本發(fā)明涉及一種血滯通膠囊指紋圖譜的建立方法，還涉及所述方法建立的血滯通膠囊指紋圖譜，本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種血滯通膠囊的高效液相色譜鑒別方法，屬于血滯通膠囊的鑒別領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

血滯通膠囊為薤白經(jīng)加工制成的膠囊，內(nèi)容物為淡棕黃色顆粒及粉末，有蒜臭、味微辣；功能與主治：通陽散結(jié)，行氣導(dǎo)滯；用于高血脂癥血瘀痰阻所致的胸悶、乏力、腹脹等。

目前，血滯通膠囊標(biāo)準(zhǔn)有薄層鑒別一項(xiàng)，含量測(cè)定一項(xiàng)；含量測(cè)定項(xiàng)為結(jié)合硫含量測(cè)定項(xiàng)，然而由于含硫化合物不穩(wěn)定，因此該方法具有很大的誤差性。高效液相色譜法是測(cè)定藥物和天然產(chǎn)物中活性成分最常用的方法之一，具有快速、高效、靈敏等優(yōu)點(diǎn)。指紋圖譜是基于對(duì)中藥物質(zhì)群整體作用的認(rèn)識(shí)，借助于波譜和色譜等技術(shù)獲得中藥化學(xué)成分的光譜或色譜圖，是實(shí)現(xiàn)鑒別中藥真實(shí)性、評(píng)價(jià)質(zhì)量一致性和產(chǎn)品穩(wěn)定性的可行模式。因此，建立血滯通膠囊的指紋圖譜以及建立一種血滯通膠囊的高效液相色譜鑒別方法，對(duì)于血滯通膠囊的質(zhì)量控制，提高血滯通膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以及保障人民用藥安全等將具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供一種血滯通膠囊指紋圖譜的建立方法，該方法具有精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性良好等優(yōu)點(diǎn)；

本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是提供所述方法建立的血滯通膠囊指紋圖譜，能夠應(yīng)用于血滯通膠囊的質(zhì)量控制或質(zhì)量評(píng)價(jià)；

本發(fā)明所要解決的第三個(gè)技術(shù)問題是提供一種血滯通膠囊的高效液相色譜鑒別方法，該方法采用高效液相色譜法定性檢測(cè)血滯通膠囊中的有效成份腺苷、紫丁香苷，實(shí)現(xiàn)對(duì)待檢測(cè)血滯通膠囊的質(zhì)量鑒別。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

本發(fā)明首先公開了一種血滯通膠囊指紋圖譜的建立方法，包括以下步驟：(1)將血滯通膠囊內(nèi)容物加入提取溶劑進(jìn)行提取，得到提取液，純化，得到供試品溶液；(2)將供試品溶液進(jìn)行高效液相色譜分析，獲得高效液相色譜圖；(3)從高效液相色譜圖的色譜峰中選擇共有峰，得到血滯通膠囊指紋圖譜。

其中，步驟(2)所述高效液相色譜分析的色譜條件包括：色譜柱為graceapolloc18色譜柱，規(guī)格為4.6mm×250mm，5μm；十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相a為水，b為甲醇，進(jìn)行梯度洗脫；流速為0.8ml/min；柱溫為25-45℃；進(jìn)樣量為5-20μl；檢測(cè)波長為220-320nm；優(yōu)選的，柱溫為40℃；進(jìn)樣量為10μl；檢測(cè)波長為220nm。理論板數(shù)按紫丁香苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。所述梯度洗脫的程序包括：按體積百分比計(jì)，0-15min，a：95→85％，b：5→15％；15-20min，a：85→80％，b：15→20％；20-30min，a：80→60％，b：20→40％；30-45min，a：60→55％，b：40→45％；45-50min，a：55→95％，b：45→5％。

步驟(1)按照體積百分比計(jì)，所述提取溶劑選自30％甲醇、50％甲醇、甲醇、50％乙醇或乙醇中的任意一種；優(yōu)選為50％甲醇；進(jìn)一步優(yōu)選的，按照g/ml計(jì)，血滯通膠囊內(nèi)容物：50％甲醇＝2：50；所述提取的方式為超聲提取30分鐘；其中，所述超聲的功率為250w，頻率為40khz。

步驟(1)所述純化采用中性氧化鋁柱層析；優(yōu)選的，所述純化包括：將提取液濾過，取續(xù)濾液，蒸干；將蒸干后得到的殘?jiān)?0％甲醇(體積百分比，下同)溶解，分多次加在中性氧化鋁柱上，用50％甲醇洗脫，收集流出液及洗脫液，蒸干；將蒸干后得到的殘?jiān)?0％甲醇溶解，即得；優(yōu)選為，取續(xù)濾液10ml，蒸干后的殘?jiān)?0％甲醇約5ml溶解，分多次加在中性氧化鋁柱上，用50％甲醇90ml洗脫。其中，所述中性氧化鋁柱的內(nèi)徑為1cm；所述中性氧化鋁的粒度為100-200目，用量為4g。

