 5mL/min緩慢通過固相萃取柱，再依次用20mL超純水、15mL正 戊烷/二氯甲烷（2/l，v/v)洗脫，洗脫速度不超過1.0mL/min，最后用20mL甲醇洗脫，洗脫 速度為2.OmL/min，收集甲醇洗脫液，濃縮至干到煙草糖苷精提物。
[0025] 3、向煙草糖苷精提物中加入內(nèi)標(biāo)溶液lmL(2_硝基苯-0-D-葡萄糖苷的甲醇溶 液，濃度1.Omg/mL)，N2吹干，加入400yL二氯甲燒和400yL醋酸酐，密封后，50°C水浴衍 生化60min，冷卻至室溫，得到煙草糖苷衍生化產(chǎn)物。
[0026] 4、對步驟3得到的煙草糖苷衍生化產(chǎn)物進(jìn)行氣質(zhì)聯(lián)用分析：
[0027]色譜條件：色譜柱為DB-5MS柱（30m*0. 25mm*0. 25ym)，程序升溫，起始溫度 120°C，保持lmin，以 3°C/min升至 220°C，再以 5°C/min升至 280°C，保持lOmin。進(jìn)樣量 l.OyL，分流比10:1，進(jìn)樣口溫度240°C。
[0028] 質(zhì)譜條件：離子源溫度230°C，四級桿溫度150°C，離子化方式EI，電子能量70eV， 掃描模式為全掃描，質(zhì)量范圍40-600amu，色譜圖見圖1所示。苷元采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及NIST譜 庫比照定性，定量采用與內(nèi)標(biāo)2-硝基苯--D-葡萄糖苷的衍生化產(chǎn)物面積比來計算（假 定響應(yīng)系數(shù)相等）。各化合物的相對保留時間及質(zhì)譜碎片離子如表1所示。
[0029] 表1煙草糖苷衍生化產(chǎn)物的相對保留時間和質(zhì)譜碎片
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種煙草中糖苷鍵合態(tài)香味成分的測定方法，其特征在于包括以下步驟： (1)提?。簩熑~干燥粉碎后過40目篩得煙末，稱取Ig煙末放入容器中，加入20-50mL 提取溶劑，提取糖苷鍵和態(tài)香味成分，取上清液過濾后，減壓蒸干溶劑得到煙草糖苷粗提 物； ⑵分離純化：將步驟⑴得到的煙草糖苷粗提物溶于IOmL去離子水中，加到固相萃 取柱上，以0. 5mL/min的流速通過固相萃取柱；再依次用20mL超純水、15mL正戊烷/二氯甲 烷（體積比2:1)洗脫，洗脫速度彡1.0 mL/min ;最后用20mL甲醇洗脫，洗脫速度為2. OmL/ min，收集甲醇洗脫液，濃縮至干得到煙草糖苷精提物； (3) 衍生化：向步驟（2)得到的煙草糖苷精提物中加入內(nèi)標(biāo)溶液lmL，N2吹干，加入 400 y L衍生化溶劑和400 y L?；噭?，密封后于50-80 °C水浴衍生化反應(yīng)60min，冷卻至室 溫，得到煙草糖苷衍生化產(chǎn)物。 (4) 分析：對煙草糖苷衍生化產(chǎn)物進(jìn)行氣質(zhì)聯(lián)用分析。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于： 所述煙草包括烤煙、白肋煙或香料煙。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于： 步驟（1)中所述提取溶劑包括水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯或丙酮。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于： 步驟（1)中提取糖苷鍵和態(tài)香味成分采用超聲提取、震蕩提取或索氏提取。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于： 所述固相萃取柱的填料為Amberlite XAD-2、DlOl或HP-20。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于： 步驟（3)中所述內(nèi)標(biāo)溶液為2-硝基苯-0 -D-葡萄糖苷的甲醇溶液，濃度1.0 mg/mL ; 所述衍生化溶劑為二氯甲烷、丙酮或吡啶；所述酰化試劑為醋酸酐、N-甲基-二（三氟乙酰 胺）、三氟乙酸酐、五氟丙酸酐或七氟丁酸酐。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于： 步驟（4)中氣質(zhì)聯(lián)用分析的參數(shù)設(shè)置如下： 色譜條件：色譜柱為DB-5MS柱，程序升溫，起始溫度120°C，保持lmin，以3°C /min升 至220°C，再以5°C /min升至280°C，保持IOmin ;進(jìn)樣量l.OyL，分流比10:1，進(jìn)樣口溫度 240 0C ； 質(zhì)譜條件：離子源溫度230°C，四級桿溫度150°C，離子化方式EI，電子能量70eV，掃描 模式為全掃描，質(zhì)量范圍40-600amu。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種煙草中糖苷鍵合態(tài)香味成分的測定方法，是將煙葉干燥后粉碎并過篩，依次經(jīng)粗提和精提后得到煙草糖苷精提物，在煙草糖苷精提物中加入內(nèi)標(biāo)溶液，N2吹干后加入衍生化溶劑和?；噭┻M(jìn)行衍生化，得到煙草糖苷衍生化產(chǎn)物；隨后利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對煙草糖苷衍生化產(chǎn)物進(jìn)行分析。本發(fā)明不僅能對煙草中糖苷鍵合態(tài)香味成分進(jìn)行完全的提取，而且能對其進(jìn)行有效的分離和純化；同時，利用衍生化以及氣質(zhì)聯(lián)用方法分析，能夠全面、準(zhǔn)確地對煙草中糖苷鍵和態(tài)香味成分進(jìn)行定性和定量分析。
【IPC分類】G01N30-88
【公開號】CN104849393
【申請?zhí)枴緾N201510312239
【發(fā)明人】何慶, 朱棟梁, 周順, 佘世科, 張亞平, 田振峰, 陳開波
【申請人】安徽中煙工業(yè)有限責(zé)任公司
【公開日】2015年8月19日
【申請日】2015年6月9日