步驟(3)所述共有峰的選擇包括：從多批供試品溶液高效液相色譜圖中(其中，所述多批≥15批)，在12min-45min時(shí)間區(qū)間內(nèi)選擇峰面積較大的主要色譜峰-四個(gè)色譜峰作為共有峰，分別標(biāo)記為峰1、峰2、峰3及峰4；以紫丁香苷峰即峰3為標(biāo)準(zhǔn)峰，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間為：峰1的相對(duì)保留時(shí)間為0.515-0.593、峰2的相對(duì)保留時(shí)間為0.735-0.845、峰3的相對(duì)保留時(shí)間為1.000、峰4的相對(duì)保留時(shí)間為1.168-1.344。各共有峰相對(duì)保留時(shí)間應(yīng)在規(guī)定值的范圍內(nèi)。

本發(fā)明通過將供試品溶液色譜圖中色譜峰的保留時(shí)間與紫丁香苷、腺苷對(duì)照品對(duì)照，確定峰1為腺苷的色譜峰，峰3為紫丁香苷的色譜峰。

本發(fā)明進(jìn)一步公開了所述方法建立的血滯通膠囊指紋圖譜；優(yōu)選的，所述血滯通膠囊指紋圖譜如圖15所示。

本發(fā)明所建立的血滯通膠囊指紋圖譜專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好，在血滯通膠囊的質(zhì)量控制或質(zhì)量評(píng)價(jià)中具有重要應(yīng)用前景。

建立指紋圖譜的色譜條件對(duì)于獲取足以代表品種特征以及信息量足夠的指紋圖譜是關(guān)鍵性的。本發(fā)明對(duì)血滯通膠囊的液相色譜條件，包括色譜柱、流動(dòng)相、檢測(cè)波長、柱溫、進(jìn)樣量以及供試品溶液制備條件等分別進(jìn)行了優(yōu)化篩選。色譜柱優(yōu)化結(jié)果表明，在其它色譜條件相同的情況下，與agilentc18或shiseidoc18色譜柱相比，在graceapolloc18(4.6mm×250mm5μm)色譜柱中，各峰分離完全、分布較均勻，保留時(shí)間適中，整體指紋性好。檢測(cè)波長優(yōu)化結(jié)果表明，在220nm-320nm多波長范圍內(nèi)，在220nm處采集的色譜圖，各峰比例適中，整體指紋性好。流動(dòng)相優(yōu)化結(jié)果表明，采用a：水，b：甲醇為流動(dòng)相系統(tǒng)，洗脫程序?yàn)椋?-15min，a:95→85％；15-20min，a:85→80％；20-30min，a:80→60％；30-45min，a:60→55％；45-50min，a:55→95％，色譜圖上各主要色譜峰分離度好，保留時(shí)間適中，且能保證所有成分色譜峰在50分鐘內(nèi)全部出完。柱溫優(yōu)化結(jié)果表明，25-45℃范圍內(nèi)，以在40℃條件下各峰分離效果最好，且柱壓低。進(jìn)樣量對(duì)指紋圖譜的結(jié)果影響不大，加大進(jìn)樣量，可以減弱梯度洗脫時(shí)基線漂移的程度；但是進(jìn)樣量過大，色譜柱超載，可導(dǎo)致色譜峰寬增加或色譜峰尖鈍化，并影響柱的壽命；實(shí)驗(yàn)確定，血滯通膠囊供試品溶液的進(jìn)樣量在5-20μl之間即可。指紋圖譜時(shí)間段選擇結(jié)果表明，12min以前由于溶劑峰影響指紋性不強(qiáng)，另外由于流動(dòng)相梯度的影響供試品色譜峰在45min以前，指紋性較強(qiáng)的特征峰均已流出，由于流動(dòng)相梯度的影響，45min后基線不穩(wěn)定，所以截取12-45min時(shí)間段作為供試品的指紋區(qū)間。在供試品溶液的制備中，本發(fā)明選擇50％甲醇為提取溶劑的色譜峰峰面積最大，提取效率最好，整體圖貌最佳；提取方式采取一次超聲提取30分鐘即可提取完全，而且操作較加熱回流提取更方便；對(duì)供試品溶液的純化采用中性氧化鋁柱層析，即可使基線平穩(wěn)，又能去除極性較小的雜質(zhì)，指紋性最佳。

精密度試驗(yàn)結(jié)果表明，同一份血滯通膠囊樣品連續(xù)進(jìn)樣6次，以3號(hào)紫丁香苷為參比峰，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積的rsd均小于3％。用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》軟件評(píng)價(jià)及計(jì)算，精密度試驗(yàn)相似度為0.9以上。

穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，血滯通膠囊樣品供試品溶液在12小時(shí)內(nèi)通過hplc分析結(jié)果穩(wěn)定，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的rsd均小于1％，相對(duì)峰面積比值的rsd小于3％。用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》軟件計(jì)算，穩(wěn)定性試驗(yàn)相似度為0.7以上。結(jié)果表明，室溫保存下12小時(shí)內(nèi)血滯通樣品供試品溶液的穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表明，6份血滯通膠囊供試品進(jìn)樣的相對(duì)保留時(shí)間rsd均小于1％，相對(duì)峰面積比值的rsd均小于3％，表明本發(fā)明方法的重現(xiàn)性良好。用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》軟件計(jì)算，重復(fù)性試驗(yàn)相似度結(jié)果均大于0.9。

本發(fā)明還公開了一種血滯通膠囊的高效液相色譜鑒別方法，包括以下步驟：(1)將待檢測(cè)血滯通膠囊內(nèi)容物加入提取溶劑進(jìn)行提取，得到提取液，純化，得到供試品溶液；(2)取腺苷和紫丁香苷對(duì)照品，分別制備對(duì)照品溶液；(3)將供試品溶液與對(duì)照品溶液分別進(jìn)行高效液相色譜分析，如果供試品溶液的高效液相色譜圖中同時(shí)出現(xiàn)與腺苷、紫丁香苷對(duì)照品保留時(shí)間一致的色譜峰，則判定待檢測(cè)血滯通膠囊的質(zhì)量合格。

其中，步驟(3)所述高效液相色譜分析的色譜條件包括：色譜柱為graceapolloc18色譜柱，規(guī)格為4.6mm×250mm，5μm；十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相a為水，b為甲醇，進(jìn)行梯度洗脫；流速為0.8ml/min；柱溫為40℃；進(jìn)樣量為10μl；檢測(cè)波長為220nm；理論板數(shù)按紫丁香苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。所述梯度洗脫的程序包括：按體積百分比計(jì)，0-15min，a：95→85％，b：5→15％；15-20min，a：85→80％，b：15→20％；20-30min，a：80→60％，b：20→40％；30-45min，a：60→55％，b：40→45％；45-50min，a：55→95％，b：45→5％；

按照體積百分比計(jì)，步驟(1)所述提取溶劑選自30％甲醇、50％甲醇、甲醇、50％乙醇或乙醇中的任意一種；優(yōu)選為50％甲醇；進(jìn)一步優(yōu)選的，按照g/ml計(jì)，血滯通膠囊內(nèi)容物：50％甲醇＝2：50；所述提取的方式為超聲提取30分鐘；其中，所述超聲的功率為250w，頻率為40khz。所述純化采用中性氧化鋁柱層析；優(yōu)選的，所述純化包括：將提取液濾過，取續(xù)濾液，蒸干；將蒸干后得到的殘?jiān)?0％甲醇(體積百分比，下同)溶解，分多次加在中性氧化鋁柱上，用50％甲醇洗脫，收集流出液及洗脫液，蒸干；將蒸干后得到的殘?jiān)?0％甲醇溶解，即得；優(yōu)選為，取續(xù)濾液10ml，蒸干后的殘?jiān)?0％甲醇約5ml溶解，分多次加在中性氧化鋁柱上，用50％甲醇90ml洗脫。其中，所述中性氧化鋁柱的內(nèi)徑1cm，中性氧化鋁的粒度為100-200目，用量為4g。

步驟(2)所述對(duì)照品溶液的制備包括：將腺苷和紫丁香苷對(duì)照品分別用50％甲醇溶解，使每1ml對(duì)照品溶液中含腺苷或紫丁香苷20μg。步驟(3)根據(jù)供試品溶液的高效液相色譜圖中出現(xiàn)與腺苷對(duì)照品保留時(shí)間一致(rsd＜3％，優(yōu)選為rsd＜1％)的色譜峰，并且同時(shí)出現(xiàn)與紫丁香苷對(duì)照品保留時(shí)間一致(rsd＜3％，優(yōu)選為rsd＜1％)的色譜峰，判定待檢測(cè)血滯通膠囊的質(zhì)量合格；反之，則判定待檢測(cè)血滯通膠囊的質(zhì)量不合格。

本發(fā)明所述的高效液相色譜鑒別方法的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性及耐用性良好，輔料均沒有干擾峰。供試品高效液相色譜圖中均出現(xiàn)與腺苷、紫丁香苷對(duì)照品相應(yīng)保留時(shí)間的色譜峰，重現(xiàn)性好、專屬性強(qiáng)。由高效液相的純度分析可知，在供試品溶液與對(duì)照品溶液的高效液相色譜圖中，與腺苷及紫丁香苷對(duì)照品相對(duì)應(yīng)色譜峰的紫外吸收?qǐng)D一致，并且在相應(yīng)保留時(shí)間處的色譜峰純度均達(dá)100％，說明本發(fā)明液相條件分離度良好。因此，本發(fā)明血滯通膠囊的高效液相色譜鑒別方法，能夠用于血滯通膠囊的質(zhì)量控制。

本發(fā)明技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果：

本發(fā)明采用高效液相色譜法建立了血滯通膠囊的指紋圖譜，該方法的精密度、穩(wěn)定性及重復(fù)性良好。本發(fā)明所建立的血滯通膠囊指紋圖譜，相似度高、穩(wěn)定性好。本發(fā)明進(jìn)一步建立了一種血滯通膠囊的高效液相色譜鑒別方法，該方法能夠準(zhǔn)確鑒別血滯通膠囊產(chǎn)品中腺苷、紫丁香苷二種有效成份。本發(fā)明所建立的血滯通膠囊指紋圖譜及高效液相色譜鑒別方法，在血滯通膠囊的質(zhì)量控制等方面將具有重要應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為采用agilentc18(5μm,250×4.6mm)色譜柱的高效液相色譜圖；

圖2為采用graceapolloc18(5μm,250×4.6mm)色譜柱的高效液相色譜圖；

圖3為采用shiseidoc18(5μm,250×4.6mm)色譜柱的高效液相色譜圖；

圖4為血滯通膠囊供試品3d指紋圖譜；

圖5為波長220nm血滯通膠囊供試品高效液相色譜圖；

圖6為波長230nm血滯通膠囊供試品高效液相色譜圖；

圖7為波長254nm血滯通膠囊供試品高效液相色譜圖；

圖8為波長265nm血滯通膠囊供試品高效液相色譜圖；

圖9為波長290nm血滯通膠囊供試品高效液相色譜圖；

圖10為波長320nm血滯通樣品高效液相色譜圖；

圖11為流動(dòng)相條件①分離結(jié)果；

圖12為流動(dòng)相條件②分離結(jié)果；

圖13為流動(dòng)相條件③分離結(jié)果；

圖14為流動(dòng)相條件④分離結(jié)果；

圖15為血滯通膠囊指紋圖譜；其中，1、2、3、4為共有峰；

圖16為腺苷對(duì)照品色譜峰；

圖17為紫丁香苷對(duì)照品色譜峰；

圖18為血滯通膠囊精密度試驗(yàn)全譜相似度評(píng)價(jià)；

圖19為血滯通膠囊穩(wěn)定性試驗(yàn)全譜相似度評(píng)價(jià)；

圖20為血滯通膠囊重復(fù)性試驗(yàn)全譜相似度評(píng)價(jià)；

圖21為腺苷、紫丁香苷對(duì)照品溶液的高效液相色譜圖；

圖22為血滯通膠囊供試品溶液的高效液相色譜圖；

圖23為血滯通膠囊陰性對(duì)照品溶液的高效液相色譜圖；

圖24為對(duì)照品溶液高效液相色譜圖中腺苷峰的純度分析；

圖25為對(duì)照品溶液高效液相色譜圖中紫丁香苷峰的純度分析；

圖26為血滯通膠囊供試品溶液高效液相色譜圖中腺苷峰的純度分析；

圖27為血滯通膠囊供試品溶液高效液相色譜圖中紫丁香苷峰的純度分析；

圖28為50％甲醇超聲樣品色譜圖；

圖29為c18預(yù)制小柱純化樣品色譜圖；

圖30為d101大孔樹脂純化樣品色譜圖；

圖31為中性氧化鋁柱純化樣品色譜圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是范例性的，不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1血滯通膠囊指紋圖譜的建立

1、實(shí)驗(yàn)材料

1.1樣品

血滯通膠囊由吉林省東方制藥有限公司提供，共20批，批號(hào)分別為：20120804、20120810、20120903、20120906、20120907、20130102、20130103、20130104、20130105、20130706、20130707、20130902、20140408、20140409、20140410、20150101、20150502、20150503、20150603、20150604。薤白藥材4批，批號(hào)分別為：yz-31-150501、yz-31-141101、yz-31-140901、yz-31-140801。中間體4批，批號(hào)分別為：20150514、20150601、20150602、20150603。

1.2儀器與試劑

1.2.1儀器

島津lc-20at高效液相色譜儀，lc-solution工作站(日本島津)。中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件2.0版；agilent1200series高效液相色譜儀，agilentchemstation色譜工作站(美國安捷倫)。kq－200超聲波清洗儀(昆山舒美)。

1.2.2色譜柱

agilentc18(5μm,250×4.6mm)；

graceapolloc18(5μm,250×4.6mm)；

shiseidoc18(5μm,250×4.6mm)。

保護(hù)柱：autosciencec18。

1.2.3試劑

甲醇(fisher，色譜純)；水(超純水)；甲醇(優(yōu)級(jí)純，北京化工廠)；乙醇(優(yōu)級(jí)純，北京化工廠)；100－200目中性氧化鋁層析用(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

2、供試溶液的制備

2.1供試品溶液的制備

取裝量差異項(xiàng)下的本品內(nèi)容物，研勻，精密稱取約2g，置具塞錐形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，密塞，稱定重量，超聲處理30分鐘(功率250w，頻率40khz)，放冷，濾過，取續(xù)濾液10ml，蒸干，殘?jiān)?0％甲醇約5ml分多次加在中性氧化鋁柱(100-200目，4g，內(nèi)徑1cm)上，用50％甲醇90ml洗脫，收集流出液及洗脫液，蒸干，殘?jiān)?0％甲醇定容至2ml量瓶中，搖勻，即得。

2.2參照物溶液的制備

血滯通膠囊樣品經(jīng)hplc分析出現(xiàn)多個(gè)色譜峰，以腺苷、紫丁香苷為主要成分。因紫丁香苷積分面積在指紋圖譜中所占的比例較大且相對(duì)穩(wěn)定，因此選定紫丁香苷作為參照物。制備方法如下：

取腺苷、紫丁香苷對(duì)照品適量，精密稱定，分別加50％甲醇制成每1ml含腺苷、紫丁香苷20μg的溶液，即得。

3、色譜試驗(yàn)條件

色譜實(shí)驗(yàn)條件選擇的目的是通過比較實(shí)驗(yàn)，從中選取相對(duì)簡單易行的方法和條件，獲取足以代表品種特征以及信息量足夠的指紋圖譜，以滿足指紋圖譜的專屬性、重現(xiàn)性和普遍適用性的要求。其中，指紋圖譜的色譜條件是研究檢測(cè)方法過程中最重要、關(guān)鍵性的內(nèi)容。

3.1色譜柱的選擇

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，血滯通膠囊的原料薤白藥材中主要含有甾體皂苷、氮類化合物、揮發(fā)油等，其中紫丁香苷、腺苷等是其主要的活性成分。根據(jù)其理化性質(zhì)，其指紋圖譜檢測(cè)采用反相高效液相色譜法。由于不同生產(chǎn)廠家不同牌號(hào)的色譜柱因選用的硅膠原料、鍵合條件、封尾情況等的差異，致使在性能上互有差異，因此需要通過實(shí)驗(yàn)比較，選擇合適的色譜柱。

色譜條件：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相a為水，b為甲醇，按表2程序進(jìn)行梯度洗脫，流速為0.8ml/min；柱溫為40℃；進(jìn)樣量為10μl；檢測(cè)波長為220nm。

試驗(yàn)中在其它色譜條件相同的情況下，分別采用以下色譜柱：agilentc18(5μm,250×4.6mm)，graceapolloc18(5μm,250×4.6mm)，shiseidoc18(5μm,250×4.6mm)。

供試品溶液應(yīng)用不同色譜柱的檢測(cè)結(jié)果見圖1、圖2和圖3。試驗(yàn)結(jié)果表明，在graceapolloc18(4.6mm×250mm5μm)色譜柱中，各峰分離完全、分布較均勻，保留時(shí)間適中，整體指紋性好。因此，本發(fā)明確定選用graceapolloc18(4.6mm×250mm5μm)色譜柱。

3.2檢測(cè)波長的選擇

文獻(xiàn)報(bào)道的檢測(cè)波長常常是含量測(cè)定時(shí)某一特定成分的測(cè)定波長，不一定完全適合指紋圖譜的需要。為了獲取多層次的信息，需要選擇數(shù)個(gè)不同的檢測(cè)波長，為此，本發(fā)明在實(shí)驗(yàn)中在全波長檢測(cè)獲得3d指紋圖譜(見圖4)。同時(shí)選定了220nm、230nm、254nm、265nm、290nm、320nm多波長進(jìn)行檢測(cè)(色譜條件同3.1)，結(jié)果見圖5-圖10。

試驗(yàn)結(jié)果表明，在220nm處采集的色譜圖，各峰比例適中，整體指紋性好，因此本發(fā)明選定220nm為檢測(cè)波長。

3.3流動(dòng)相的選擇

為使各成分分離完全，相對(duì)保留時(shí)間穩(wěn)定，出峰時(shí)間縮短，確定采用二元低壓梯度洗脫，以①a：0.1％磷酸溶液；b：乙腈為流動(dòng)相系統(tǒng)：流動(dòng)相b：10～85％，60分鐘線性梯度洗脫。②a：0.1％磷酸溶液；b：甲醇為流動(dòng)相系統(tǒng)：流動(dòng)相b：20～80％：40分鐘線性梯度洗脫；③a：水；b：乙腈為流動(dòng)相系統(tǒng)：15～22％，0-30min；22～50％，30-35min；50～85％，35-60min。④a：水；b：甲醇為流動(dòng)相系統(tǒng)：0～15min，a:95→85％；15～20min，a:85→80％；20～30min，a:80→60％；30～45min，a:60→55％；45～50min，a:55→95％；50～55min，a:45→5％梯度洗脫(上述百分含量均為體積百分比，其它色譜條件同3.1)。結(jié)果見圖11－圖14。

從上述結(jié)果可見，采用④流動(dòng)相系統(tǒng)譜圖上各主要色譜峰分離度好，保留時(shí)間適中，且能保證所有成分色譜峰在50分鐘內(nèi)全部出完，因此確定④為本法流動(dòng)相。

3.4柱溫的選擇

柱溫的選擇與恒定是指紋圖譜技術(shù)穩(wěn)定的影響因素之一。適宜的柱溫不僅影響色譜峰的分離效果，而且柱溫發(fā)生變化將導(dǎo)致色譜峰保留時(shí)間的遷移，技術(shù)參數(shù)的設(shè)置就失去了意義，因此柱溫必須限定。而且，在分離效果相同時(shí)，應(yīng)盡可能選定低溫，以延長色譜柱填料的壽命。為此，在實(shí)驗(yàn)中分別設(shè)定柱溫25℃、30℃、40℃、45℃。結(jié)果表明，在其他色譜條件相同的情況下(其它色譜條件同3.1)，以在40℃條件下，各峰分離效果最好，且柱壓低。因此，確定柱溫40℃。

3.5進(jìn)樣量的選擇

進(jìn)樣量對(duì)指紋圖譜的結(jié)果影響不大，但加大進(jìn)樣量，可以減弱梯度洗脫時(shí)基線漂移的程度；但是色譜柱的載樣量有一定的限度，進(jìn)樣量過大，色譜柱超載，可導(dǎo)致色譜峰寬增加或色譜峰尖鈍化，并影響柱的壽命。經(jīng)實(shí)驗(yàn)，血滯通膠囊供試品溶液進(jìn)樣量在5～20μl之間即可。

3.6指紋圖譜時(shí)間段選擇

12min以前由于溶劑峰影響指紋性不強(qiáng)，另外由于流動(dòng)相梯度的影響，供試品色譜峰在45min以前，指紋性較強(qiáng)的特征峰均已流出，由于流動(dòng)相梯度的影響45min后基線不穩(wěn)定，所以截取12－45min時(shí)間段作為供批品的指紋區(qū)間。

3.7指紋圖譜峰歸屬及s峰的確認(rèn)

分別稱取紫丁香苷、腺苷對(duì)照品適量，配成對(duì)照品溶液，按照上述色譜條件(色譜條件同3.1)，注入液相色譜儀，通過保留時(shí)間確定供試品中標(biāo)準(zhǔn)色譜峰歸屬。

本發(fā)明按照上述優(yōu)化的色譜條件，對(duì)18批血滯通膠囊樣品建立了hplc圖譜，通過從18批血滯通膠囊樣品圖譜中篩查共性的色譜峰，本發(fā)明在12min-45min時(shí)間區(qū)間內(nèi)，選擇峰面積較大的主要色譜峰-四個(gè)色譜峰作為共有峰，分別標(biāo)記為峰1、峰2、峰3及峰4。

由色譜圖中的色譜峰保留時(shí)間可知，峰1為腺苷的色譜峰，峰3為紫丁香苷的色譜峰。由于紫丁香苷峰面積占總峰面積比值較大，并且是血滯通膠囊中活血、降脂的主要活性成分，故將峰3(紫丁香苷色譜峰)作為標(biāo)準(zhǔn)峰s。18批血滯通膠囊樣品圖譜在12min-45min時(shí)間內(nèi)4個(gè)特征峰的相對(duì)保留時(shí)間見表1。

本發(fā)明由圖得到，以紫丁香苷峰為標(biāo)準(zhǔn)峰，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間為：峰1為0.515-0.593、峰2為0.735-0.845、峰3為1.000、峰4為1.168-1.344。各共有峰相對(duì)保留時(shí)間應(yīng)在規(guī)定值的范圍內(nèi)。

本發(fā)明所建立的血滯通膠囊指紋圖譜見圖15，腺苷及紫丁香苷對(duì)照品色譜圖見圖16-17。

表118批血滯通膠囊樣品圖譜中各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間

3.8色譜條件的建立

綜上，本發(fā)明確定血滯通膠囊hplc指紋圖譜的色譜條件為：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(色譜柱：graceapolloc184.6mm×250mm5μm)；流動(dòng)相a為水，b為甲醇，按下表程序(表2)進(jìn)行梯度洗脫，流速為0.8ml/min；柱溫為40℃；進(jìn)樣量為10μl；檢測(cè)波長為220nm。理論板數(shù)按紫丁香苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

表2洗脫程序(體積比)

4、方法學(xué)驗(yàn)證

4.1精密度試驗(yàn)

取同一份血滯通膠囊樣品(批號(hào)：20150501)，按照上述供試品制備方法制備供試品溶液，按上述色譜條件注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，以3號(hào)紫丁香苷為參比峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，及它們的rsd。結(jié)果見表3、4。用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》軟件計(jì)算精密度試驗(yàn)的相似度，結(jié)果見圖18和表5。

表3血滯通膠囊精密度試驗(yàn)(相對(duì)保留時(shí)間)

表4血滯通膠囊精密度試驗(yàn)(相對(duì)峰面積比值)

結(jié)果顯示，精密度實(shí)驗(yàn)中各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積的rsd均小于3％，表明儀器等整個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)的精密度良好。用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》軟件評(píng)價(jià)及計(jì)算，精密度試驗(yàn)相似度為0.9以上。

表5血滯通膠囊精密度試驗(yàn)相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

4.2穩(wěn)定性試驗(yàn)

取血滯通樣品(批號(hào)：20150503)，按照上述供試品溶液制備方法以及色譜條件，每隔一定時(shí)間測(cè)定一次，考察相對(duì)峰面積比值及相對(duì)保留時(shí)間的穩(wěn)定性，結(jié)果見表6、表7。

結(jié)果顯示，血滯通樣品供試品溶液在12小時(shí)內(nèi)通過hplc分析結(jié)果穩(wěn)定，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的rsd均小于1％；相對(duì)峰面積比值的rsd小于3％。用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》軟件計(jì)算，穩(wěn)定性試驗(yàn)相似度為0.7以上(表8、圖19)。結(jié)果表明，室溫保存下12小時(shí)內(nèi)血滯通樣品供試品溶液穩(wěn)定性良好。

表6血滯通樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)(相對(duì)保留時(shí)間)

表7血滯通樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)(相對(duì)峰面積比值)

表8血滯通膠囊穩(wěn)定性試驗(yàn)相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

4.3重復(fù)性試驗(yàn)

取血滯通膠囊樣品(批號(hào)：20150501)六份，按照上述色譜條件與方法，分別制備供試品溶液，進(jìn)樣，考察標(biāo)準(zhǔn)峰相對(duì)峰面積比值及相對(duì)保留時(shí)間的重復(fù)性，結(jié)果見表9，10。結(jié)果表明，6份供試品中相對(duì)保留時(shí)間rsd均小于1％，及相對(duì)峰面積比值的rsd均小于3％，表明方法的重現(xiàn)性良好。

表9血滯通膠囊重復(fù)性試驗(yàn)(相對(duì)保留時(shí)間)

表10血滯通膠囊重復(fù)性試驗(yàn)(相對(duì)峰面積比值)

用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》軟件計(jì)算，重復(fù)性試驗(yàn)相似度結(jié)果均大于0.9(表11、圖20)。

表11血滯通膠囊重復(fù)性試驗(yàn)相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

5、血滯通樣品指紋圖譜相似度分析結(jié)果

選用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》軟件2.0版計(jì)算，對(duì)20批血滯通膠囊樣品指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià)結(jié)果表明，相似度在0.74以上，相似度較高。

實(shí)施例2血滯通膠囊的高效液相色譜鑒別

1、實(shí)驗(yàn)材料同實(shí)施例1指紋圖譜研究。

2、供試溶液的制備同實(shí)施例1指紋圖譜研究。

3、色譜實(shí)驗(yàn)條件同實(shí)施例1指紋圖譜研究。

4、供試品制備條件的篩選同實(shí)驗(yàn)例1。

5、方法學(xué)驗(yàn)證

5.1精密度試驗(yàn)：同實(shí)施例1指紋圖譜研究。

5.2.穩(wěn)定性試驗(yàn)：同實(shí)施例1指紋圖譜研究。

5.3重復(fù)性試驗(yàn)：同實(shí)施例1指紋圖譜研究。

5.4專屬性試驗(yàn)

血滯通膠囊處方中只含有薤白一味藥材，其它均為輔料，按樣品及供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液，在此色譜條件下，輔料均沒有干擾峰，具體見圖21-23。

6、高效液相色譜圖鑒別的建立

按照實(shí)施例1所述的供試品溶液制備方法及色譜條件，取15批血滯通膠囊樣品進(jìn)行測(cè)定。以腺苷、紫丁香苷對(duì)照品為參照物，按樣品制法及供試品溶液的制備方法制成不含薤白藥材的陰性對(duì)照溶液，對(duì)照品及供試品的高效液相色譜圖中腺苷、紫丁香苷峰保留時(shí)間結(jié)果見表12。對(duì)照品、供試品及陰性對(duì)照品的高效液相色譜圖見圖21-23，對(duì)照品溶液及血滯通膠囊供試品溶液高效液相色譜圖中腺苷及紫丁香苷峰純度分析圖見圖24-27。

表1215批樣品保留時(shí)間

由以上結(jié)果可知，供試品高效液相色譜圖中均出現(xiàn)與腺苷、紫丁香苷對(duì)照品相應(yīng)保留時(shí)間的色譜峰，重現(xiàn)性好、專屬性強(qiáng)。由高效液相的純度分析可知，在供試品溶液與對(duì)照品溶液的高效液相色譜圖中與腺苷及紫丁香苷對(duì)照品相對(duì)應(yīng)色譜峰的紫外吸收?qǐng)D一致，并且在相應(yīng)保留時(shí)間處的色譜峰純度均達(dá)100％，說明該液相條件分離度良好，因此該液相鑒別能夠作為血滯通膠囊的高效液相色譜鑒別。

實(shí)驗(yàn)例1血滯通膠囊指紋圖譜建立中供試品制備條件的篩選

1、提取溶劑的選擇

本發(fā)明分別選擇了30％甲醇、50％甲醇、甲醇、50％乙醇及乙醇(均為體積百分比)對(duì)血滯通膠囊進(jìn)行提取，對(duì)比hplc色譜峰(供試溶液制備的其他參數(shù)以及色譜實(shí)驗(yàn)條件均同實(shí)施例1)。結(jié)果表明(圖28)，50％甲醇作為提取溶劑的色譜峰峰面積最大，提取效率最好，整體圖貌最佳。故本發(fā)明選擇50％甲醇作為血滯通膠囊的提取溶劑。

2、提取方式的選擇

本發(fā)明分別超聲提取30分鐘1次，超聲提取30分鐘2次(功率250w，頻率40khz)和加熱回流提取1小時(shí)制備供試液，按上述實(shí)施例1已建立的色譜條件進(jìn)樣。對(duì)比結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超聲提取與加熱回流提取的提取效率相差不大，且一次超聲提取30分鐘即可提取完全。因此，考慮操作的方便性，本發(fā)明選擇一次超聲提取30分鐘作為血滯通膠囊供試液制備的提取方式。

3、供試品純化方法的選擇

因血滯通膠囊的工藝中采用了乙醇滲漉的提取方式，成分中含有大量極性小的雜質(zhì)。用50％甲醇超聲提取時(shí)，雖然紫丁香苷峰可以較好的分離，但是雜質(zhì)較多，高效液相圖譜的基線很不穩(wěn)定(見圖28)。根據(jù)雜質(zhì)的理化性質(zhì)，本發(fā)明采用了c18預(yù)制小柱、d101大孔樹脂及中性氧化鋁方法對(duì)供試品溶液進(jìn)行了純化(見圖29-31)。色譜結(jié)果表明，c18預(yù)制小柱雖然基線較好，但相關(guān)峰均減少，指紋性不強(qiáng)；大孔樹脂柱對(duì)紫丁香苷峰吸附過多；中性氧化鋁柱即可使基線平穩(wěn)，又能去除極性較小的雜質(zhì)，指紋性最佳。因此，本發(fā)明采用中性氧化鋁柱層析對(duì)供試品溶液進(jìn)行純化。

4、供試品制備條件的建立

綜上所述，本發(fā)明建立血滯通膠囊hplc指紋圖譜的供試液制備條件為：

取裝量差異項(xiàng)下的本品內(nèi)容物，研勻，精密稱取約2g，置具塞錐形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，密塞，稱定重量，超聲處理30分鐘(功率250w，頻率40khz)，放冷，濾過，取續(xù)濾液10ml，蒸干，殘?jiān)?0％甲醇約5ml分多次加在中性氧化鋁柱(100-200目，4g，內(nèi)徑1cm)上，用50％甲醇90ml洗脫，收集流出液及洗脫液，蒸干，殘?jiān)?0％甲醇定容至2ml量瓶中，搖勻，即得。